榨菜多糖的制法及其在降血脂和促肠道Akkermansia菌增殖中的应用

榨菜多糖的制法及其在降血脂和促肠道akkermansia菌增殖中的应用
技术领域
1.本发明属于榨菜深加工技术领域，具体涉及榨菜多糖的制法及其在降血脂和促肠道akkermansia菌增殖中的应用。


背景技术：

2.当前，心血管疾病已成为威胁人类健康的主要因素，在疾病致死数量中排第一位。近年来，随着人民生活物资的极大丰富，人们极易获得高热量食物。虽然人体每日必需摄入足够的热量以维持基本的生理活动，但长期过量摄入高热量食物会诱导一种典型的心血管疾—高脂血症(hyperlipidaemia)，如不进行防治干预，高脂血症很可能发展为糖尿病、冠心病和动脉硬化等严重疾病。通常，高血脂可以被特征化为异常升高的血总甘油三脂(total triglyceride，tg)、血总胆固醇(total cholesterol，tc)和血低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterin，ldl-c)水平，以及异常降低的血高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterin，hdl-c)浓度。此外，不平衡膳食诱导高脂血症的同时也常常伴随着肠道菌群失调。失调的肠道菌群不仅会进一步恶化高脂血症，还会导致肝损伤、胃肠炎和癌症等多种疾病。因此，有必要寻找一种安全且有效的降血脂和肠道菌群调节剂。
3.研究表明，摄入高比例的植物性食物有助于缓解高脂血症和肠道菌群紊乱。最近的一项研究表明，盐渍的和新鲜的榨菜均能抑制高脂膳食诱导的高脂血症和肠道菌群紊乱。然而，这项研究尚未明确是榨菜中的何种成分发挥了这些促健康效益。
4.非消化性多糖(non-digestive polysaccharides)是植物性食物中一类由各种糖分子聚合而成的大分子糖类化合物。虽然膳食多糖不能被人体消化吸收，但膳食多糖却是肠道微生物的优秀“粮食”，可为肠道微生物提供丰富的碳源。研究发现，膳食多糖具有多种生理功能，包括降血脂、促进肠道益生菌增殖、减肥、降血糖、保护肝脏、抗癌、润肠通便和免疫激活等。然而，来源自不同膳食的多糖也展现了不一样的主要生理活性。迄今为止，尚未有研究表明，榨菜多糖是否具有维持血脂代谢稳态和肠道菌群平衡的生理活性。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种榨菜多糖的制法及其在降血脂和促肠道akkermansia菌增殖中的应用，该榨菜多糖的单糖组成明确，可作为有效维持血脂代谢稳态，促进肠道akkermansia益生菌增殖的药物成分和/或食品营养因子。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种榨菜多糖的制法，包括如下步骤：
7.(1)榨菜预处理；
8.(2)向上述预处理后的榨菜中加入纯水，并进行匀浆处理；
9.(3)将匀浆处理后的榨菜在90-100℃下进行煮沸5-15min，抽滤后收集滤浆，滤渣
再提取两次；
10.(4)合并滤浆后，在60-80℃，压力在10-150mbar下进行减压浓缩至粘稠，得到浓缩液a；
11.(5)向上述浓缩液a中加入无水乙醇，搅拌，静置，抽滤，得到滤饼；
12.(6)将上述滤饼采用纯水溶解后置于透析袋中，反复透析8-10次，后在-30
‑‑
