一种抗犬细小病毒鼠-犬嵌合抗体、表达其的细胞系、制备的药物制剂及其应用的制作方法

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种抗犬细小病毒鼠-犬嵌合抗体、表达其的细胞系、制备的药物制剂及其应用。

背景技术：

1、犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus,cpv)引起的能够感染多种动物，尤其是犬科动物的一种传染性疾病。被cpv感染的狗会出现沉郁、出血性肠胃炎、呕吐、发烧和腹泻等症状，如不及时进行治疗可能会导致死亡。cpv可通过粪便-口鼻传播，甚至可以在粪便中保持感染性长达6个月之久。

2、cpv作为严重威胁犬健康的病原体之一，现已有对其进行预防和治疗的商品化鼠源单克隆抗体。鼠源单克隆抗体有强大的特异性、高效性和稳定性，但是也容易使异源动物产生免疫排斥反应。

3、因此，临床上亟需一种特异性好、高效、稳定，且没有免疫排斥的犬细小病毒单克隆抗体，用于犬细小病毒的治疗。

技术实现思路

1、为此，本发明利用cho表达系统发明了一种抗体恒定区为犬源fc段的抗体，用以消除犬对鼠源fc段的免疫排斥反应。

2、本发明还提供所述抗犬细小病毒鼠/犬嵌合抗体的制备方法。

3、本发明还涉及治疗犬细小病毒感染的药物制剂。

4、本发明还涉及治疗犬细小病毒感染的同时，快速降低排毒的药物制剂。

5、本发明还提供所述抗犬细小病毒鼠/犬嵌合抗体的应用，所述应用是指在制备治疗犬细小病毒感染的药物中的应用。

6、具体实施方式

7、以下，对本发明的实施方式进行说明。

8、定义

9、术语“犬细小病毒”(canine parvovirus，cpv)属于细小病毒科(parvoviridae)细小病毒属(parvovirus)，是dna病毒中分子量最小的病毒，可感染犬、貂、狐狸犬科动物和鼠鼬科动物、猫，以幼犬最为易感，临床症状以呕吐、腹泻和白细胞减少为主要特征，发病率和死亡率比较高。

10、术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

11、术语“嵌合抗体”又称嵌合型抗体，是利用dna重组技术，将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有亲本抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出嵌合抗体。这样产生的抗体，减少了异源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。

12、术语“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如igg、ige、igm、igd和iga)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如fab、scfv、fv、dab、fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在ep.a.0120694和ep.a.0125023中描述。

13、术语“抗体”可以通过许多方式修饰，可用dna重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(cdrs)的dna引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，ep.a.184187，gb2188638a或ep.a.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。

14、术语“中和抗体”在本文以最广义使用，指的是抑制犬细小病毒重复感染靶细胞的任何抗体，而不管实现中和的机制。因而，举例来说，可通过抑制病毒附着或粘附到细胞表面来实现中和，例如通过设计抗体，所述抗体直接结合到，或者接近于，负责病毒附着或粘附的位点，还可以通过定向到病毒体(virion)表面的抗体来实现中和，其导致病毒体的聚集，可通过抑制病毒附着到靶细胞以后病毒和细胞膜融合，通过抑制胞吞作用(endocytosis)抑制来自受感染的子代病毒等，进一步发生中和。本发明的中和抗体不受限于实现中和的机制。

15、术语“免疫量”当理解为“预防有效量”时，是指能够在接种的个体中足以引发免疫保护反应的量。本领域技术人员知晓，所述“预防有效量”随免疫接种的方式、时机、给药对象以及所述单克隆抗体或其片段的不同而不同，结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规范，本领域技术人员应当能够通过有限的试验得出所用单克隆抗体的“预防有效量”。

16、术语“免疫量”当理解为“治疗有效量”时，是指能够对受试个体产生有效保护以及中和病毒的量。本领域技术人员知晓，所述“治疗有效量”随治疗方案、病程、治疗对象的状况以及所用单克隆抗体或其片段的不同而不同。结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规程，临床技术人员应当能够凭借其经验得出所用单克隆抗体的“治疗有效量”。

17、术语“药学上可接受的载体”是指不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂。

18、术语“预防和/或治疗”在涉及犬细小病毒感染时是指抑制犬细小病毒的复制、抑制犬细小病毒的传播或防止犬细小病毒在其宿主体内定居，以及减轻犬细小病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

