一株运动特里顿杆菌及其应用的制作方法

1.本发明属于益生菌筛选领域，具体是涉及一株运动特里顿杆菌及其在对虾养殖中的应用。


背景技术：

2.我国是水产养殖大国，产量位于世界前列。但在养殖的过程中往往面临着细菌性疾病的爆发，尤其是弧菌(王凤青,孙玉增,任利华,等.海水养殖中水产动物主要致病弧菌研究进展[j].中国渔业质量与标准,2018,8(02):49-56)。已报道的水产养殖的病原弧菌有20多种，主要包括副溶血弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌、溶藻弧菌等(曹瑞,何奇,杜兴伟,等.水产养殖动物病害检测和药敏试验分析[j].科学养鱼,2020,08:51-52)。“玻璃苗”病影响凡纳滨对虾6～12日龄幼虫，在出现异常个体后24～48h内死亡率超过90％。典型的大体临床体征包括消化道空，肝胰脏苍白或无色，导致病变动物呈半透明外观，研究表明其致病因子为副溶血弧菌vp-hl(yang feng,xu limei,huang wanzhen,li fang.highly lethal vibrio parahaemolyticus strains cause acute mortality in penaeus vannamei post-larvae[j].aquaculture,2022,548(1):1-11)。副溶血弧菌vp-hl的毒力比引起急性肝胰腺坏死病毒的毒力高1000倍，其在对虾养殖产业中具有非常严重的威胁。
[0003]
在养殖业中抗生素的使用可以减少弧菌疾病的爆发，但是这导致细菌耐药性的产生和水产品品质的下降。为减轻副溶血弧菌对水产养殖的危害，可通过寻找抑制副溶血弧菌生长的拮抗菌并且不会影响对虾的生长的菌株作为益生菌投入对虾的水产养殖中。
[0004]
近年来，更绿色环保的益生菌受到大家的广泛关注。益生菌可有效改善周围的菌群从而发挥其作用(甄晓然,沈辉,万夕和,等对虾源副溶血弧菌拮抗菌的筛选与评价[j].水产科学,2019,38(06):767-773)。益生菌一般情况下具备三种特征：(1)促进生长发育，益生菌可以通过饲料的投喂进入水产动物的消化道中，益生菌经过黏附和定植之后，会产生消化酶(zokaeifar h,balcazar j l,saad c r,et al.effects of bacillus subtilis on the growth performance,digestive enzymes,immune gene expression and disease resistance of white shrimp,litopenaeus vannamei[j].fish&shellfish immunology,2012,33(4):683-689)。消化酶的活性与宿主的食物利用率和生长特性密切相关(樊英,王晓璐,王友红,等.益生菌制剂和抗生素对凡纳滨对虾(litopenaeus vannamei)非特异性免疫及肠道微生物的影响比较[j].中国农学通报,2020,36(33):138-146)。(2)竞争性排斥病原菌益生菌可以通过多种策略抑制病原菌，如争夺生长繁殖所需的营养物质，分泌有抑菌活性的物质以及产生脂肪酸、乳酸和过氧化氢等不利于病原菌生存的代谢产物，从而保证养殖动物的健康生长(王兆平.益生菌在水产动物养殖中的应用[j].河南水产,2020,05:10-12)。(3)净化水质，在水体中投入光合细菌、硝化细菌和芽孢杆菌等生物制品，经过益生菌有氧化、硝化反硝化、解磷和硫化等多种作用，可以加速水体中氨、亚硝酸盐和硫化物等有毒物质的分解(张博.不同种类芽孢杆菌净化水质试验[j].饲料工业,2011,32(10):55-57)。
[0005]
益生菌最重要的功能就是拮抗病原菌，从而减少细菌性疾病的爆发和抗生素的滥用。海洋来源的细菌往往具有一定的拮抗功能，并且更能适应水产养殖的环境，对水产养殖的绿色健康发展具有一定的促进作用。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供海洋来源的一株运动特里顿杆菌及其应用。