10℃反复冻融10-20次，抽滤；
13.(7)将步骤(6)抽滤后的滤液在60-80℃，压力在10-150mbar下进行减压浓缩至粘稠，得到浓缩液b；
14.(8)将上述浓缩液b置于真空冷冻干燥中干燥处理，即得到榨菜多糖。
15.进一步，步骤(1)中对榨菜预处理的具体操作为：取新鲜茎瘤芥的榨菜，去掉木质化程度较高的老皮后，切成1-4
×
1-4
×
1-4mm榨菜颗粒。
16.进一步，步骤(2)中采用剪切式匀浆机在8000-15000rad/min下匀浆处理5-10min。
17.进一步，步骤(5)中无水乙醇的加入量为所述浓缩液a的体积5-15倍。
18.进一步，步骤(6)中所述透析袋为8000-12000da的透析袋。
19.进一步，步骤(8)中将浓缩液b置于常温下，真空度为0.2-1.5mbar下干燥处理。
20.上述制得的榨菜多糖在促肠道akkermansia菌增殖中的应用。
21.上述制得的榨菜多糖在降血脂中的应用。
22.以现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
23.1、本发明采用水提醇沉法制备榨菜粗多糖，利用反复冻融和透析技术去除榨菜粗多糖中的蛋白质和小分子杂质得到榨菜多糖，通过mpm-hplc-uv分析明确了该榨菜多糖的单糖组成。
24.2、本发明提供的榨菜多糖具有显著提升肠道akkermansia菌相对丰度的活性，可作为益生元应用。
25.3、本发明提供的榨菜多糖具有显著降低血甘油三脂和低密度脂蛋白胆固醇水平和增加血高密度脂蛋白胆固醇水平的活性，可作为降血脂制剂。
26.4、本发明提供的榨菜多糖通过平衡调控lpe(18:1/0:0)和lpc(16:1/0:0)代谢，并介导调控pi3k-akt、mapk、foxo等信号通路实现了降血脂功能，且通过研究发现，该榨菜多糖具有降血脂功能的同时具有促肠道akkermansia菌增殖。
附图说明
27.图1为榨菜多糖的单糖组成高效液相色谱图；
28.图2为榨菜多糖抑制高果糖膳食诱导的血脂代谢紊乱图；
29.图3为榨菜多糖调节高果糖膳食喂养小鼠的代谢指纹图谱；
30.图4为小鼠肝脏转录组和代谢组的相关性分析图；
31.图5为榨菜多糖调节高果糖膳食喂养小鼠的肠道微生物组成图(属水平)；
32.图6为在属水平上对肠道微生物进行环境因子冗余分析图(redundancy analysis，rda)。
具体实施方式
33.下面结合具体实施例和说明附图，对本发明方法进行详细说明。
34.一、榨菜多糖的制备
35.实施例1
36.一种榨菜多糖的制法，包括如下步骤：
37.(1)榨菜预处理：取新鲜茎瘤芥的榨菜，去掉木质化程度较高的老皮后，用刀切成2
×2×
2mm榨菜颗粒；
38.(2)向上述预处理后的榨菜中加入纯水，采用剪切式匀浆机在10000rad/min下匀浆处理7min；
39.(3)将匀浆处理后的榨菜在90℃下进行煮沸15min，抽滤后收集滤浆，滤渣再提取两次；
40.(4)合并滤浆后，在60℃，压力在70mbar下进行减压浓缩至粘稠，得到浓缩液a；
41.(5)向上述浓缩液a中加入10倍体积(v/v)的无水乙醇，搅拌均匀后静置2h，抽滤，得到滤饼，该滤饼为榨菜粗多糖；
42.(6)将上述滤饼采用纯水溶解后置于10000da的透析袋中，反复透析10次，以除去榨菜粗多糖中的小分子杂质，随后在-20℃反复冻融10次，以去除蛋白质，抽滤；