19、术语“缓冲液”意指药学可接受缓冲液。如本文中所使用的，通过其酸/碱共轭组分的作用提供包含其的溶液抵抗ph变化的试剂。依照本发明的合适的药学可接受缓冲剂包括但不限于组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、葡糖酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、甘氨酰甘氨酸和其它有机酸缓冲液、和磷酸盐缓冲液。优选的缓冲液包含l-组氨酸或l-组氨酸与盐酸l-组氨酸的混合物，其具有等张剂和用本领域中已知的酸或碱的潜在ph调节。最优选的是l-组氨酸。

20、“组氨酸缓冲液”是包含氨基酸组氨酸的缓冲液。组氨酸缓冲液的例子包括盐酸组氨酸、乙酸组氨酸、磷酸组氨酸、硫酸组氨酸。发现本文中的例子中鉴定的优选组氨酸缓冲液是盐酸组氨酸。在一个优选的实施方案中，通过用稀释的盐酸滴定l-组氨酸(游离碱，固体)或者通过以限定的量和比率溶解l-组氨酸和盐酸l-组氨酸(例如以一水合物形式)来制备盐酸组氨酸缓冲液。

21、术语“稳定剂”指药学可接受稳定剂，如例如但不限于氨基酸和糖及如本领域中已知的任何种类和分子量的商品化右旋糖苷。

22、优选地，稳定剂选自下组：盐、碳水化合物、糖类和氨基酸，更优选地碳水化合物或糖类，更优选地管理部门准许作为药物配制剂中的合适添加剂或赋形剂的糖，最优选地选自下组：二水合α,α-海藻糖、nacl和甲硫氨酸。稳定剂的优选浓度是15至250mm，或更优选地150至250mm。最优选的是约210mm的浓度。配制剂可以含有第二稳定剂，其中优选地，此第二稳定剂是甲硫氨酸，优选地浓度为5至25mm，更优选地浓度为5至15mm。最优选的甲硫氨酸浓度是约10mm。

23、所述组合药物配制剂是指处于使得容许活性成分的生物学活性有效的形式，且不含对于会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分的制剂。此类配制剂是无菌的。

24、“无菌”配制剂是无菌的或没有所有活的微生物及其孢子。

25、“施用的受试者”在本发明指犬细小病毒感染的动物，尤其是指犬。

26、术语“氨基酸”意指约1至约100mg/ml量的氨基酸，包括但不限于精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸和脯氨酸。

27、术语“糖类”包含通用组成(ch2o)n及其衍生物，包括单糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、还原糖、非还原糖等。本文中糖类的例子包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麦芽糖、右旋糖苷、甘油、右旋糖苷、赤藓糖醇、甘油、阿拉伯糖醇、木糖醇(sylitol)、山梨糖醇、甘露糖醇、蜜二糖(mellibiose)、松三糖、棉子糖、甘露三糖、水苏糖(stachyose)、麦芽糖、乳酮糖(lactulose)、麦芽酮糖(maltulose)、葡糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、异麦芽酮糖等。依照本发明的定义中还包括葡糖胺、n-甲基葡糖胺(所谓的“甲葡胺”)、半乳糖胺和神经氨酸及依照本发明的糖类的组合。本文中的优选的糖类是非还原性二糖类，诸如海藻糖或蔗糖。依照本发明的最优选的糖类是海藻糖。

28、术语“表面活性剂”意指药学可接受表面活性剂。在本发明的配制剂中，表面活性剂的量以重量/体积表述的百分比描述。最常使用的重量/体积单位是mg/ml。药学可接受表面活性剂的合适的例子包括聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯(tween)、聚乙烯-聚丙二醇、聚氧乙烯-硬脂酸酯、聚氧乙烯烃基醚，例如聚氧乙烯单月桂基醚、烃基苯基聚氧乙烯醚(triton-x)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(poloxamer,pluronic)、和十二烷基硫酸钠(sds)。最合适的聚氧乙烯山梨聚糖-脂肪酸酯是聚山梨酯20(以商标tween 20tm出售)和聚山梨酯80(以商标tween 80tm出售)。最合适的聚乙烯-聚丙烯共聚物是那些以名称f68或poloxamer 188出售的。优选的聚氧乙烯-硬脂酸酯是那些以商标myrjtm出售的。最合适的聚氧乙烯烃基醚是那些以商标brijtm出售的。最合适的烃基酚聚氧乙烯醚以商标triton-x出售。

29、所述共配制剂是指共施用的分开配制剂。