与紫花苜蓿矿质营养元素相关的SNP分子标记及其应用

与紫花苜蓿矿质营养元素相关的snp分子标记及其应用
技术领域
1.本技术属于生物技术领域，具体涉及与紫花苜蓿矿质营养元素相关的snp分子标记及其应用。


背景技术：

2.植物体内钾（k）、钙（ca）、镁（mg）、磷（p）等矿质元素是促进植物生长发育的重要营养元素，也是牧草品质相关性状的重要组成部分。牧草作为草食动物的重要食物来源，其体内的矿质元素对动物的营养调节代谢发挥重要的作用。k离子是植物中最丰富的阳离子，参与植物渗透压、细胞膜电位、ph的调节过程，也参与蛋白质合成和光合作用过程中酶的活化；同时也能参与动物的葡萄糖转运。ca是生物体中普遍存在的第二信使，它参与各种细胞过程，调控植物的发育，以及生物和非生物胁迫响应，比如对植物干旱、伤害和热胁迫的快速反应，从而增强植物的免疫力。ca也是动物骨骼和牙齿的主要成分。mg是叶绿素的中心元素，是一系列固碳相关酶的辅助因子。因此，mg与植物光合作用和光合产物的运输密切相关，是植物生长发育的重要元素。在动物中，发现mg对肌肉再生也有很重要的作用。此外，p与植物产量调控密切相关，且有研究称当植物对p的摄入不足时会使植株产量降低10%~15%。动物体内p是必不可少的营养元素，是细胞膜、三磷酸腺苷（atp）、骨骼和牙齿的主要构成成份，主要参与能量代谢，脂类物质的吸收和转运，以及动物蛋白的形成等生物学功能。粗灰分含量是衡量饲料产品和饲料原料中营养成分的重要指标之一，也是饲料产品必须测定的营养指标之一，粗灰分测定对指导饲料及饲料原料的加工都具有意义。因此，研究苜蓿体内矿物质元素的遗传信息不仅对揭示其自身的生物学功能奠定理论基础，而且通过对苜蓿的遗传改良为草食动物提供具有矿质元素的苜蓿饲料具有重要意义。


技术实现要素：

3.针对现有技术的不足，本技术提供了紫花苜蓿矿质营养元素相关的snp分子标记及其应用。具体地，本技术采用全基因组重测序对群体单株进行基因型分析，通过表型数据和基因型数据的联合分析，开发了一批与矿物质营养元素相关的snps（单核苷酸多态性），本技术开发的snps可用于分子标记辅助选择育种，为苜蓿相关性状的遗传改良提供重要的分子信息，为加速育种进程具有理论指导意义。
4.在第一方面，本发明提供了紫花苜蓿矿质营养元素相关的snp分子标记，所述snp分子标记包括表1所示的snp位点。
5.表1
根据本技术的一些实施方式，所述snp分子标记还包括表2中所示的snp位点中的至少一种。
6.表2
本技术中的紫花苜蓿为同源四倍体紫花苜蓿，其染色体包括8个同源组，分别为1号染色体组、2号染色体组、3号染色体组、4号染色体组、5号染色体组、6号染色体组、7号染色体组和8号染色体组，每组中有4个等位基因染色体，分别记作a、b、c和d，共32条染色体。表1和表2的snp位点中，qtl名称代表snp位点的表型，其中，数字1-8代表同源组染色体的位置，字母a、b、c和d代表相应的同源组染色体中等位基因染色体的位置，ash代表与粗灰分含量相关的数量性状位点，ca代表与钙含量相关的数量性状位点，k代表与镁含量相关的数量性状位点，mg代表与镁含量相关的数量性状位点，p代表与磷含量相关的数量性状位点。例如，qmg-7d表示位于同源四倍体紫花苜蓿的7号染色体组的d染色体上与镁含量相关的数量性状位点。并且，表1和表2中也示出了snp位点的突变位点及具体序列，其中突变位点为序列中加粗且加下划线的位点处；表1和表2中给出的位置信息说明了qtl在对应的染色体上的位置，该qtl所在染色体开始的位置是0cm，该qtl的位置在染色体的特定距离处（例如67cm表示该qtl位于距离染色体开始位置的67cm处）。
7.本发明的第二方面提供了检测紫花苜蓿矿质营养元素的分子探针组合，其包括第一方面所述的snp分子标记。
8.本发明的第三方面提供了检测紫花苜蓿矿质营养元素的基因芯片，其包括第一方面所述的snp分子标记。