43.(7)将步骤(6)抽滤后的滤液在60℃，压力在80mbar下进行减压浓缩至粘稠，得到浓缩液b；
44.(8)将上述浓缩液b置于常温下，真空度为0.7mbar下冷冻干燥处理，即得到榨菜多糖。
45.实施例2
46.一种榨菜多糖的制法，包括如下步骤：
47.(1)榨菜预处理：取新鲜茎瘤芥的榨菜，去掉木质化程度较高的老皮后，用刀切成1
×2×
4mm榨菜颗粒；
48.(2)向上述预处理后的榨菜中加入纯水，采用剪切式匀浆机在15000rad/min下匀浆处理5min；
49.(3)将匀浆处理后的榨菜在100℃下进行煮沸5min，抽滤后收集滤浆，滤渣再提取两次；
50.(4)合并滤浆后，在70℃，压力在150mbar下进行减压浓缩至粘稠，得到浓缩液a；
51.(5)向上述浓缩液a中加入5倍体积(v/v)的无水乙醇，搅拌均匀后静置2h，抽滤，得到滤饼，该滤饼为榨菜粗多糖；
52.(6)将上述滤饼采用纯水溶解后置于8000da的透析袋中，反复透析9次，以除去榨菜粗多糖中的小分子杂质，随后在-10℃反复冻融15次，以去除蛋白质，抽滤；
53.(7)将步骤(6)抽滤后的滤液在70℃，压力在150mbar下进行减压浓缩至粘稠，得到浓缩液b；
54.(8)将上述浓缩液b置于常温下，真空度为0.2mbar下冷冻干燥处理，即得到榨菜多糖。
55.实施例3
56.一种榨菜多糖的制法，包括如下步骤：
57.(1)榨菜预处理：取新鲜茎瘤芥的榨菜，去掉木质化程度较高的老皮后，用刀切成4
×2×
1mm榨菜颗粒；
58.(2)向上述预处理后的榨菜中加入纯水，采用剪切式匀浆机在8000rad/min下匀浆处理10min；
59.(3)将匀浆处理后的榨菜在95℃下进行煮沸10min，抽滤后收集滤浆，滤渣再提取两次；
60.(4)合并滤浆后，在80℃，压力在10mbar下进行减压浓缩至粘稠，得到浓缩液a；
61.(5)向上述浓缩液a中加入15倍体积(v/v)的无水乙醇，搅拌均匀后静置2h，抽滤，得到滤饼，该滤饼为榨菜粗多糖；
62.(6)将上述滤饼采用纯水溶解后置于12000da的透析袋中，反复透析8次，以除去榨菜粗多糖中的小分子杂质，随后在-30℃反复冻融20次，以去除蛋白质，抽滤；
63.(7)将步骤(6)抽滤后的滤液在80℃，压力在10mbar下进行减压浓缩至粘稠，得到浓缩液b；
64.(8)将上述浓缩液b置于常温下，真空度为1.5mbar下冷冻干燥处理，即得到榨菜多糖。
65.二、本发明制备的榨菜多糖的单糖组分分析
66.取10mg榨菜多糖用2mol/l三氟乙酸在沸水中水解6h，向水解液中加入50μl浓度为0.5mol/l的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液和50μl浓度为0.3mol/l的氢氧化钠水溶液，在70℃下衍生化反应1h；反应液用50μl浓度为0.3mol/l的盐酸调节ph后，用1ml氯仿重复提取3次，合并提取液为待测样品。取20μl待测样品上样，进行高效液相色谱检测，紫外检测器波长为250nm。色谱洗脱过程中，流动相a为乙腈，流动相b为包含0.045％磷酸二氢钾和0.05％三乙胺的水溶液；流动相流速为1ml/min，流动相b的梯度为0-10-60min为93-89-89％。图1为榨菜多糖的单糖组成高效液相色谱图，纵坐标为紫外检测器测定的吸光度，横坐标为色谱洗脱时间。从图1可知，榨菜多糖主要以d-甘露糖、l-鼠李糖、d-葡萄糖醛酸、d-葡萄糖、d-半乳糖和l-阿拉伯糖组成。依据标准曲线计算得榨菜多糖的单糖比例：d-甘露糖为1～2％，l-鼠李糖为0.4～0.9％，d-葡萄糖醛酸为3～4％，d-葡萄糖为58～70％，d-半乳糖为6～9％，l-阿拉伯糖为19～24％。由此可见，本发明制备的榨菜多糖具有明确的单糖组分。
