1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于多孔凝胶阵列的细胞培养基质及其制备方法。
背景技术：
2.由于组织工程以及干细胞研究的蓬勃发展，为弥补传统二维单层细胞培养和动物模型存在的局限性，细胞体外三维培养技术成为这个领域新的研究热点之一。细胞在体内受到许多因素和作用的影响，从与细胞相互作用的角度出发，可以将细胞微环境大致分为不溶性大分子(如胶原i、层粘连蛋白、纤连蛋白及粘多糖等)、可溶性大分子(如生长因子，激酶，趋化因子等)和细胞间相互作用的蛋白(如钙粘素等)。这些具有不同性质的因素相互作用，共同维持细胞的正常形态和功能。通过逐步模拟这些因素尝试解构它们在细胞微环境中所起作用以及细胞在其中的行为。从最初的体外三维培养基质建立开始，研究者就尝试通过模拟细胞微环境中的一个或者几个要素，通过构建装置或者制备支架等方式来实现，并通过控制调节这些因素对细胞各种行为的影响。由于在体内细胞微环境中这些因素之间具有相互联系，因此，涉及的材料必须具备合适的物理学、化学和生物学特性，在这些因素的共同作用下使得细胞增殖，迁移分化等功能更接近在体内的状态。
3.凝胶材料能良好的模拟体内细胞基质的硬度，被广泛用作评价细胞对机智力学性质的相应剂组织工程应用的载体。目前用作细胞培养载体的水凝胶按组成来说分为3种:天然高分子水凝胶、定制水凝胶及合成高分子水凝胶。天然高分子水凝胶的材料来源于自然界,具有优越的生物相容性及较低的毒性。常用的天然材料水凝胶由多糖及蛋白类,比如明胶、壳聚糖、胶原蛋白及多肽等。然而这些天然材料水凝胶缺点是硬度域较窄,且其大多自身含有细胞结合位点,使得在研究力学性能对细胞行为的影响时,无法将硬度与粘附强度的影响区分开来。在作为细胞基质进行体外培养时，需要将其与其他材料复合。
4.申请号为cn201811085214.8的专利提供了一种以手性水凝胶作为贴壁细胞培养的三维培养体系，根据手性水凝胶良好的生物相容性，以海藻酸钠、透明质酸钠、壳聚糖等物质作为促凝剂而建立的贴壁细胞三维培养体系。申请号为cn202010488659.1的专利提供了一种基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型及其制备方法，该多细胞共培养模型包括多层定向纳米纤维膜和灌注到所述多层定向纳米纤维膜中成胶的三维多孔结构的gelma水凝胶。所述多层定向纳米纤维膜可利用静电纺丝技术制备。使用该多细胞共培养模型，在多层定向纳米纤维膜上接种一种细胞，在纤维水凝胶支架的上表面接种第二种细胞，在纤维水凝胶支架的下面接种第三种细胞，实现多种细胞的体外共培养。由上述现有技术可知，凝胶材料在用于细胞体外培养时可有效改善细胞的粘附性，促进细胞的增殖分化。
技术实现要素：
5.本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种基于多孔凝胶阵列的细胞培养基质及其制备方法，本发明以透明质酸钠作为基体，采用甲基丙烯酸酐
对其进行酯化修饰来改善基体的刚度，然后修饰rgd肽，改善细胞的附着增殖，本发明制得的细胞培养基质包括多个多孔凝胶阵列，用于细胞培养时可直接向多孔凝胶阵列注入细胞悬浮液进行培养，操作方便。
6.为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
7.一种基于多孔凝胶阵列的细胞培养基质的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)配制透明质酸钠溶液，在冰水浴下第一次滴加甲基丙烯酸酐，并加入氢氧化钠溶液调节反应体系的ph至8-9，在3-4℃下反应10-12h，然后第二次滴加甲基丙烯酸酐，加入氢氧化钠溶液调节反应体系的ph至8-9，继续反应20-24h，反应结束后加入过量的冰乙醇，之后离心处理，收集沉淀，将沉淀重新溶于去离子水中，之后冷冻干燥，制得甲基丙烯酸酯化透明质酸钠；
9.(2)将上述制得的甲基丙烯酸酯化透明质酸钠、重构rgd粘附肽和0.01mol/l的磷酸盐缓冲液混合搅拌处理，然后加入二硫苏糖醇混合均匀，制得凝胶原液；以装有微柱的聚二甲基硅氧烷为模板，对凝胶原液进行浇注成型，固化后，脱模处理，制得基于多孔凝胶阵列的细胞培养基质。
10.作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述透明质酸钠溶液的质量浓度为0.8-1.5wt％。