9.本发明的第四方面提供了检测紫花苜蓿矿质营养元素的试剂盒，其包括根据第二方面所述的分子探针组合或根据第三方面所述的基因芯片。
10.本发明的第五方面提供了第一方面所述的snp分子标记或第二方面所述的分子探针组合或第三方面所述的基因芯片或第四方面所述的试剂盒具有如下任一所述的用途：
（i）在检测紫花苜蓿矿质营养元素中的应用；（ii）在紫花苜蓿品种筛选的应用；（iii）在紫花苜蓿品种鉴定中的应用；（iv）在紫花苜蓿品种溯源中的应用；（v）在紫花苜蓿育种中的应用；（vi）在种质资源保护中的应用；（vii）在种质资源改良中的应用；（viii）在紫花苜蓿系谱重构中的应用。
11.本发明的第六方面提供了一种饲料，其通过利用第一方面提供的snp分子标记进行筛选获得的紫花苜蓿制备而成。
12.本发明的第七方面提供了一种改善食草动物矿物质营养方法，包括喂食利用第一方面提供的snp分子标记进行筛选获得的具有矿物质成分的紫花苜蓿或喂食第六方面所述的饲料。
13.本技术的发明人在育种过程中从大量的苜蓿材料中发现了两个不同的苜蓿材料，杂交后构建了遗传连锁图谱进行qtl定位。具体地，以所选的苜蓿群体为材料，分别对群体单株的灰分、钙、钾、镁、磷等营养元素含量进行测定，采用简化基因组测序对群体单株进行基因型分析，通过表型数据和基因型数据的联合分析，开发了一批与矿物质元素相关的snps，本技术开发的snps可用于分子标记辅助选择育种，为苜蓿相关性状的遗传改良提供重要的分子信息，对于加速育种进程具有重要的意义。
14.附图说明
15.图1显示了根据本技术实施例1的父本遗传图谱。
16.图2显示了根据本技术实施例1的母本遗传图谱。
17.图3显示了根据本技术实施例1的父本连锁遗传图谱品质相关qtl分布。
18.图4显示了根据本技术实施例1的母本连锁遗传图谱品质相关qtl分布。
19.图5显示了根据本技术实施例5获得的高分辨溶解曲线。
20.图3-4中，染色体左侧标尺为标记在连锁遗传图谱上的位置；图谱右侧不同的形状代表不同的表型性状，三角形代表ash，菱形代表k，正方形代表ca，五角星代表mg，圆形代表p。
21.具体实施方式
22.本技术通过以下实施例详细描述本技术，可使本专业技术人员更全面的理解本技术，但这些实施例并不对本技术的范围构成任何限制。
23.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
24.本发明以早熟低产苜蓿（地方品种）和晚熟高产苜蓿（育成品种）作为研究材料，旨在为动物饲料营养的有效利用提供新的方法。在本发明的一个实施例中，早熟低产苜蓿选
用的是沧州品种，其性状是叶片小、产量低、开花早、粗蛋白含量相对低，矿质元素含量占干物质重量的百分比分别为：粗灰分含量7.92%、k含量2.13%、ca含量1.52%、mg含量0.32%、p含量0.3%；晚熟高产苜蓿选用的是中苜1号品种，其性状叶片大、叶量丰富、产量高、开花晚、粗蛋白含量相对高，矿质元素含量占干物质量的百分比分别为：粗灰分含量7.12%、k含量1.93%、ca含量1.33%、mg含量0.29%、p含量0.29%。上述两个品种的来源为：沧州苜蓿是河北沧州的地方品种，中苜1号苜蓿是中国农业科学院北京畜牧兽医研究所育成的耐盐苜蓿新品种。矿物质元素测定结果分析表明，沧州苜蓿的含量均高于中苜1号。
25.实施例1 qtl的获得1、群体构建以早熟低产苜蓿单株为父本和晚熟高产苜蓿单株为母本杂交获得f1代苜蓿群体，材料种植于中国农业科学院廊坊试验基地（中国农业科学院万庄高新产业园区）。试验地位于河北省西北部，属暖温带大陆性季风气候，年平均气温11.9℃左右，最冷月份（1月）平均气温为
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4.7℃，最热月份（7月）平均气温为26.2℃，年降水量554.9mm，土质为中壤土，含有机质1.69 %，ph值7.37。