67.三、本发明制备的榨菜多糖在降血脂和促肠道akkermansia菌增殖中的应用
68.3.1)动物实验设计与方法
69.32只健康的雄性c57bl/6j小鼠(22g
±
1g)，经过1周的适应性喂养期后以每组8只随机分成4组，分别为控制组、高果糖组、低剂量榨菜多糖组和高剂量榨菜多糖组。果糖作为当前食品工业的重要甜味剂被广泛应用于饮料和焙烤食品。然而，大量研究证实，长期过量摄入果糖，如经常引用大量碳酸饮料，会导致高脂血症和肠道菌群紊乱。因此，高果糖组、低剂量榨菜多糖组和高剂量榨菜多糖组小鼠饮用30％果糖水，而控制组小鼠饮用自来水。控制组和高果糖组小鼠每日灌胃0.4ml生理盐水。低剂量榨菜多糖组和高剂量榨菜多糖组小鼠每日灌胃0.4ml剂量为25mg/kg
·
bw和25mg/kg
·
bw的榨菜多糖水溶液。在连续8周的处理期中，所有小鼠自由摄入标准啮齿动物饲料。最后一次灌胃管理后，禁食12h。小鼠经麻醉后处死，收集血液和结肠内容物。
70.小鼠血液在3000
×
g下离心15min，收集上层血清。血清利用商业试剂盒测定总甘油三脂(bc0625，索莱宝)、总胆固醇(bc1985，索莱宝)、低密度脂蛋白胆固醇(a113-1-1，南京建成)和高密度脂蛋白胆固醇(a112-1-1，南京建成)水平。
71.利用基因组dna试剂盒(omega biotek)提取小鼠肠道内容物中的微生物dna。对提取dna的16s rrna的v3-v4区以341f(5
’‑
cctacgggnggcwgcag-3’)和805r(5
’‑
gactachvgggtatctaatcc-3’)为引物进行扩增。扩增产物经纯化后进行基因测序。测序结果在移除低质量reads后，以feature(相当于100％相似度)表示物种结果。
72.3.2)实验结果
73.图2为榨菜多糖抑制高果糖膳食诱导的血脂代谢紊乱，其中，a为各组小鼠血清总甘油三脂的含量，b为各组小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇的含量，c为各组小鼠血清高密度脂蛋白胆固醇的含量，d为各组小鼠血清总胆固醇的含量。控制组小鼠摄入自来水；高果糖组、低剂量和高剂量榨菜多糖组小鼠都摄入30％果糖水(w/v)，控制组小鼠和高果糖组小鼠灌胃摄入生理盐水，低剂量和高剂量榨菜多糖组小鼠分别灌胃摄入25mg/kg
·
bw和50mg/kg
·
bw的榨菜多糖，本图中，数据之间具有不同字母(a-c)标注时，表示结果差异显著，p《0.05。从图2可知，小鼠连续摄入30％果糖水导致了血清总甘油三脂、血清总胆固醇和血清低密度脂蛋白胆固醇水平的显著降低，同时导致了血清高密度脂蛋白胆固醇水平的显著增加。然而，给高果糖水喂养小鼠灌胃高、低剂量的榨菜多糖抑制了血脂代谢的紊乱。特别是，高剂量榨菜多糖处理有效降低了高果糖水喂养小鼠的血清总甘油三脂和低密度脂蛋白水平，并有效增加了血清高密度脂蛋白水平。这些结果表明，榨菜多糖可以“混合型”抑制高果糖膳食引起的脂代谢紊乱，具有降血脂功效。
