一种快速检测抑菌物质活性的试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种快速检测抑菌物质活性的试剂盒及其应用。


背景技术：

2.目前，临床上出现大量耐药菌株，使有效抗菌药物越来越少，研发新的抗菌药物迫在眉睫。因此，大量的医药科研工作者投身于研发新的抗菌药物，而研发抗菌药物，必须要频繁的进行抑菌活性检测试验，目前研究中应用的抑菌活性检测方法比较费时费力，且需重复进行，不易标准化，在一定程度上增加了科研工作者的实验强度和难度。
3.关于抑菌活性试验方法有多种，定性试验多用平板法，例如琼脂打孔扩散法、牛津杯法、药敏试纸片法等。具体做法大体类似药敏试验k-b纸片扩散法，包括六大步骤：制备标准水解酪蛋白（m-h）琼脂培养基
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前18-24小时培养标准菌株，制备0.5麦氏浊度标准菌液
→
将标准菌液涂布在m-h琼脂培养基表面
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预孵育后在琼脂上打孔、插入牛津杯加入检测物质或将检测物质吸附到药敏试纸片上，将纸片贴到培养基表面
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待药物扩散10分钟后移入35℃恒温培养箱，培养18-24小时
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观察结果：通过观察孔或纸片周围是否出现透明抑菌圈，来判断待测物质对标准菌株是否有抑菌活性。采用这些常规的做法，意味着每次抑菌活性试验从准备标准菌株到具体实验操作完成，不包括后期培养，至少需要24-28小时，费时费力。另外该方法对操作者的操作技术要求也较高，尤其是各质控点的把控至关重要，例如制作培养基的厚度、标准菌液的调定、涂布的均匀与薄厚等，直接影响产生抑菌圈的大小，对于抑菌活性较低的物质有可能出现假阴性的结果。
4.上述抑菌活性试验的原理是孔内或纸片上的药物借助于m-h琼脂培养基中的水分向四周进行辐射状扩散，当周围扩散的药物浓度可以抑制标准菌株生长时，就会在一定范围内出现透明抑菌圈，抑菌圈边缘的药物浓度就是该药物的最低抑菌浓度，抑菌圈越大，说明待测物质的抑菌活性越强。
5.在实验过程中，有多个质控点直接影响抑菌圈的大小。m-h琼脂培养基的厚度要求为4mm，若太厚时，药液会更多的向下扩散，抑菌圈会变小；反之太薄时，药液会向更多的向四周扩散，抑菌圈会变大。标准菌液要求调定到0.5麦氏浊度，若菌液浓度太高，涂布菌膜必然较厚，抑菌圈会变小；反之菌液浓度太低，涂布菌膜必然较薄，抑菌圈会变大。操作者涂布标准菌株时要求转动60度从三个方向做密而不重的均匀涂布，最后转圈涂布1-2周，此操作需要熟练手法才能涂布均匀，菌膜薄厚适宜，否则过薄或过厚，都会直接影响抑菌圈的大小。
6.繁琐的实验步骤和要求较高的实验操作技术，一直困扰着医药研究者。因此一种简单、快速、可标准化的抑菌活性检测试剂盒是医药科研者所期盼的，尤其是对于非微生物研究领域的医药研发者，此需求更为迫切。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种快速检测抑菌物质活性的试剂盒及其应用，该试剂盒具有简单、快速、可标准化、灵敏性较高等优点，使用者只需通过打孔、加样和培养三步就可以轻松完成抑菌物质的活性检测，可大大降低使用者的常规工作强度和难度。
8.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种快速检测抑菌物质活性的试剂盒，包括标准菌株平板，所述标准菌株平板由琼脂培养基溶液和标准菌液混合后制成。
9.进一步地，所述标准菌液为临床药敏试验质控菌株。
10.进一步地，所述琼脂培养基溶液为营养琼脂培养基溶液或水解酪蛋白琼脂培养基溶液。
11.进一步地，所述标准菌株平板的制备方法，包括以下步骤：步骤1，配制琼脂培养基溶液；步骤2，将步骤1得到的琼脂培养基溶液进行高压蒸汽灭菌，冷却到45-50℃备用；步骤3，将标准菌株接种于血琼脂平板，35℃恒温箱培养18-24小时，取标准菌株菌落研磨于无菌生理盐水中，混匀，调定菌量为1.5
×
108cfu/ml；步骤4，将1ml步骤3制备的标准菌液加入到22-23ml步骤2得到的琼脂培养基溶液中，混合均匀；步骤5，将步骤4的混合培养基倾注于无菌平皿，水平静置，冷却后保藏于4℃冰箱。