26.2、表型鉴定亲本与f1群体单株通过温室育苗，其中，在本发明的一个实施例中，f1代共采集了392个单株，温室育苗环境为光照时间16 h/ d，温度为22℃，相对湿度为40%，每个单株经扦插获得无性系，该操作至少设置3个重复，采用随机区组设计，三个重复种植于同一个地块上，植株行间距100cm，株距80cm。
27.矿物质元素含量的测定分别于2016、2019及2020年进行。每年5月上旬苜蓿初花期时（苜蓿开第一朵花时）对苜蓿进行刈割，地面留茬高度为5cm。刈割后的苜蓿样品于60℃烘箱中干燥24h后用粉碎机粉碎，过1mm筛。随后用近红外光谱分析仪（foss nirs 1650）分析苜蓿样品粗灰分（ash）、钙（ca）、钾（k）、镁（mg）、磷（p）的含量。
28.申请人对f1群体及亲本在3年测定的粗灰分与4种矿质元素的表型指标进行统计分析，发现除去2016年的ash、k和p含量，以及2020年p含量外，其余环境中父本与母本均存在显著性差异（p ＜0.05）（如表3所示）。f1群体中，ash与4种矿质元素k、ca、mg、p约占干物质含量分别为7%、2%、1.5%、0.3%和0.3%，且从其变异幅度看，其分布范围均在双亲差异的范围之外，存在广泛变异（如表3所示）。此外，ash与4种矿质元素指标的遗传力均大于0.50，具有较高的遗传力，表明受遗传因素的影响较大。除2019年测定的ash、k、mg峰度和偏度绝对值偏差较大外，其余性状在群体中分布的峰度和偏度绝对值均小于1，其表型频率分布均表现为正态或近似正态的连续分布，且存在双向超亲分离现象，符合qtl定位分析要求。
29.表3 紫花苜蓿f1群体粗灰分和4种矿质元素表型数据分析
注：sd，标准偏差；*代表0.05水平显著。
30.申请人对f1群体粗灰分与4种矿质元素间相关性分析发现（表4），除mg和p相关性较低外（p＜0.05），其余表型间相关性都呈极显著正或负相关（p＜0.001）。ash与mg极显著正相关（r=0.608），而k、ca、p却显著负相关。矿质元素之间，除mg与k和ca表现出负相关，其余k与ca和p呈极显著正相关（相关系数分别为0.564和0.718），p与ca和mg也呈极显著正相关。粗灰分主要为矿物质氧化物或盐类等无机物质，有时还含有少量泥沙，故称粗灰分。粗灰分与矿物质元素的相关性大，说明样品含泥沙或其他的杂质少，饲料行业有时利用分析粗灰分和矿物质元素的含量来判断是否掺了泥沙等杂质。因为粗灰分与矿物质的相关性大，所以也可通过粗灰分的含量判断矿物质含量。本技术的发明人通过定位与粗灰分相关的qtl及与矿物质相关的qtl,分析鉴定两者共定位的qtl，从而获得更有应用价值的分子标记。
31.表4 苜蓿f1群体五个指标间的相关性分析
注：*和***分别表示在0.05和0.001水平相关性显著。
32.3、群体连锁遗传图谱的构建采集100mg苜蓿植株幼嫩叶片，利用cwbio植物基因组dna试剂盒提取植物基因组dna（详细步骤参照试剂盒说明书）。dna样品利用nanodrop 2000分光光度计在260 nm的吸光度下进行定量。dna浓度调整到50 ng/
µ
l，之后用于gbs文库的制备。用ecot221限制性内切酶切dna，利用illumina hi-seq2000测序平台对文库进行100碱基双端测序。利用tassel 3.0软件完成snp calling和基因分型。将f1子代中分离比小于2：1的单剂量等位基因（single-dose alleles，sda）视为sda标记，而f1子代中缺失值小于50%的sda将会被用于连锁图谱构建。连锁图谱分群及排图利用joinmap 4.0软件进行分析，将筛选到的snp标记导入joinmap 4.0软件中，以lod = 3为标准构建苜蓿遗传连锁图谱。父本遗传图谱如图1所示，母本遗传图谱如图2所示。