74.图3为榨菜多糖调节高果糖膳食喂养小鼠的代谢指纹图谱，其中，田字形方框表示该代谢物在四组中的百分含量，每一个小实心斑块表示25％；黑色实心圆圈表示差异极显著，p《0.01；黑色实心圆环表示差异显著，p《0.05；控制组小鼠摄入自来水；高果糖组、低剂量和高剂量榨菜多糖组小鼠都摄入30％果糖水(w/v)，控制组小鼠和高果糖组小鼠灌胃摄入生理盐水，低剂量和高剂量榨菜多糖组小鼠分别灌胃摄入25mg/kg
·
bw和50mg/kg
·
bw的榨菜多糖。从图3代谢组学分析发现：榨菜多糖维持高果糖水喂养小鼠体内的脂代谢稳态与其抑制lpe(18:1/0:0)和lpc(16:1/0:0)紧密相关。
75.图4为小鼠肝脏转录组和代谢组的相关性分析，其中，横坐标表示代谢物，纵坐标表示mrna，红白蓝色块表示代谢物和mrna的相关性，横坐标色条表示代谢物类型，控制组小鼠摄入自来水；高果糖组、低剂量和高剂量榨菜多糖组小鼠都摄入30％果糖水(w/v)，控制组小鼠和高果糖组小鼠灌胃摄入生理盐水，低剂量和高剂量榨菜多糖组小鼠分别灌胃摄入25mg/kg
·
bw和50mg/kg
·
bw的榨菜多糖。从图4的代谢组学和转录组学分析表明，pi3k-akt、mapk、foxo等信号通路是榨菜多糖预防高果糖水诱导脂代谢紊乱的关键信号通路。
76.图5为榨菜多糖调节高果糖膳食喂养小鼠的肠道微生物组成(属水平)，其中，纵坐标为相对丰度，表示某一属占总量的百分比；控制组小鼠摄入自来水；高果糖组、低剂量和高剂量榨菜多糖组小鼠都摄入30％果糖水(w/v)，控制组小鼠和高果糖组小鼠灌胃摄入生理盐水，低剂量和高剂量榨菜多糖组小鼠分别灌胃摄入25mg/kg
·
bw和50mg/kg
·
bw的榨菜多糖。从图5可知，小鼠肠道中的优势菌属为akkermansia和muribaculaceae_unclassified。其中，akkermansia菌已被大量研究证实为肠道益生菌，其肠道内相对丰度
与肥胖、糖尿病、心血管疾病和炎性肠炎等疾病呈显著负相关关系。连续8周摄入高果糖水导致小鼠结肠内akkermansia菌相对丰度的显著降低，虽然食用大量果糖的同时摄入低剂量榨菜多糖没有明显改善小鼠结肠内akkermansia菌的相对丰度，但摄入高剂量榨菜多糖可有效提升高果糖喂养小鼠结肠内的akkermansia菌相对丰度。
77.图6为在属水平上对肠道微生物进行环境因子冗余分析(redundancy analysis，rda)，其中，图中每个点代表一个小鼠样本，当两个样本之间的距离越远时，说明两个样本的群落结构相似度越低；箭头表示环境因子，其长度说明对应的膳食处理与对应微生物的相关程度，箭头越长表明对应膳食因子对相应微生物的影响越大；箭头连线之间的夹角表示二者之间的相关性，锐角代表正相关，钝角代表负相关；控制组小鼠摄入自来水；高果糖组、低剂量和高剂量榨菜多糖组小鼠都摄入30％果糖水(w/v)；控制组小鼠和高果糖组小鼠灌胃摄入生理盐水；低剂量和高剂量榨菜多糖组小鼠分别灌胃摄入25mg/kg
·
bw和50mg/kg
·
bw的榨菜多糖。从图6可知，榨菜多糖促进akkermansia菌增殖，使榨菜多糖处理小鼠与控制组小鼠接近，说明榨菜多糖促进akkermansia菌增殖能维持高果糖膳食喂养小鼠肠道微生态平衡，从而保护宿主健康。这些结果表明，榨菜多糖可以促进肠道akkermansia益生菌的增殖。
78.最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。