12.更进一步地，步骤2中高压蒸汽灭菌的条件为121℃、15-20min。
13.进一步地，所述试剂盒还包括打孔器、阳性对照和阴性对照。
14.更进一步地，所述阳性对照为对标准菌株有抑制作用的抗生素溶液；所述阴性对照为无菌生理盐水。
15.本发明提供的试剂盒可以使抑菌物质活性检测省时省力，简单、快速、可标准化。使用者不需要操作技能培训，按照检测盒说明书进行简单操作即可完成检测工作。该试剂盒有以下有益效果：1. 操作简单快速：检测时从4℃冰箱取出试剂盒，在标准菌株平板上均匀打孔、加样后置于35℃恒温培养箱培养18-24小时，即可观察实验结果。
16.2. 检测结果可标准化：本试剂盒中标准菌株平板，从含菌量、厚度等方面均一致，打孔器孔径为6mm，待测物质加样量均为100微升，因此同批次检测试剂盒、检测平板的检测结果均一致。
17.3. 提高检测灵敏度：试剂盒的标准菌株平板中的标准菌液是均匀分布于培养基内部的，而不是传统的涂布到培养基表面，更适合琼脂打孔扩散法，因为孔内药品扩散之处均有菌，均可发挥抑菌活性，相比传统表面密集涂布菌株作用更均匀，灵敏性更高；另外若表面涂布菌量较大、较厚时会出现药物和菌量比例失衡而导致假阴性结果。
18.4. 标准菌株平板保质期可达6个月以上：由于试剂盒的标准菌株平板中的标准菌株是均匀分布于培养基内部的，可通过吸取培养基养分保存生命力，低温4℃冷藏可抑制其生长，经过试验，此标准菌株平板四周密封后在4℃冷藏箱可存活半年以上，若真空密封保存，时间会更长。
附图说明
19.图1为本发明标准菌株平板的示意图。
20.图2为采用传统平板法检测抑菌活性的结果。
21.图3为实施例1中抑菌物质活性快速定性检测的结果。
22.图4为实施例2中抑菌物质活性快速半定量检测的结果，图中1-8号孔为依次2倍比稀释的待测物质溶液。
23.图5为实施例3中筛选具有抑菌活性的细菌野生株的结果。
具体实施方式
24.针对现有抑菌活性试验方法存在的实验步骤繁琐、实验操作技术要求高等技术问题。本发明提供了一种快速检测抑菌物质活性的试剂盒，该试剂盒将标准菌液均匀混合于琼脂培养基制成标准菌株平板，不仅可使检测结果标准化、提高检测灵敏性，还可以有效克服抑菌活性试验过程中制作培养基的厚度、标准菌液的调定、涂布的均匀与薄厚等人为操作因素，还可有效缩短抑菌活性试验的时间，使用者只需通过打孔、加样和培养三步就可以轻松完成检测，可大大降低使用者的常规工作强度和难度。本发明的试剂盒主要应用于快速检测抑菌物质活性的医药研究领域，其次可以应用于研究筛查具有抑菌活性的细菌株。
25.本发明的试剂盒，包括标准菌株平板、打孔器及无菌牙签、阳性对照、阴性对照。试剂盒的核心组分是标准菌株平板，即指示菌平板，其制备方法也是本试剂盒的核心技术。试剂盒的具体组分及制备方法具体如下：一、组分构成说明1. 标准菌株平板2. 打孔器：选用直径为6mm的单孔琼脂打孔器，可耐受高温高压灭菌，独立包装，一个检测试剂盒提供一个。
26.3. 牙签：将牙签灭菌后独立包装，一个平板配置2支牙签即可。
27.4. 阳性对照：选用对标准菌株有抑制作用的抗生素溶液，如标准菌株为金黄色葡萄球菌质控菌株，则可配制一定浓度青霉素溶液作为阳性对照液，在标准菌株培养基上出现一定大小范围的透明抑菌圈。
28.5. 阴性对照：无菌生理盐水作为阴性对照液。
29.二、标准菌株平板的制备1. 标准菌株平板的原料如下：（1）标准菌株：选用临床药敏试验质控菌株，如革兰阳性菌常选用金黄色葡萄球菌质控菌株，革兰氏阴性菌常选用大肠埃希菌质控菌株；其它属种质控菌株均可选用。
30.（2）一次性无菌塑料平皿：从生产厂家直接购置，为直径9cm的一次性无菌塑料平皿。
31.（3）琼脂培养基：在本发明的一个实施例中选用从生产厂家直接购置m-h培养基干粉。
32.（4）无菌生理盐水：配制0.9% nacl 生理盐水，经121℃，15分钟高压蒸汽灭菌后使用。
33.2. 通过以下六步制备标准菌株平板：
（1）配制琼脂培养基溶液：按照购置的m-h琼脂培养基干粉用法用量，按照一定比例与蒸馏水配制成m-h琼脂培养基溶液。
34.（2）培养基高压灭菌：将调配好的m-h琼脂培养基溶液进行121℃、15-20min高压蒸汽灭菌，之后冷却到45-50℃备用。
35.（3）制备标准菌液：将标准菌株接种于血琼脂平板，35℃恒温箱培养18-24小时，取标准菌株菌落研磨于无菌生理盐水中，混匀，用分光光度计或标准麦氏比浊管调定到0.5麦氏浊度，菌量约为1.5
×
108cfu/ml。
36.（4）标准菌液与培养基混合：将制备的标准菌液1ml加入到22-23ml的已冷却待用的m-h琼脂培养基溶液中，立即混匀。