[0007]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为提供一株运动特里顿杆菌，该运动特里顿杆菌(tritonibacter mobilis)菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心(guangdong microbial culture collection center,简称gdmcc)，其命名为运动特里顿杆菌r6-3g2(tritonibacter mobilis r6-3g2)，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为gdmcc no：62115，保藏时间为2021年12月10日，保藏单位的地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，邮编510070。
[0008]
所述运动特里顿杆菌r6-3g2(tritonibacter mobilis r6-3g2)是从西太平洋海水样品中分离纯化获得，在ma平板平板上，28℃培养48h后，挑取单菌落进行纯化，菌落圆形、光滑、凸形、整个边缘呈浅褐色，显微镜观察细胞呈短杆状。
[0009]
菌株tritonibacter mobilis r6-3g2生长的条件为：温度10～45℃，盐度范围0.5％～7％，ph6～9。优选，菌株tritonibacter mobilis r6-3g2生长的条件为：温度28℃，盐度3％，ph7。
[0010]
所述运动特里顿杆菌r6-3g2(tritonibacter mobilis r6-3g2)的dna基因序列如seq id no.1所示，提取菌株tritonibacter mobilis r6-3g2的dna，用27f和1492r作为引物，对其16s rrna进行基因扩增，得到长度为1392bp的基因序列片段，序列注册号为ol998636，在ez网站上进行对比，鉴定其为tritonibacter mobilis。
[0011]
所述运动特里顿杆菌tritonibacter mobilis r6-3g2可在对虾养殖中的应用，所述应用是将运动特里顿杆菌tritonibacter mobilis r6-3g2作为益生菌添加在对虾养殖水体中。
[0012]
所述益生菌添加的方式为活菌。
[0013]
本发明研究发现，所述运动特里顿杆菌tritonibacter mobilis r6-3g2的发酵液及代谢粗提物可抑制副溶血弧菌vp-hl、其他水产病原弧菌及常见的食源性病原菌生长。
[0014]
所述发酵液包括mb发酵液、yp30发酵液；将菌株r6-3g2接种到mb液体培养基/yp30液体培养基中120rpm/min，28℃发酵72h，制成发酵液。
[0015]
所述代谢粗提物是将菌株r6-3g2接种于yp30培养基(酵母膏0.5％、蛋白胨0.1％、海盐3％，ph7.5)和2216e培养基(酵母膏0.1％、蛋白胨0.5％、牛肉膏0.1％、海盐3％，ph7.5)中，28℃100rpm/min培养发酵，离心，取上清液，超声，萃取，旋蒸后用色谱甲醇溶解，得粗提物。
[0016]
所述其他水产病原弧菌包括但不限于费氏弧菌mccc1h00020、非1型霍乱弧菌mccc1a02608、副溶血弧菌mccc1a02609、创伤弧菌mccc1h00066、哈氏弧菌mccc1h00033、副溶血弧菌mccc1a02609、灿烂弧菌mccc 1a10925、拟态弧菌mccc1a00078、副溶血弧菌mccc1a18639、副溶血弧菌mccc1a18640等。
[0017]
所述常见的食源性病原菌包括但不限于沙门氏菌cicc21482、枯草芽孢杆菌10275、李斯特atcc19111、大肠杆菌cicc10302、白色假丝酵母cicc1943、迟钝爱德华氏菌eib202ma、eib202(tsa板)、金黄色葡萄球菌cicc 10384等。
[0018]
因此，所述运动特里顿杆菌tritonibacter mobilis r6-3g2的发酵液与代谢粗提物可在对虾养殖中应用，用于抑制副溶血弧菌等生长，以提高对虾幼苗的存活率。
[0019]
所述tritonibacter mobilis r6-3g2可作为养殖水体添加剂，抑制海水养殖病原弧菌等生长，以提高对虾幼苗的存活率。
[0020]
本发明的菌株r6-3g2可以产生抑菌化合物抑制病原菌副溶血弧菌vp-hl。抑菌实验证明r6-3g2的发酵液对副溶血弧菌vp-hl具有抑制作用；通过刃天青显色法证明r6-3g2的胞内及胞外的代谢粗提物能够抑制副溶血弧菌vp-hl；r6-3g2对虾养殖实验中能降低副溶血弧菌vp-hl对对虾的感染，提高对虾幼苗的存活率，对虾的虾苗没有毒副作用，在养殖时可以添加至水体中。
