脱氨酶突变体及基于脱氨酶突变体构建的碱基编辑器

本发明涉及基因编辑，尤其是涉及脱氨酶突变体及基于脱氨酶突变体构建的碱基编辑器。

背景技术：

1、crispr/cas9为代表的新型基因编辑技术在编辑效率方面具有优势，有效推动了基因编辑技术的发展和进步。2016年以来，研究者以crispr/cas9、crispr/cas12a(cpf1)、crispr/cas12f为基础，已经开发出多种dna碱基编辑工具，可在基因组水平实现高效精准的点突变，且此过程中不会产生dna双链断裂。目前碱基编辑器主要有两种：胞嘧啶碱基编辑器(cbe，可介导c·g--t·a突变)和腺嘌呤碱基编辑器(abe，可介导a·t--g·c突变)。其中，cbe是将特定的胞嘧啶核苷脱氨酶(cytidine deaminase)与突变型核酸酶(如携带有d10a或突变的spcas9，称为nspcas9；或是功能失活型cas12a或cas12f，称为dcas12a或dcas12f)以及尿嘧啶糖基化酶抑制因子(ugi)融合，得到的融合蛋白可在sgrna的引导下，介导c·g--t·a突变。

2、现有cbe工具中的脱氨酶多属于胞嘧啶核苷脱氨酶(cytidine deaminase)家族，胞嘧啶核苷脱氨酶本身对单链dna(ssdna)有高亲和性，这导致多数cbe工具存在cas非依赖的dna脱靶效应，因此有很大的安全隐患。虽然研究者采用多种策略对cbe工具进行优化，但依然缺少在rna/dna脱靶效应以及编辑窗口/精度等多个方面进行协同优化的cbe工具。完成rna/dna脱靶效应优化的cbe工具的活性窗口非常局限，极大的限制了cbe的应用前景(nat biotechnol,2020.38(5):620-628；nat commun,2020.11(1):2052；nat methods,2020.17(6):600-604)。

技术实现思路

1、为开发具有低水平rna/dna脱靶效应且多样化活性窗口的cbe工具，本发明的提供脱氨酶突变体及基于脱氨酶突变体构建的碱基编辑器。

2、本发明通过开发筛选新的胞苷脱氨酶突变体，将胞苷脱氨酶突变体融合于nspcas9为代表的突变型核酸酶的不同位点(n-末端、c-末端和内部插入位点)，得到的新融合蛋白，即为碱基编辑器cbe。

3、本发明开发出的碱基编辑器cbe用于dna水平特定位点特定碱基的突变，可有效实现c-t单碱基替换，而且cas非依赖的dna脱靶效应和rna脱靶效应均处于低水平甚至被清除。根据在nspcas9中融合位点的不同，新构建的碱基编辑器还具有不同的活性窗口。本发明能有效拓宽单碱基编辑工具的应用。

4、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

5、本发明首先提供一种胞苷脱氨酶突变体，为基于apobec3a蛋白进行的以下突变中的一种或几种的组合，所述apobec3a蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示：

6、y130f、n57g、d133g、sta13del、gi-del、rl1、n57g与rl1组合、d133g与rl1组合，

7、其中，y130f指将apobec3a蛋白的第130位氨基酸位点由氨基酸y突变为f，n57g指将apobec3a蛋白的第57位氨基酸位点由氨基酸n突变为g、d133g指将apobec3a蛋白的第133位氨基酸位点由氨基酸d突变为g；