33.4、qtl分析基于构建的高密度遗传图谱，三个环境中共检测出63个与粗灰分和4种矿质元素相关qtl（表5，图3，图4），分布于21个连锁群的不同位置，对表型变异的贡献率为2.5% ~ 29.9%。经鉴定与粗灰分相关的qtl共8个，其中3个位于父本，5个位于母本，对表型变异的贡献率为2.88% ~ 5.10%。共鉴定出8个与k含量相关的qtl，均来源于母本连锁群，对表型变异的解释率为3.10%~7.25%，其中于2020年环境中检测到表型变异最大的qtl（qk-2c），位于2c连锁群tp77362-tp23382标记区间内，可解释7.25%的表型变异。检测到与ca含量相关的qtl11个，均位于母本染色体，对表型变异的贡献率为3%
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6.56%。与mg含量相关的qtl有12个，解释表型变异为4.57% ~12.77%，其中有3个qtl的贡献率大于10%，分别是qmg-6d-2（12.77%），qmg-8b（10.97%）和qmg-7d（10%）。此外，鉴定了15个与p含量相关的qtl，表型变异的贡献率为2.50%~29.85%，有7个qtl贡献率大于10%，其中qp-6d-2、qp-6d-1、qp-6d-3位于母本6d连锁群，贡献率分别为29.85%、21.56%、11.12%； qp-7d-4、qp-7d-3、qp-7d-2位于父本7d连锁群，分别可解释24.83%、20.77%、11.84%的表型变异；qp-4d位于父本4d连锁群，贡献率为10.11%。
34.此外，鉴定了三个共定位区间，其中qp-2c和qk-2c共定位于母本2c连锁群60 cm处，分别解释7.53%和7.25%的表型变异；qp-3a和qmg-3a共定位于母本3a连锁群上67.5~69.5cm区间，贡献率分别为5.86%和7.39%；qp-6d-3和qmg-6d-2共定位于母本6d连锁群上38.5~40.5 cm区间，贡献率分别为11.12%和12.77%。
35.表5 紫花苜蓿f1群体矿物质元素含量相关的qtl定位结果
亲本qtl连锁群年份位置/cm遗传距离/cm标记区间lod贡献率/pve（%）加性效应p1qash-4d4d20161918.5-19.5tp55088-tp183353.363.43-0.19p1qash-6b6b20165148.5-51.5tp90609-tp779923.262.880.17p1qash-7d7d20162120.5-22.5tp84212-tp1011804.404.970.22p1qmg-7d7d20166766.5-67.5tp49814-tp880453.8710.000.01p1qp-2b2bblup6159.5-61.5tp40189-tp548143.564.780.00p1qp-4d4dblup2827.5-29.5tp85200-tp19624.6410.11-0.01p1qp-7d-17d20164241.5-42.5tp57684-tp399395.058.760.01p1qp-7d-27d20164342.5-43.5tp37187-tp796666.8911.840.01p1qp-7d-37dblup5453.5-54.5tp11100-tp6601614.1520.770.01p1qp-7d-47d20205857.5-58.5tp20704-tp9735716.6724.830.01p2qash-1c1c20163836.5-38.5tp91599-tp1000653.203.19-0.16