11.作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述氢氧化钠溶液的浓度为10mol/l。
12.作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，第一次滴加的甲基丙烯酸酐与透明质酸钠的摩尔比为1:10-11。
13.作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，第二次滴加的甲基丙烯酸酐与透明质酸钠的摩尔比为1:2-3。
14.作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述凝胶原液中甲基丙烯酸酯化的透明质酸钠的浓度为5-6wt％，重构bgd粘附肽的浓度为0.3-0.5mmol/l，二硫苏糖醇的质量浓度为5-6wt％。
15.作为上述技术方案的优选，所述模板上微柱的直径为400μm，高度为200μm，所述微柱的列数和行数均至少为6。
16.作为上述技术方案的优选，所述固化是采用400-410nm的紫外光照射处理30-90s。
17.由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
18.本发明以甲基丙烯酸酯化的透明质酸钠与重构rgd肽通过硫醇-烯反应，制得rgd修饰的透明质酸钠前体，然后浇注在带有微柱的聚二甲基硅氧烷模板上，经过交联固化反应产生具有刚度梯度的多孔凝胶阵列的细胞培养基质，该细胞培养基质上的多孔凝胶阵列尺寸稳定，便于细胞的聚集与附着。
19.本发明提供的基于多孔凝胶阵列的细胞培养基质，类似标准多孔板结构，用于细胞培养时可直接将细胞悬浮液注入到多孔凝胶阵列内，提高细胞的粘附和增殖。
具体实施方式
20.下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
21.实施例1
22.(1)配制100g浓度为1wt％的透明质酸钠溶液，在冰水浴下第一次滴加0.03mol甲基丙烯酸酐，并加入浓度为10mol/l氢氧化钠溶液调节反应体系的ph至8-9，在3℃下反应10h，然后第二次滴加0.007mol甲基丙烯酸酐，加入浓度为10mol/l氢氧化钠溶液调节反应体系的ph至8-9，继续反应20h，反应结束后加入过量的冰乙醇，之后离心处理，收集沉淀，将沉淀重新溶于去离子水中，之后在-80℃下冷冻干燥10h，制得甲基丙烯酸酯化透明质酸钠；
23.(2)将上述制得的甲基丙烯酸酯化透明质酸钠、重构rgd粘附肽和0.01mol/l的磷酸盐缓冲液混合搅拌处理，然后加入二硫苏糖醇混合均匀，制得凝胶原液；控制凝胶原液中甲基丙烯酸酯化的透明质酸钠的浓度为5wt％，重构bgd粘附肽的浓度为0.3mmol/l，二硫苏糖醇的质量浓度为5wt％，以装有微柱的聚二甲基硅氧烷为模板，对凝胶原液进行浇注成型，采用400nm的紫外光照射处理30s，脱模处理，制得基于多孔凝胶阵列的细胞培养基质。
24.实施例2
25.(1)配制100g浓度为1wt％的透明质酸钠溶液，在冰水浴下第一次滴加0.03mol甲基丙烯酸酐，并加入浓度为10mol/l氢氧化钠溶液调节反应体系的ph至8-9，在4℃下反应12h，然后第二次滴加0.007mol甲基丙烯酸酐，加入浓度为10mol/l氢氧化钠溶液调节反应体系的ph至8-9，继续反应24h，反应结束后加入过量的冰乙醇，之后离心处理，收集沉淀，将沉淀重新溶于去离子水中，之后在-80℃下冷冻干燥10h，制得甲基丙烯酸酯化透明质酸钠；
26.(2)将上述制得的甲基丙烯酸酯化透明质酸钠、重构rgd粘附肽和0.01mol/l的磷酸盐缓冲液混合搅拌处理，然后加入二硫苏糖醇混合均匀，制得凝胶原液；控制凝胶原液中甲基丙烯酸酯化的透明质酸钠的浓度为6wt％，重构bgd粘附肽的浓度为0.5mmol/l，二硫苏糖醇的质量浓度为6wt％，以装有微柱的聚二甲基硅氧烷为模板，对凝胶原液进行浇注成型，采用410nm的紫外光照射处理90s，脱模处理，制得基于多孔凝胶阵列的细胞培养基质。
27.实施例3
28.(1)配制100g浓度为1wt％的透明质酸钠溶液，在冰水浴下第一次滴加0.03mol甲基丙烯酸酐，并加入浓度为10mol/l氢氧化钠溶液调节反应体系的ph至8-9，在4℃下反应10h，然后第二次滴加0.007mol甲基丙烯酸酐，加入浓度为10mol/l氢氧化钠溶液调节反应体系的ph至8-9，继续反应20h，反应结束后加入过量的冰乙醇，之后离心处理，收集沉淀，将沉淀重新溶于去离子水中，之后在-80℃下冷冻干燥10h，制得甲基丙烯酸酯化透明质酸钠；