37.（5）倾注平板：将混匀的培养基尽快倾注于一次性无菌塑料平皿，置于水平面，待冷却后进行真空密封包装，保藏于4℃冰箱。此标准菌株平板保质期可达6个月以上。
38.（6）质检：制备好的标准菌株平板必须通过以下三步检验合格才能装入试剂盒出售。
39.①
外观检验：标准菌株平板呈固体平板状，培养基表面平整、光滑，均匀一致，呈半透明状；
②
标准菌株生长检验：将标准菌株平板置于35℃恒温箱培养18-24小时，观察标准菌株生长情况，若观察到培养基表面呈均匀的灰白色膜状生长，培养基内部呈均匀朦胧状，且无杂菌生长，则判为合格；
③
抑菌活性检验：在标准菌株平板上打2个孔，分别注入100微升阳性对照和阴性对照液，置于35℃恒温箱培养18-24小时，观察结果。若阳性对照孔周围出现透明抑菌圈，且直径在允许范围内，阴性对照孔周围无抑菌圈出现，则判为合格。
40.图1为标准菌株平板的示意图。
41.图2为采用传统平板法检测抑菌活性的结果，由图2可知，采用传统平板法会因标准菌液涂布不均匀致使生长的菌膜薄厚不均、抑菌圈边界不清难以测量直径；另外标准菌株分布于平板表面，孔中加药量需与平板齐平，且不要溢出孔外，这在具体操作时很难掌控，常常溢出导致孔周围出现一个药物扩散圈，从而影响抑菌圈的判断。
42.本发明提供的试剂盒可以实现两种用途：一是抑菌物质活性的快速检测，另一种是筛选具有抑菌活性的细菌株。
43.本发明试剂盒中标准菌株平板可根据混入标准菌株的不同，可有多种，科研中抑菌物质活性检测的指示菌通常为代表革兰阳性菌的金黄色葡萄球菌和代表革兰阴性菌的大肠埃希菌，因此应用本发明首先可以制成这两种标准菌株平板及相应试剂盒，也可将这两种标准菌液混匀制成混合标准菌株平板及相应试剂盒，检测物质是否能同时抑制革兰阳性菌代表和革兰阴性菌代表；另外可以根据科研工作者的需要，应用本发明技术定制其它标准菌株的平板，例如非发酵革兰阴性菌的代表铜绿假单胞菌和一些营养要求高的标准菌株如链球菌等。
44.本发明试剂盒中制备标准菌株平板可以用水解酪蛋白琼脂（m-h）培养基或营养琼脂培养基，适用于一般对营养要求不高的标准菌株；.若需特殊定制营养要求较高的标准菌株平板，需在m-h琼脂平板中加入血液，制成m-h血琼脂平板或营养血琼脂平板。
45.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明
的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
46.实施例1抑菌物质活性的快速定性检测具体方法步骤如下：（1）打孔：取标准菌株平板，在培养基表面用打孔器垂直打孔到底，用无菌牙签挑出孔内培养基。打孔包括检测孔、阳性对照孔和阴性对照孔，做好标记，一个平板内所有孔均匀分布。
47.（2）加样：用加样枪取待测物质溶液100微升加入到孔内，合上平板，静态扩散10分钟。
48.（3）培养：将平板水平移入35℃恒温培养箱，培养18-24小时。
49.参照阳性和阴性对照孔，观察检测孔周围是否有透明抑菌圈。如图3所示，如果检测孔周围有明显抑菌圈，表明待测物质对平板内标准菌株具有抑菌活性，为阳性，否则为阴性；同时可量取透明抑菌圈直径，来描述其抑菌活性强弱。
50.实施例2抑菌物质活性的快速半定量检测对于抑菌活性阳性的标本可进一步半定量检测其最低抑菌滴度。具体方法步骤如下：（1）稀释：将待测物质溶液用溶剂进行2倍比稀释，稀释梯度数量根据初始浓度和抑菌活性强弱而定。
51.（2）打孔：取标准菌株平板，四周均匀对称打孔作为检测孔，中间打2个阴、阳性对照孔，用无菌牙签取出孔内培养基，做好标记。检测孔数量视抑菌活性强弱而定，一般打6-8个。
52.（3）加样：用加样枪取各稀释溶液及阴、阳性对照液100微升加入到相应各孔内，合上平板，静态扩散10分钟。
53.（4）培养：将平板水平移入35-37℃恒温培养箱，培养18-24小时。
54.参照阳性和阴性对照孔，以出现透明抑菌圈的最低稀释滴度作为此法检测的最低抑菌滴度，如图4所示。
55.实施例3具有抑菌活性的菌株的筛选具体方法步骤如下：（1）将预检测物质用无菌生理盐水进行10倍稀释，一般稀释10-1-10-3
三个梯度，也可根据菌量调整稀释梯度。
56.（2）取三块标准菌株平板，取各稀释度溶液1ml分别加到三个平板表面，用无菌l型涂布棒涂布均匀。
57.（3）放入35℃恒温培养箱，培养18-24小时。
58.观察多数生长菌落分散存在在梯度平板进行抑菌圈观察，若生长菌落周围出现透明抑菌圈，则表明该菌生长分泌物对标准菌株有抑制作用，如图5所示。