p2qash-5b5b2016116114.5-116.5tp7357-tp935034.164.720.21p2qash-5d5d20192120.5-22.5tp743-tp32683.615.10-0.23p2qash-6c6cblup1312.5-13.5tp1505-tp660083.623.530.16p2qash-8b-28bblup125123.5-126.5tp65937-tp60476.124.710.19p2qk-2c2c20206058.5-60.5tp77362-tp233824.627.250.17p2qk-4c-14c2020121119.5-121.5tp43916-tp1007703.264.440.13p2qk-4c-24c2016135133.5-136.5tp92640-tp237004.544.490.06p2qk-5a5ablup10-2.5tp13068-tp277403.063.100.06p2qk-6a-16a20165554.5-56.5tp89095-tp920833.723.57-0.05p2qk-6a-26a2020147145.5-147.5tp95828-tp269693.315.66-0.14p2qk-6d6d20162726.5-28.5tp53281-tp574926.746.730.07p2qk-7a7a20204139.5-41.5tp28312-tp477754.155.060.14p2qca-1d-11dblup2928.5-29.5tp12721-tp537923.804.180.02p2qca-1d-21d20163029.5-31.5tp53792-tp520344.694.610.04p2qca-3a3a20167472.5-74.5tp14699-tp490723.053.33-0.03p2qca-6b-16b2016122120.5-123.5tp2660-tp966203.173.00-0.03p2qca-6b-26bblup123121.5-124.5tp2660-tp966203.553.72-0.02p2qca-6d-16d20163332.5-33.5tp8104-tp242506.486.14-0.04p2qca-6d-26dblup3332.5-34.5tp8104-tp242503.483.64-0.02p2qca-6d-36d20203736.5-37.5tp97699-tp208474.376.11-0.05p2qca-8c8cblup8281.5-83.5tp11470-tp666583.494.38-0.02p2qca-8d-18d20206967.5-69.5tp51346-tp781993.264.22-0.05p2qca-8d-28d20168382.5-83.5tp86637-tp437745.996.560.04p2qmg-1d1dblup5048.5-51.5tp8248-tp150964.734.570.01p2qmg-3a3a20206967.5-69.5tp5189-tp270734.087.39-0.01p2qmg-5b5b2020130129.5-131.5tp58284-tp756945.398.44-0.01p2qmg-6d-16d20162120.5-22.5tp27726-tp225425.309.61-0.01p2qmg-6d-26d20164038.5-40.5tp87775-tp352946.9612.77-0.01p2qmg-8b-28b2019126124.5-127.5tp6047-tp573655.074.670.01p2qmg-8d8d20168988.5-89.5tp65212-tp563113.616.450.01p2qp-2b2b20169695.5-96.5tp31072-tp706784.424.92-0.01p2qp-2c2c20206058.5-60.5tp77362-tp233823.327.530.01p2qp-3a3a20206867.5-68.5tp88026-tp51893.365.860.01p2qp-3d3d201664.5-6.5tp34063-tp35984.703.440.01p2qp-5b5b20167473.5-74.5tp67323-tp107833.182.50-0.01p2qp-6d-16dblup2524.5-25.5tp72418-tp4849115.0121.56-0.01p2qp-6d-26d20162927.5-29.5tp29932-tp5841032.0629.85-0.02p2qp-6d-36dblup3938.5-40.5tp82945-tp877757.3611.12-0.01p2qp-7d7d20205755.5-57.5tp17260-tp81843.346.000.01