29.(2)将上述制得的甲基丙烯酸酯化透明质酸钠、重构rgd粘附肽和0.01mol/l的磷酸盐缓冲液混合搅拌处理，然后加入二硫苏糖醇混合均匀，制得凝胶原液；控制凝胶原液中甲基丙烯酸酯化的透明质酸钠的浓度为6wt％，重构bgd粘附肽的浓度为0.3mmol/l，二硫苏糖醇的质量浓度为6wt％，以装有微柱的聚二甲基硅氧烷为模板，对凝胶原液进行浇注成型，采用405nm的紫外光照射处理90s，脱模处理，制得基于多孔凝胶阵列的细胞培养基质。
30.实施例4
31.(1)配制100g浓度为1wt％的透明质酸钠溶液，在冰水浴下第一次滴加0.03mol甲基丙烯酸酐，并加入浓度为10mol/l氢氧化钠溶液调节反应体系的ph至8-9，在4℃下反应11h，然后第二次滴加0.007mol甲基丙烯酸酐，加入浓度为10mol/l氢氧化钠溶液调节反应体系的ph至8-9，继续反应21h，反应结束后加入过量的冰乙醇，之后离心处理，收集沉淀，将沉淀重新溶于去离子水中，之后在-80℃下冷冻干燥10h，制得甲基丙烯酸酯化透明质酸钠；
32.(2)将上述制得的甲基丙烯酸酯化透明质酸钠、重构rgd粘附肽和0.01mol/l的磷
酸盐缓冲液混合搅拌处理，然后加入二硫苏糖醇混合均匀，制得凝胶原液；控制凝胶原液中甲基丙烯酸酯化的透明质酸钠的浓度为5wt％，重构bgd粘附肽的浓度为0.35mmol/l，二硫苏糖醇的质量浓度为5wt％，以装有微柱的聚二甲基硅氧烷为模板，对凝胶原液进行浇注成型，采用405nm的紫外光照射处理50s，脱模处理，制得基于多孔凝胶阵列的细胞培养基质。
33.实施例5
34.(1)配制100g浓度为1wt％的透明质酸钠溶液，在冰水浴下第一次滴加0.03mol甲基丙烯酸酐，并加入浓度为10mol/l氢氧化钠溶液调节反应体系的ph至8-9，在4℃下反应10h，然后第二次滴加0.007mol甲基丙烯酸酐，加入浓度为10mol/l氢氧化钠溶液调节反应体系的ph至8-9，继续反应22h，反应结束后加入过量的冰乙醇，之后离心处理，收集沉淀，将沉淀重新溶于去离子水中，之后在-80℃下冷冻干燥10h，制得甲基丙烯酸酯化透明质酸钠；
35.(2)将上述制得的甲基丙烯酸酯化透明质酸钠、重构rgd粘附肽和0.01mol/l的磷酸盐缓冲液混合搅拌处理，然后加入二硫苏糖醇混合均匀，制得凝胶原液；控制凝胶原液中甲基丙烯酸酯化的透明质酸钠的浓度为5.5wt％，重构bgd粘附肽的浓度为0.4mmol/l，二硫苏糖醇的质量浓度为5.5wt％，以装有微柱的聚二甲基硅氧烷为模板，对凝胶原液进行浇注成型，采用405nm的紫外光照射处理50s，脱模处理，制得基于多孔凝胶阵列的细胞培养基质。
36.实施例6
37.(1)配制100g浓度为1wt％的透明质酸钠溶液，在冰水浴下第一次滴加0.03mol甲基丙烯酸酐，并加入浓度为10mol/l氢氧化钠溶液调节反应体系的ph至8-9，在4℃下反应12h，然后第二次滴加0.007mol甲基丙烯酸酐，加入浓度为10mol/l氢氧化钠溶液调节反应体系的ph至8-9，继续反应23h，反应结束后加入过量的冰乙醇，之后离心处理，收集沉淀，将沉淀重新溶于去离子水中，之后在-80℃下冷冻干燥10h，制得甲基丙烯酸酯化透明质酸钠；
38.(2)将上述制得的甲基丙烯酸酯化透明质酸钠、重构rgd粘附肽和0.01mol/l的磷酸盐缓冲液混合搅拌处理，然后加入二硫苏糖醇混合均匀，制得凝胶原液；控制凝胶原液中甲基丙烯酸酯化的透明质酸钠的浓度为5.5wt％，重构bgd粘附肽的浓度为0.45mmol/l，二硫苏糖醇的质量浓度为5.5wt％，以装有微柱的聚二甲基硅氧烷为模板，对凝胶原液进行浇注成型，采用405nm的紫外光照射处理70s，脱模处理，制得基于多孔凝胶阵列的细胞培养基质。
39.对比例
40.不修饰rgd粘附肽，其他条件和实施例6相同。
41.将上述实施例以及对比例中制得的细胞培养基质用于细胞培养时测试细胞粘附率，测试结果如表1所示。
42.表1
[0043] 细胞粘附率，％实施例143.5实施例243.2实施例342.9实施例443.2实施例543.5
实施例643.2对比例20.8
[0044]
从上述测试结果可以看出，修饰了rgd黏附肽后的基于多孔凝胶阵列的细胞培养基质用于细胞培养时，具有很好的细胞粘附性。
[0045]
此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。