8、sta13del是指删除1-13位氨基酸；

9、gi-del是指删除rl1区域第25-26位氨基酸；

10、rl1是指将apobec3a蛋白的氨基酸序列第25-26位氨基酸替换为apobec3g的氨基酸序列epwvr。

11、在本发明的一个实施方式中，所述胞苷脱氨酶突变体优选为基于apobec3a蛋白进行的n57g和rl1突变的组合，或，d133g和rl1突变的组合。

12、这些胞苷脱氨酶突变体为具有c-t单碱基编辑活性且低水平cas非依赖的dna脱靶效应的胞苷脱氨酶突变体。

13、本发明还提供一种碱基编辑器cbe，所述碱基编辑器cbe为将所述胞苷脱氨酶突变体融合于突变型核酸酶的不同位点，得到的新融合蛋白。

14、在本发明的一个实施方式中，所述突变型核酸酶选自nspcas9或其突变体，其中nspcas9的氨基酸序列如seq id no.2所示。

15、在本发明的一个实施方式中，所述碱基编辑器cbe为将所述胞苷脱氨酶突变体的5’和3’分别添加nls序列和linker序列后，再融合于突变型核酸酶的不同位点，得到的新融合蛋白。

16、在本发明的一个实施方式中，所述突变型核酸酶的不同位点包括突变型核酸酶的n-末端、c末端或内部融合位点。

17、在本发明的一个实施方式中，所述突变型核酸酶选自nspcas9时，nspcas9的c末端有额外的link序列，link序列如seq id no.5所示。

18、在本发明的一个实施方式中，所述突变型核酸酶选自nspcas9时，nspcas9内部融合位点选择为nspcas9的第203，312，535，770，793，801，895，905，919，1010，1029，1047-1064和1249位点。

19、在本发明的一个实施方式中，所述碱基编辑器cbe选择为

20、nspcas9的第535或770或801或895或905或919或1010或1029或1249位点融合a3a-(n57g)-rl1获得的cbe-internal-a3a-(n57g)-rl1变体，其中，a3a-(n57g)-rl1表示基于apobec3a蛋白进行的n57g和rl1突变的组合，或，

21、nspcas9的第535或770或793或801或895或919或1010位点融合nl-a3a-(n57g)-rl1获得的cbe-internal-a3a-(n57g)-rl1变体，其中，nl-a3a-(n57g)-rl1表示a3a-(n57g)-rl1的5’和3’分别添加nls序列和linker序列后获得的nls-a3a-(n57g)-rl1-linker，氨基酸序列如seq id no.6所示。

22、本发明还提供所述碱基编辑器cbe的构建方法，包括以下步骤：

23、将所述胞苷脱氨酶突变体融合于突变型核酸酶的不同位点，构建所述碱基编辑器cbe，

24、优选的，将胞苷脱氨酶突变体5’和3’分别添加nls序列和linker序列后，融合于突变型核酸酶的不同位点，构建所述碱基编辑器cbe。

25、本发明还提供所述碱基编辑器cbe的应用，所述碱基编辑器cbe介导c·g--t·a突变，用于dna水平特定位点特定碱基的突变。

26、本发明还提供一种多核苷酸，编码所述胞苷脱氨酶突变体或编码所述碱基编辑器cbe。

27、本发明还提供一种载体，含有所述的多核苷酸。

28、本发明还提供一种宿主细胞，含所述碱基编辑器cbe，或含有所述载体。

29、本发明第还提供一种试剂盒，包含用于构建所述胞苷脱氨酶突变体或所述碱基编辑器cbe的试剂。

30、与现有技术相比，本发明开发了胞苷脱氨酶突变体，通过将胞苷脱氨酶突变体融合于spcas9为代表的突变型核酸酶的不同位点，得到新的融合蛋白，该融合蛋白作为cbe工具，能对位于前间隔序列不同位置的胞嘧啶实现有效的c-t碱基突变。通过所述方法获得的融合蛋白，其cas非依赖的dna脱靶效应接近本底水平，且具有多样化的编辑活性窗口。本发明的碱基编辑器具有非常低水平的dna/rna脱靶效应，且活性窗口多样化，可实现更广范围、更精细且安全性更高的c-t单碱基替换，能有效拓宽单碱基编辑工具的应用，具有很高的应用价值。

31、本发明方法实现了rna/dna脱靶效应以及编辑窗口等多个方面进行协同优化。