注：p1代表父本，p2代表母本。pve为贡献率，add为加性效应，正值表示增效等位基因来自于p2，负值表示增效等位基因来自于p1。
36.表6两个环境均稳定表达的qtl
亲本qtl连锁群年份位置/cm遗传距离/cm标记区间lod贡献率/pve（%）加性效应p2qp-2c2c20206058.5-60.5tp77362-tp233823.327.530.01p2qk-2c2c20206058.5-60.5tp77362-tp233824.627.250.17p2qp-3a3a20206867.5-68.5tp88026-tp51893.365.860.01p2qmg-3a3a20206967.5-69.5tp5189-tp270734.087.39-0.01p2qmg-6d-26d20164038.5-40.5tp87775-tp352946.9612.77-0.01p2qp-6d-36dblup3938.5-40.5tp82945-tp877757.3611.12-0.01
注：p1代表父本，p2代表母本。加性效应正值表示增效等位基因来自于p2，负值表示增效等位基因来自于p1。
37.对苜蓿粗灰分与矿质元素含量测定数据分析发现，粗灰分与k、ca、mg、p四种矿质元素含量占干物质含量分别为7%、2%、1.5%、0.3%和0.3%。考虑到各个性状受到一因多效性或多个基因相互作用的影响，对粗灰分及四种矿质元素进行了相关性分析。结果显示粗灰分与k、ca、mg、p均存在显著的相关性，这与矿质元素是粗灰分的主要组分有直接关系。此外，研究发现mg与k、ca都呈显著负相关，k却与ca为显著正相关，这可能是由于k、ca、mg参与了离子转运载体的竞争，三者之间存在拮抗作用所造成的。
38.qtl的多效性指同一区间检测到的qtl同时参与几个性状的调控，这种情况在动植物中都普遍存在，且此类与多个性状关联的标记在今后的分子标记辅助选择上将会更有效地用于改善植株的多个性状。本实施例的结果也证实了多效应qtl的存在。在母本2c连锁群上，qp-2c和qk-2c都定位于60 cm处，分别解释了7.53%和7.25%的表型变异，表明tp77362-tp23382标记区间内可能存在一个qtl与p和k含量均有相关性；在母本3a和6d连锁群上区间67.5 ~ 69.5 cm和38.5 ~ 40.5 cm处，存在两组与p和mg含量相关的多效应qtl，分别为qp-3a和qmg-3a，qp-6d-3和qmg-6d-2，解释表型变异较高，这些被定位在相同或相邻区间的qtl与表型性状间的相关性具有高度一致性。
39.此外，本技术还发现一些成簇分布的qtl，位于母本6d连锁群上的成簇qtl有9个，集中分布于21 ~ 40 cm区间，其中与k含量相关的有1个，与ca含量相关的有3个，与mg含量相关的有2个，与p含量相关的有3个；位于父本7d连锁群上的成簇qtl有6个，集中分布于21 ~ 67 cm区间，其中与ash含量相关的有1个，与p含量相关的有4个，与mg含量相关的有1个。成簇qtl产生的原因可能有两点：一是连锁群本身相较其他连锁群长度较短，标记密度大（分别为0.50 cm和1.64 cm），所以更容易检测出qtl；二是由于一因多效或微效基因紧密连锁于同一区间或基因重叠导致的，使相关性状的qtl通常定位于同一连锁群上相同或者相近区域。这些在不同环境或遗传背景下，检测到的与不同表型性状连锁的qtl为进一步精细定位和目标基因的克隆奠定了基础，并未苜蓿矿质元素相关的分子标记辅助选择的应用提供了借鉴。
