技术特征：
1.一种蛋白酶k突变体，其特征在于，其在seq id no.1所示的氨基酸序列的基础上，具有如下至少一种突变：f371c和t373p。2.根据权利要求1所述的蛋白酶k突变体，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.2所示。3.一种分离的核酸，其特征在于，其包括编码如权利要求1或2所述的蛋白酶k突变体的核酸序列；优选地，所述分离的核酸的序列如seq id no.3所示。4.一种重组载体，其特征在于，其含有如权利要求3所述的分离的核酸。5.如权利要求4所述的重组载体的构建方法，其特征在于，其包括：将所述分离的核酸插入载体中，构建获得单拷贝重组载体；优选地，所述构建方法还包括：将所述分离的核酸或其表达盒插入所述单拷贝重组载体中，获得双拷贝重组载体；优选地，所述构建方法还包括将所述分离的核酸或其表达盒插入所述双拷贝重组载体中，获得三拷贝重组载体。6.根据权利要求5所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述载体的构建方法如下：以ppic9k为基本骨架，根据golden gate组装原理设置6组引物对，克隆获得6个载体片段，将6个载体片段融合重组，获得所述载体；其中，所述6组引物对包括引物对1～引物对6，所述引物对1～引物对6的序列依次如seq id no.4～15所示。7.一种基因工程菌，其特征在于，其含有如权利要求4所述的重组载体或如权利要求5或6所述的构建方法构建的重组载体。8.如权利要求7所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，其包括将如权利要求4所述的重组载体或如权利要求5或6所述的构建方法构建的重组载体转化入菌体中获得基因工程菌；优选地，所述构建方法还包括对转化后的获得的转化子进行筛选：将所述转化子接种于含有抗生素的平板中，基于水解圈的大小，筛选获得高表达的基因工程菌；优选地，所述平板为含0.5％～2％干酪素的bmmy平板。9.如权利要求1或2所述的蛋白酶k突变体的制备方法，其特征在于，其包括：培养如权利要求7所述的基因工程菌或由权利要求8所述构建方法构建获得的基因工程菌，以诱导表达所述蛋白酶k突变体；或，在seq id no.1所示的氨基酸序列的基础上，进行如下至少一种突变：f371c和t373p。10.如权利要求1所述的蛋白酶k突变体或如权利要求7所述的基因工程菌或由权利要求8所述构建方法构建获得的基因工程菌在水解蛋白或制备用于水解蛋白的产品中的应用。
技术总结
本发明公开了一种蛋白酶K突变体及其表达载体的构建和应用，涉及生物工程技术领域，本发明提供了一种蛋白酶K突变体，其在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的基础上，具有如下至少一种突变：F371C和T373P，相对于野生型的蛋白酶K而言，具有更好的酶活，为蛋白酶K的应用和研究提供了途径。此外，本发明还提供了上述蛋白酶K突变体高拷贝表达载体的构建，提高了高表达菌体的筛选称功率，减少了大量筛菌的操作，为具有应用价值的蛋白酶K的工业化生产路线指明了方向。线指明了方向。线指明了方向。
技术研发人员：刁含文
受保护的技术使用者：南京巨匠生物科技有限公司
技术研发日：2021.12.29
技术公布日：2022/3/18