一种睾丸管周肌样细胞的生物标志物及其应用

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种睾丸管周肌样细胞的生物标志物及其应用。


背景技术：

2.睾丸是人体中组成成分最复杂的器官之一，包括：
①
由管周细胞、支持细胞和各级生精细胞组成的生精小管；
②
由leydig细胞和免疫细胞等组成的睾丸间质；
③
由内皮细胞和血管平滑肌细胞组成的脉管系统等。其中，leydig细胞是男性产生雄激素的最主要细胞，leydig细胞的功能障碍可导致生精障碍和雄激素下降引起的全身症状，充分理解leydig细胞的各项生理病理过程对于研究男性健康具有重要意义。此外，管周肌样细胞对于睾丸功能同样十分重要，是维持生精小管形态和活动性的主要细胞组分，近年来，管周肌样细胞的旁分泌功能也受到关注，学者普遍猜测管周肌样细胞对于睾丸局部生精微环境的稳态也十分重要。
3.在生命科学领域，分离、纯化和体外培养是研究某种类型细胞功能的必要手段，然而，最近的研究表明leydig细胞和管周肌样细胞有着共同的分化谱系，两者的基因表达谱也十分相似，此外，在体外培养体系中，两者均为贴壁生长，难以通过分步消化、差异贴壁和梯度离心等方法将两者分离，如cn101191124公开了一种leydig细胞的分离方法及其用途，所述方法包括：a.将用胶原酶消化的睾丸组织通过孔径为20-100μm的滤网过滤，得到睾丸间质组织内细胞；b.将获得的睾丸间质组织内细胞在培养液中培养10分钟-4.5小时，取贴壁细胞得到leydig细胞，但得到细胞中仍含较多管周肌样细胞。
4.受限于无法在体外有效分离leydig细胞和睾丸管周肌样细胞，leydig细胞和睾丸管周肌样细胞的相关研究进展缓慢。
5.近年来，有报道指出神经生长因子受体(nerve growth factor receptor，ngfr)可以作为分选leydig细胞的标志物，然而，申请人近期通过单细胞测序和免疫组化发现，虽然生殖细胞、支持细胞和免疫细胞等不表达ngfr，但是管周肌样细胞同样表达ngfr蛋白，这些结果提示该方法不能成功分离较纯净的leydig细胞和管周肌样细胞。
6.综上所述，如何提供一种有效分离方法，分别得到高纯度的leydig细胞和高纯度的管周肌样细胞，便于进行细胞功能、病理等研究，是leydig细胞和睾丸管周肌样细胞研究领域亟待解决的问题。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种睾丸管周肌样细胞的生物标志物及其应用，所述生物标志物可作为鉴定睾丸管周肌样细胞的标志物，从而能够有效区分睾丸管周肌样细胞和leydig细胞，分离得到高纯度的leydig细胞和高纯度的管周肌样细胞。
8.为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
9.第一方面，本发明提供一种睾丸管周肌样细胞的生物标志物，所述生物标志物包
括itga9蛋白。
10.本发明中，深入分析睾丸管周肌样细胞和leydig细胞的基因表达谱，发现睾丸管周肌样细胞特异表达itga9蛋白，而leydig细胞不表达该蛋白，基于itga9蛋白，能够有效区分睾丸管周肌样细胞和leydig细胞，从而解决了常规分步消化、差异贴壁和梯度离心等方法难以将两者分离的问题。
11.优选地，所述itga9蛋白的氨基酸序列包括seq id no.1所示的序列。
12.seq id no.1：
13.ynldpqrpvhfqgpadsffgyavlehfhdntrwvlvgapkadskyspsvkspgavfkcrvhtnpdrrcteldmargknrgtscgktcredrddewmgvslarqpkadgrvlacahrwkniyyeadhilphgfcyiipsnlqakgrtlipcyeeykkkygeehgscqagiagffteelvvmgapgsfywagtikvlnltdntylklndevimnrrytylgyavtaghfshpstidvvggapqdkgigkvyifradrrsgtlikifqasgkkmgsyfgsslcavdlngdglsdllvgapmfseirdegqvtvyinrgngaleeqlaltgdgaynahfgesiaslddldndgfpdvaigapkeddfagavyiyhgdaggivpqysmklsgqkinpvlrmfgqsisggidmdgngypdvtvgafmsdsvvllrarpvitvdvsiflpgsinitapqchdgqqpvnclnvttcfsfhgkhvpgeiglnyvlmadvakkekgqmprvyfvllgetmgqvteklqltymeetcrhyvahvkrrvqdvispivfeaayslsehvtgeeerelppltpvlrwkkgqkiaqknqtvferncrsedcaadlqlqgklllssmdektlylalgavknislnisisnlgddaydanvsfnvsrelffinmwqkeemgiscellesdflkcsvgfpfmrskskyefsvifdtshlsgeeevlsfivtaqsgnterseslhdntlvlmvplmhevdtsitgimsptsfvygesvdaanfiqlddlechfqpinitlqvyntgpstlpgssvsisfpnrlssggaemfhvqemvvgqekgncsfqknptpciipqeqenifhtifafftksgrkvldcekpgiscltahcnfsalakeesrtidiymllnteilkkdsssviqfmsrakvkvdpalrvveiahgnpeevtvvfealhnleprgyvvgw。
14.第二方面，本发明提供第一方面所述的睾丸管周肌样细胞的生物标志物在制备鉴定睾丸管周肌样细胞的产品中的应用。
15.本发明中，以itga9蛋白为标志物，通过鉴定该蛋白的方法如流式分析等，即可快速鉴定出睾丸管周肌样细胞。
16.第三方面，本发明提供一种鉴定睾丸管周肌样细胞的试剂盒，所述试剂盒包括抗itga9蛋白抗体。
17.本发明的试剂盒中包括抗itga9蛋白抗体，利用该抗体可对itga9蛋白进行特异性识别，从而进行进一步检测(如流式分析)，鉴定睾丸管周肌样细胞。
18.优选地，所述抗itga9蛋白抗体修饰有荧光基团。
19.优选地，所述试剂盒还包括抗ngfr蛋白抗体，所述抗ngfr蛋白抗体修饰有荧光基团。
20.优选地，所述抗itga9蛋白的荧光基团与所述抗ngfr蛋白抗体的荧光基团的荧光颜色不同。
21.优选地，所述荧光基团包括fitc、pe、alexafluor488、alex fluor594或cy5等。
22.优选地，所述试剂盒还包括封闭液。
23.优选地，所述封闭液包括含有牛血清白蛋白的pbs溶液。
24.优选地，所述pbs溶液中所述牛血清白蛋白的质量百分比为2～10％，优选为5％。
25.本发明中，生殖细胞、支持细胞和免疫细胞等不表达ngfr蛋白，而睾丸管周肌样细胞和leydig细胞表达ngfr蛋白，可通过ngfr蛋白快速从睾丸组织细胞悬液中分离出睾丸管
周肌样细胞和leydig细胞，再通过itga9蛋白区分睾丸管周肌样细胞和leydig细胞，从而得到高纯度的leydig细胞和高纯度的管周肌样细胞，ngfr和itga9双阳性的细胞为睾丸管周肌样细胞，ngfr阳性且itga9阴性的细胞为leydig细胞。
26.本发明中，能够特异性结合itga9蛋白的抗itga9蛋白抗体，以及特异性结合ngfr蛋白的抗ngfr蛋白抗体，均适用于本发明技术方案，如r&d公司的af3827货号抗体和abcam公司的ab8874货号抗体。
27.第四方面，本发明提供第一方面所述的睾丸管周肌样细胞的生物标志物第三方面所述的鉴定睾丸管周肌样细胞的试剂盒在分离纯化睾丸管周肌样细胞和/或leydig细胞中的应用。
28.第五方面，本发明提供一种分离纯化睾丸管周肌样细胞的方法，所述方法包括：
29.将抗itga9蛋白抗体与细胞悬液共孵育，进行流式分选，得到所述睾丸管周肌样细胞。
30.本发明中利用抗itga9蛋白抗体特异性结合睾丸管周肌样细胞，并通过流式分选，分离出细胞悬液中睾丸管周肌样细胞。
31.优选地，所述细胞悬液包括睾丸管周肌样细胞和leydig细胞的混合液。
32.第六方面，本发明提供一种分离纯化睾丸管周肌样细胞和leydig细胞的方法，所述方法包括：
33.将细胞悬液与抗ngfr蛋白抗体和抗itga9蛋白抗体共孵育，进行流式分选。
34.本发明中，睾丸组织中生殖细胞、支持细胞和免疫细胞等不表达ngfr蛋白，而睾丸管周肌样细胞和leydig细胞表达ngfr蛋白，可通过ngfr蛋白快速从睾丸组织细胞悬液中分离出睾丸管周肌样细胞和leydig细胞，再通过itga9蛋白区分睾丸管周肌样细胞和leydig细胞，从而得到高纯度的leydig细胞和高纯度的管周肌样细胞。
35.优选地，所述分离纯化睾丸管周肌样细胞和leydig细胞的方法包括以下步骤：
36.(1)取睾丸组织，制备细胞悬液；
37.(2)将所述细胞悬液与抗ngfr蛋白抗体和抗itga9蛋白抗体共孵育，进行流式分选。
38.优选地，步骤(1)所述细胞悬液的制备方法包括：
39.取睾丸组织，进行漂洗并使用胶原酶消化，过滤，得到所述细胞悬液。