40.本发明共检测到63个与粗灰分和ca、k、mg、p含量相关的qtl，分布于21个连锁群上，对表型性状的贡献率为2.50%~29.9%。不同环境稳定重复定位的qtl共8个（qca-3c-1和qca-3c-2，qca-6b-1和qca-6b-2，qca-6d-1和qca-6d-2，qash-8b-1和qash-8b-2），共定位的qtl有6个（qp-2c和qk-2c，qp-3a和qmg-3a，qp-6d-3和qmg-6d-2）。本技术鉴定的与苜蓿茎叶中矿物质含量相关的qtl与snp标记为苜蓿相关性状的遗传改良提供理论指导。
41.实施例2 snp分子标记的开发（1）待测苜蓿样品基因组dna的提取提取方法：依试剂盒说明书（cwbio plant genomic dna kit, cowin biosciences, beijing, china)为参考，具体操作步骤如下：a）取苜蓿嫩叶3-4片（约200mg），放入2 ml 离心管中（提前置入无菌钢珠）。将离心管置于液氮中冷冻后，用磨样机将叶组织打碎成粉末。在离心管中加入400 μl buffer lp1和6 μl rnasea（10 mg/ml），涡旋震荡1 min后室温静置10 min，使样品充分裂解。
42.b）离心管中加入130 μl buffer lp2，吸打混匀并震荡1 min。将离心管置于离心
机以12000 r/min离心5 min，吸取上清液置于新管中，加入1.5倍体积（750 μl）的buffer lp3震荡混匀。
43.c）将上述溶液转移至有收集管的离心柱中，以12000 r/min离心1 min后倒掉废液。然后在吸附柱中加入500 μl buffer gw2，以12000 r/min离心1 min，重复操作1次后，倒掉废液。
44.d）将吸附柱放入新的离心管中室温放置10min晾干，后悬空加入50 μl buffer ge，放置5min后，以12000 r/min离心1min，收集dna溶液，上述操作均在室温中进行。dna样品置于-20℃保存。
45.（2）rad 文库的构建及测序dna样品采用分光光度计（nanodrop2000）进行定量，然后将dna浓度调整到50ng/μl用于rad文库的构建。dna样品经ecori限制性酶消化，然后与特异性条形码p1接头连接。将样品混池后超声波随机截切。利用qseq100 dna分析仪分析了剪切后的片段，每个片段的平均长度约400bp。应用pcr纯化试剂盒（ampure xp beads）对剪切的dna片段进行纯化，用试剂盒中包含的da拖尾模块进行片段末端的修复，然后连接通用接头p2。通过pcr扩增富集dna片段，并利用ampure xp beads pcr纯化试剂盒纯化，每个样品经标准化达到10mm，用于上机测序。测序采用hi-seq x ten(illumina)。测序结果已提交到ncbi序列数据存储库（bioproject id:prjna503672）。
46.（3）序列分析与snp开发采用tassel3.0通用网络分析工具包（uneak）进行snp调用（snp calling），用蒺藜苜蓿基因组作为参考基因组比对进行基因分型，获得上表1和表2中所示的snp分子标记位点。
47.实施例3 检测紫花苜蓿矿质营养元素的snp基因芯片的制备基于实施例2获得的snp分子标记位点，本领域技术人员可以采用任意方式制备检测紫花苜蓿矿质营养元素的snp基因芯片，同样也可以委托生物公司制备，本发明不作限制，例如illumina公司、affymetrix 公司或者agilent公司，需要说明的是，基于本发明实施例2提供的snp位点制备的基因芯片均属于本发明的保护范围。