[0021]
与现有技术相比，本发明的突出优点和技术效果在于：
[0022]
申请人研究发现对虾“玻璃苗”病原菌为副溶血弧菌，并且该菌具有很强的致病毒力。与副溶血弧菌模式菌株比较，“玻璃苗”病原菌副溶血弧菌具有更强毒力和更广的耐药性，本发明针对此病原菌及时开展抗菌研究，获得具有抗“玻璃苗”病原菌副溶血弧菌的益生菌运动特里顿杆菌tritonibacter mobilis r6-3g2。
[0023]
实验表明，运动特里顿杆菌r6-3g2的发酵液和代谢产物能够显著抑制对虾“玻璃苗”病原菌副溶血弧菌，提高对虾等类似水产养殖动物存活率，具有较好的生产应用前景，可应用于对虾养殖，特别是虾苗的育苗养殖阶段。
附图说明
[0024]
图1菌株r6-3g2 yp30发酵液和mb发酵液对病原菌vp-hl的抑制。
[0025]
图2菌株r6-3g2对对虾的保护作用。
具体实施方式
[0026]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例将结合附图对本发明进行作进一步的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，以下对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。
[0027]
实施例1
[0028]
目标菌株的分离鉴定及生理生化特性：
[0029]
将菲律宾海盆样品涂布ma平板，28℃培养48h。从平板中挑取单菌落进行纯化，获得纯菌并编号r6-3g2。提取菌株r6-3g2的dna，用27f和1492r作为引物，对其16s rrna进行基因扩增，得到长度为1392bp的基因序列片段，序列注册号为ol998636，在ez网站上进行对比，鉴定其为运动特里顿杆菌tritonibacter mobilis。
[0030]
r6-3g2盐度、ph、温度测定：
[0031]
从ma平板上刮取新鲜的r6-3g2菌落于mb培养基中。在96孔板上分装上对应的ph梯度培养基和对应的盐浓度培养基，然后在对应的96孔板种加入5μl的r6-3g2菌悬液。每隔24h测定od600。吸取5μl的r6-3g2菌悬液滴加在ma培养基上，在4℃、10℃、15℃、20℃、28℃、37℃、45℃、60℃培养箱中培养48h，观察r6-3g2是否有长。经过实验得出r6-3g2在28℃长势最好；在盐度为3％的液体培养基长的最好；r6-3g2在ph为7的条件下生长最快，并且其生长的ph范围较广。
[0032]
对菌株r6-3g2进行进行常见的生理生化指标的测定：
[0033]
实验结果如表1～3所示。
[0034]
表1菌株r6-3g2 api 20e实验结果
[0035][0036]
表2菌株r6-3g2 api 20ne结果
[0037][0038][0039]
表3菌株r6-3g2 zym实验结果
[0040][0041][0042]
实施例2
[0043]
菌株r6-3g2对vp-hl的抑菌活性检测：
[0044]
将菌株r6-3g2在2216e培养基120rpm，28℃发酵72h。将病原菌制备成菌悬液后，稀释至od600＝0.4左右，将稀释的菌液再稀释100倍。取100μl稀释好的菌液于ma平板上，用玻璃涂布棒进行涂布，并静置20～30min，待表面完全干燥后，采用直径为10mm的打孔器再平板上均匀的打5个孔洞，做好标记后，用移液枪取100μl的发酵液加入打好的孔洞中。利用保鲜膜将平板包裹好放置在28℃培养箱种培养16～18h。观察抑菌圈的大小，并拍照记录。结果如图1所示，发现r6-3g2的发酵液对vp-hl具有较好的抑制效果，其抑菌圈圈直径为23mm，在yp30发酵液的抑菌圈大小为11.2mm。
[0045]
实施例3
[0046]
r6-3g2对其它病原菌的抑菌效果：
[0047]
通过上述结果可发现，r6-3g2对病原菌具有一定的抑制效果，因此可以对r6-3g2进一步进行科学研究。将r6-3g2接种到ma液体培养基和yp30液体培养基中120rpm/min，28℃发酵72h。将新鲜的病原菌制备成od600＝0.4的菌悬液，将菌悬液稀释100倍后，取100μl于mb培养基中，用灭过菌的涂布棒进行涂布，静置一段时间，观察到平板表面没有水分时，利用打孔器进行打孔。取100μl r6-3g2发酵液于平板孔洞中，在平板上做好标记。用保鲜膜密封固定后，在28℃的条件下，培养16～18h，观察抑菌圈的大小，并做好记录。