40.优选地，所述漂洗的漂洗液包括pbs溶液。
41.优选地，所述胶原酶包括iv型胶原酶。
42.优选地，所述消化的时间为10～20min，包括但不限于11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min或19min。
43.优选地，所述过滤包括使用组织滤网进行过滤。
44.优选地，所述组织滤网的孔径为80～120μm，包括但不限于81μm、82μm、83μm、84μm、85μm、86μm、90μm、95μm、100μm、105μm、110μm、112μm、114μm、116μm或118μm。
45.优选地，步骤(2)所述共孵育的时间为25～35min，包括但不限于26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min或34min，温度为0～8℃，包括但不限于1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃或7℃。
46.优选地，步骤(2)所述共孵育前还包括将所述细胞悬液与封闭液共孵育的步骤。
47.优选地，所述封闭液包括含有牛血清白蛋白的pbs溶液。
48.优选地，所述pbs溶液中所述牛血清白蛋白的质量百分比为2～10％，包括但不限于3％、4％、5％、6％、7％、8％或9％，优选为5％。
49.优选地，所述流式分选中ngfr和itga9双阳性的细胞为睾丸管周肌样细胞，ngfr阳性且itga9阴性的细胞为leydig细胞。
50.作为优选的技术方案，所述分离纯化睾丸管周肌样细胞和leydig细胞的方法包括以下步骤：
51.(1)取睾丸组织，使用pbs漂洗，使用iv型胶原酶消化10～20min，使用80～120μm组织滤网去除未消化的睾丸组织，得到细胞悬液；
52.(2)离心所述细胞悬液并洗涤，使用封闭液孵育5～15min，然后于4℃加入抗ngfr蛋白抗体和抗itga9蛋白抗体孵育25～35min，洗涤，进行流式细胞分选。
53.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
54.(1)本发明中，基于itga9蛋白，能够有效区分睾丸管周肌样细胞和leydig细胞，从而解决了难以通过分步消化、差异贴壁和梯度离心等方法将两者分离的问题；
55.(2)本发明的分离方法，能够有效区分并分离睾丸管周肌样细胞和leydig细胞，分离纯化得到高纯度的leydig细胞以及高纯度的管周肌样细胞，且操作简单，成本低，对单种细胞的功能及病理生理过程的研究领域具有重要意义。
附图说明
56.图1为人睾丸组织中ngfr和itga9蛋白的免疫荧光染色图；
57.图2为人睾丸组织细胞悬液流式分选结果图；
58.图3为体外培养分离纯化的leydig细胞和睾丸管周肌样细胞的细胞形态图，比例尺为20μm；
59.图4为分离纯化的leydig细胞的免疫荧光染色图；
60.图5为分离纯化的睾丸管周肌样细胞的免疫荧光染色图。
具体实施方式
61.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
62.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
63.实施例1
64.本发明提供一种鉴定睾丸管周肌样细胞的试剂盒，所述试剂盒应包括：抗ngfr蛋白抗体(abcam，ab8874)、抗itga9蛋白的抗体(r&d，af3827)、驴抗兔igg二抗(donkey anti-rabbit igg(h+l)highly cross-adsorbed secondary antibody，alexa fluorplus 488，invitrogen，a32790)、驴抗羊igg二抗(donkey anti-goat igg(h+l)highly cross-adsorbed secondaryantibody，alexa fluor plus594，invitrogen，a32758)和含有5％牛
血清白蛋白(bsa)的pbs溶液。
65.实施例2
66.本实施例对人睾丸组织中ngfr和itga9蛋白进行免疫荧光染色，包括以下步骤：
67.1)组织石蜡包埋、切片：手术获得的新鲜睾丸组织立即放入4％多聚甲醛(paraformaldehyde，pfa)固定液中固定4h，然后使用80％乙醇、仲丁醇、石蜡梯度脱水，然后使用10mm
×
10mm
×
5mm模具和leica histocore arcadia c石蜡包埋机制作蜡块，过夜后按照5μm厚度切片；