48.在本发明的一个实施例中，可以采用illumina公司的方法制备本技术的检测紫花苜蓿矿质营养元素的snp基因芯片，该芯片包括一个玻璃基片以及位于基片小孔中的若干个磁珠，所述每个磁珠上偶联有分别检测实施例2获得的表1所示位点和任选的表2所示位点中的至少一个位点的探针，用于检测目标样本，其中，磁珠上偶联在珠子的这一端的23个碱基的序列为address序列，也是dna片段的5'端，它是标识微珠的标签序列。离珠子较远端的50个碱基为3'端的序列，成为probe序列，其与目标dna进行互补杂交，能够识别实施例2获得的表1和表2所示的位点。
49.实施例4 snp检测试剂盒基于实施例2获得的snp分子标记位点，本领域技术人员可以采用任意方式制备检测紫花苜蓿矿质营养元素的snp检测试剂盒，同样也可以委托生物公司制备，本发明不作限制，例如illumina公司、affymetrix 公司或者agilent公司，需要说明的是，基于本发明实施例2提供的snp分子标记位点制备的检测试剂盒均属于本发明的保护范围。
50.在本发明的一个实施例中，为了能够使用实施例3提供的基因芯片进行对目标样
本进行检测，试剂盒中还包括四种带标记的双脱氧核苷酸、聚合酶和生物素标记的抗链霉亲合素的抗体、和dnp标记的，抗异种抗体fc端的抗体。
51.当然不同的基因芯片，应当适配相应的试剂，本发明不作限制。
52.实施例5 应用实施例（1）从苜蓿育种群体中随机选择192株苜蓿单株作为待测苜蓿样品，样品基因组dna的提取采用上述方法。提取方法依据dna提取试剂盒说明书，具体如实施例2所示。
53.（2）检测引物设计及pcr反应体系采用primer5.0引物设计软件，根据表1中的qtl的左右侧标记序列设计引物，在测序公司合成引物。然后将引物加入到pcr的反应体系中，反应体系总体积为5μl，其中5ng样品基因组dna，0.25 μm引物，1
×
master mix，终体积达到5 μl，最后加10 μl的矿物油。
54.pcr反应程序：95℃变性2 min；然后94℃、30秒、57℃(退火温度可根据实际设置)、30秒，45个循环，运行结束后4℃保存。
55.（3）基因型分析及突变位点的筛选与鉴定（基因型分析还可以通过对pcr产物进行测序分析，确定突变位点的碱基）pcr扩增产物被转移到高分辨率溶解曲线（hrm）分析系统中进行检测。hrm分析系统主要型号有lightscanner、lightcycler480、rotor-gene6000等，该系统具有精确的温度控制技术，并结合高速的数据采集技术，配合使用高分辨的饱和荧光染料lc green，使该仪器具有较高的灵敏度和特异性，5分钟即可完成96/192/384个pcr产物样品的突变检测，适用于大规模突变筛查及基因分型分析。
56.pcr扩增产物经仪器校准器校准后获得峰值读数，获得基因型结果，确定所标记的单碱基突变位点。结果发现，本实施例检测了192个样本中与粗灰分（ash）、钙（ca）、钾（k）、镁（mg）、磷（p）的含量相关的snp位点，结果表明，约53%的样本中出现了相关的位点突变，以与矿物质p含量相关qtl位点qp-6d-2为例，其中右侧变异位点为c/t，利用384孔扩增板隔行加样，对右侧变异位点分析显示，所有样本被分成两个类型，基因型分别为tttt、tttc，其中一个碱基t/c发生突变，高分辨率溶解曲线（hrm）结果如图5所示。进一步应用近红外分析仪对所有样品的p含量进行了分析，结果显示不同样品间p含量具有较大的差异，具有snp突变位点的单株蛋白含量有增高的趋势。
57.当然，利用本发明提供的与紫花苜蓿矿质营养元素相关的snp标记对众多苜蓿材料进行筛选，将筛选获得的具有矿质营养元素的紫花苜蓿替代常规紫花苜蓿去制作饲料，能够提高饲料中矿质营养成分，通过向食草动物喂食根据本发明获得的具有矿质营养成分的饲料，能够提高动物的矿物质营养。
58.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。