[0048]
表4r6-3g2两种发酵液对病原菌的抑制
[0049][0050]
实施例4 vp-hl的药敏性
[0051]
将vp-hl制备成菌悬液后，调整od600＝0.4左右，将调整好吸光值的菌悬液再稀释100倍后，取100μl于ma平板上，使用灭过菌的涂布棒将菌悬液均匀的涂布整个平板后，静置
15～20min。用无菌镊子取出抗生素药敏纸片，放置在ma平板上，做好标记，28℃的条件下培养16～18h后，记录实验结果。如表所示，vp-hl对氯霉素和头孢曲松较为敏感，对7种抗生素具有耐药性；这7种抗生素分属于β－内酰胺类抗生素、四环素类抗生素、肽类抗生素。根据实验结果得出，vp-hl对四环素类抗生素的耐药性最强。按照多重耐药菌的定义可以得出，vp-hl是一株多重耐药菌。
[0052]
表5 vp-hl药敏实验
[0053][0054]
实施例5菌株r6-3g2的药敏实验
[0055]
将r6-3g2制备成菌悬液后，调整od600＝0.4左右，将调整好吸光值的菌悬液再稀释100倍后，取100μl于ma平板上，使用灭过菌的涂布棒将菌悬液均匀的涂布整个平板后，静置15～20min。用无菌镊子取出抗生素药敏纸片，放置在ma平板上，做好标记，28℃的条件下培养16～18h后，记录实验结果。经过实验研究发现r6-3g2对3种抗生素耐药，分别是青霉素、万古霉素和头孢氨苄。证明菌株r6-3g2的耐药的种类少，符合有益菌的应用标准。
[0056]
表6 r6-3g2的药敏实验
[0057][0058]
实施例6 r6-3g2胞内胞外粗提物对病原菌vp-hl的抑制
[0059]
为了确定菌株r6-3g2所产生的化合物是否具有抑菌效果，采用刃天青显色法进行检测(李芊.刃天青显色法和dxr酶抑制剂模型对海洋真菌来源抗弧菌活性物质的高通量筛选[d].厦门大学,2014；陈卓.高通量抗菌活性筛选模型的构建及两株海洋真菌次级代谢产物的研究[d].厦门大学,2014.)。取菌株r6-3g2接种于500ml yp30培养基(酵母膏0.5％、蛋白胨0.1％、海盐3％)和2216e培养基中，28℃100rpm/min培养发酵。离心，取上清液，用盐酸调ph＝3，按照上清液︰乙酸乙酯＝1︰1.5的配比，超声15min后，用分液漏斗进行萃取。将萃取好的乙酸乙酯40℃下进行旋蒸，旋蒸后用色谱甲醇溶解，然后取200μl的粗提物于八联管中，经过氮吹后加入dmso进行溶解，浓度为50mg/ml。离心的菌体加入500ml的超纯水，在超
净工作台中用细胞破碎仪破碎15min，观察到超纯水呈现出奶白色，在通风橱中用盐酸调整ph＝3，按照体积为1︰1.5的比例加入乙酸乙酯，超声后萃取；用旋蒸仪器进行旋蒸，甲醇溶解，氮吹后dmso复溶，浓度为50mg/ml。第一列加入95μl的kh2po4，在96孔板第2～12列加入100μl的无菌10g/l的kh2po4，在第一列加入5μl的粗提物，将第1孔的100μl混合物加入第2孔中，混匀取100μl加入第3孔，依次类推，第12孔不加。根据刃天青实验结果发现yp30发酵上清液和mb发酵液的菌株胞内粗提物对vp-hl具有较好的抑制效果，根据浓度计算，其抑菌浓度为3.125mg/ml。
[0060]
实施例7 r6-3g2对南美白对虾幼苗的保护应用
[0061]
将选取大小相同的南美白对虾的虾苗于含有500ml海水的培养缸里，分别设置空白对照组、vp-hl对照组和3组实验组，每组25尾对虾。分组后稳定培养4天，注意定时定量投喂及饲养环境的稳定。阳性对照组和阴性对照组均不添加益生菌，实验组添加r6-3g2发酵液使得菌株r6-3g2在海水水体中终浓度为4
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105cfu/ml，益生菌加入水体两天后，vp-hl组和实验组添加新鲜vp-hl发酵液，vp-hl发酵液在水体中终浓度为5
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104cfu/ml，空白组对照组不添加，期间记录对虾幼苗的数量变化，计算存活率。结果如图2所示，在投喂益生菌期间，对虾幼苗无死亡，表示r6-3g2对对虾幼苗并没有致病性；加入病原菌vp-hl后，实验组的对虾虾苗死亡数量少，并且在96h后开始出现死亡；vp-hl组的对虾虾苗在水体加入病原菌24h后开始死亡，并且死亡数量多，最终存活数量只有原来的20％。