68.2)石蜡切片复水：将石蜡切片置于60℃烘干箱中烤片5min，然后按照二甲苯ⅰ5min、二甲苯ⅱ5min、无水乙醇5min、90％乙醇5min、80％乙醇5min、70％乙醇5min、蒸馏水清洗两次的顺序复水。
69.3)免疫荧光染色：将上述复水后的切片使用柠檬酸钠抗原修复液在高压锅105℃进行抗原修复15min，待自然冷却后用含5％bsa的pbs封闭60min，之后按照1:200比例稀释一抗，孵育过夜，第二天用pbs漂洗切片3次，加入二抗，在暗室中孵育60min，再用pbs漂洗3次，于暗室用dapi室温染色5min，pbs漂洗3次，用封片剂封片，置于荧光显微镜下观察并拍照。
70.ngfr和itga9蛋白免疫荧光染色图如图1所示，itag9为仅显示itag9荧光，ngfr为仅显示ngfr荧光，mege为同时显示两种荧光，可发现ngfr同时表达于管周肌样细胞和leydig细胞，而itga9只表达于管周肌样细胞。
71.实施例3
72.本实施例提供一种分离纯化睾丸管周肌样细胞和leydig细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
73.(1)获取睾丸组织，进行pbs漂洗后，使用iv型胶原酶消化15min，使用100μm组织滤网去除未消化的睾丸组织，保留细胞悬液；
74.(2)300rpm离心3min并使用pbs洗涤所述细胞悬液2次后，使用实施例1试剂盒中封闭液孵育10min，然后在4℃使用实施例1试剂盒中抗ngfr蛋白抗体和抗itga9蛋白的抗体孵育30min，使用pbs洗涤后使用对应的二抗室温孵育30min，进行流式细胞分选，ngfr阳性且itga9阴性为leydig细胞(lc)，而ngfr和itga9双阳性细胞为管周肌样细胞(ptm)，得到高纯度的leydig细胞和高纯度的管周肌样细胞。
75.流式分选结果如图2所示，leydig细胞(ngfr阳性/itga9阴性)在睾丸细胞悬液中占比为0.78％。
76.实施例4
77.本实施例对实施例2分离得到的leydig细胞和管周肌样细胞进行培养和免疫荧光染色分析。
78.体外培养条件为：使用含10％fbs的d-f12培养基，含终浓度为10ng/ml促黄体生成素(recombinant human lh alpha/beta heterodimer protein,r&d,8899-lh)和1μg/ml 25-羟基胆甾醇(c27h46o2，sigma，2140-46-7)，37℃和5％co2培养箱培养，期间隔日半量换液。
79.leydig细胞(lc)形态和管周肌样细胞(ptm)形态如图3所示，可见两种细胞的形态完全不同，管周肌样细胞有自发成管生长倾向，说明分离得到高纯的leydig细胞和高纯度
的管周肌样细胞。
80.免疫荧光染色分析过程包括：制备leydig和管周肌样细胞爬片，待生长密度为80％时，用4％多聚甲醛固定15min，然后用pbs洗涤细胞两次，用含5％bsa的pbs封闭60min，之后按照1:200比例稀释一抗(hsd3b2：santa cruz，sc-515120；insl3：novus biologicals，nbp1-81223；nestin：novus biologicals，nb100-1604；sma：servicebio，gb111364；calponin1：servicebio，gb11954。)，孵育过夜，第二天用pbs漂洗切片3次，加入二抗，在暗室中孵育60min，再用pbs漂洗3次，于暗室用dapi室温染色5min，pbs漂洗3次，用封片剂封片，置于荧光显微镜下观察并拍照。
81.leydig细胞免疫荧光染色图如图4所示，细胞表达hsd3b2、insl3和nestin等leydig细胞特异蛋白，但不表达sma蛋白；管周肌样细胞免疫荧光染色图如图5所示，细胞表达sma和calponin1等肌细胞特异蛋白，上述结果进一步表明本发明能够分离出高纯度的leydig细胞以及高纯度的管周肌样细胞。
82.综上所述，本发明发现睾丸管周肌样细胞特异性表达itga9蛋白，基于该蛋白，制备鉴定睾丸管周肌样细胞的试剂盒，利用抗itga9蛋白抗体特异性识别结合管周肌样细胞，再通过如流式分析等方法可有效鉴定睾丸管周肌样细胞，此外，鉴定睾丸管周肌样细胞后即可将其与leydig细胞进行区分，进而能够有效分离两种细胞，解决了常规分步消化、差异贴壁和梯度离心等方法难以将两者分离的问题，能够分离纯化得到高纯度的leydig细胞以及高纯度的管周肌样细胞，可应用于对单种细胞的功能及病理生理过程的研究领域。
83.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。