一种促进山莨菪真叶部细胞同步分裂的方法及其培养基与流程

本发明属于山莨菪细胞的培养方法，具体的涉及一种促进山莨菪真叶部细胞同步分裂的方法及其培养基。

背景技术：

1、山莨菪俗称樟柳参,藏医音译唐冲那保,属茄科山莨菪属多年生草本植物,具有肉质粗大的主根。为青藏高原特有珍稀植物,生于海拔2200～4200m 的山坡、路旁、河滩、沟旁及避风向阳的山谷,在我国主要分布于西藏东部、青海、四川、云南西北部和甘肃等地。其全草含多种生物碱,主要含山莨菪碱、根含樟柳碱、莨菪碱、东莨菪碱、托品碱等生物碱。山莨菪作为传统的藏药,具有麻醉、解痉、镇痛、解磷中毒等多种功效；因此，如何进一步提高山莨菪细胞中的有效成分含量研究具有十分重要的作用。

2、目前，利用植物细胞原生质体融合技术是获得植物同源和异源多倍体的重要途径之一，该技术不仅能克服远源杂交不亲和的障碍，还能克服通过有性杂交诱导多倍体植物的麻烦，可有效地实现将目的基因导入到栽培植物中去，从而可获得具有多种优良性状的栽培植物新品种。

3、但如果进行融合的两个亲本细胞处于不同的细胞分裂时期，常常会造成原生质体不易产生融合体，从而导致山莨菪的植物细胞原生质体融合失败。目前还没有报道如何解决山莨菪这一问题的方法。

技术实现思路

1、本发明为了解决上述背景技术中的技术问题，提供一种促进山莨菪真叶部细胞同步分裂的方法及其培养基。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、本发明一方面提供了一种山莨菪愈伤组织培养基。所述山莨菪愈伤组织培养基以ms培养基为基本培养基，在ms培养基中添加包括以下含量组分：

4、1～3mg/l的二氯苯氧乙酸(2.4-d)、0.5～1mg/l的激动素kt、20～40g/l 的蔗糖、50～100mg/l的酵母多糖和100～300g/l的维生素c。

5、本发明的有益效果是：本发明的愈伤组织培养基能够有效的诱导山莨菪真叶部细胞的愈伤组织。

6、本发明还提供了一种山莨菪细胞的液体培养基，所述山莨菪细胞的液体培养基以改良n6培养基为基本培养基，在改良n6培养基中添加包括以下含量组分：

7、1～2mg/l的二氯苯氧乙酸(2.4-d)、0.5～1mg/l的6-苄氨基腺嘌呤 (6-ba)、50～150mg/l的水解络蛋白和100～300mg/l的亮氨酸；

8、所述改良n6培养基是指增加浓度为60～120mg/l的肌醇，增加浓度为 0.1～0.3mg/l的叶酸的培养基。

9、本发明的有益效果是，本发明的山莨菪细胞的液体培养基能够成功的让山莨菪愈伤组织分裂成细胞。

10、本发明还提供了一种山莨菪细胞同步分裂的培养基，所述山莨菪细胞同步分裂的培养基包括第一培养基、第二培养基和第三培养，其中：

11、所述第一培养基为在ms培养基的基础上添加0.5～1mg/l的6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)、1～2mg/l的萘乙酸(naa)、30～40g/l的半乳糖、1～3mg/l 的多效唑和0.5～2g/l甘油的液体培养基；

12、所述第二培养基为在b5培养基的基础上添加0.5～1.5mg/l的二氯苯氧乙酸(2.4-d)、1～2mg/l的萘乙酸(naa)、0.3～0.5mg/l的6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)、40～50g/l蔗糖和8～12g/l山梨醇的培养基；

13、所述第三培养基为在b5培养基的基础上添加1～3mg/l的二氯苯氧乙酸(2.4-d)、0.5～1mg/l的萘乙酸(naa)、0.3～0.5mg/l的6-苄氨基腺嘌呤 (6-ba)和20～40g/l蔗糖的培养基。

14、本发明的有益效果是，本发明的山莨菪细胞同步分裂的培养基能够让山莨菪细胞同步分裂，解决了进行融合的两个亲本细胞处于不同的细胞分裂时期，造成原生质体不易产生融合体的技术问题。

15、本发明还提供一种利用上述所述的培养基促进山莨菪真叶部细胞同步分裂的方法，包括如下步骤：

16、s1、由种子萌发生长10～14天的真叶为外植体，接入所述山莨菪愈伤组织培养基，在温度为20～24℃、无光照条件下进行愈伤组织诱导培养，得到山莨菪愈伤组织；

17、s2、取步骤s1中的山莨菪愈伤组织接入所述山莨菪细胞的液体培养基进行培养，得到山莨菪细胞；

18、s3、取20～40g/l的步骤s2中所述山莨菪细胞接入所述第一培养基中，然后再转接到所述第二培养基中培养，最后转接到所述第三培养基中培养，得到同步分裂的山莨菪细胞；

19、s4、取步骤s3中的所述同步分裂的山莨菪细胞，用滴管反复吹打混匀后，滴在冷冻干燥后的载玻片上，用改良苯酚品红染液染色，在显微镜下观察并计算出细胞的分裂指数。

20、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

21、进一步，在步骤s2中，所述山莨菪细胞的液体培养基采用每30天继代一次，连续继代3～5次，温度为20～26℃，每天光照6～10小时，光照强度为500～1000lx。

22、进一步，所述山莨菪细胞的液体培养基的摇床转速为100～200r/min。

23、进一步，在步骤s3中，所述第一培养基采用温度为1～3℃，无光照的条件下振荡培养20～24h；

24、所述第二培养基采用温度为5～9℃、无光照，振荡培养20～30h；

25、所述第三培养基采用温度为20～26℃、每天光照6～10小时和光照强度为500～1000lx的条件下振荡培养36～48h。

26、进一步，所述第一培养基采用的摇床转速为80～100r/min。

27、进一步，所述第二培养基采用的摇床转速为100～120r/min。

28、进一步，所述第三培养基采用的摇床转速为120～180r/min。

29、本发明的有益效果是，本发明的不仅能克服远源杂交不亲和的障碍，还能克服通过有性杂交诱导多倍体植物的麻烦，可有效地实现将目的基因导入到栽培植物中去，从而可获得具有多种优良性状的栽培植物新品种。且由于本发明能够促进山莨菪真叶部细胞同步分裂，所以能够避免进行融合的两个亲本细胞处于不同的细胞分裂时期，造成原生质体不易产生融合体的技术问题。另一方面，本发明在利用细胞培养方法生产细胞次生代谢物的过程中，通过采取添加适宜的诱导子可显著提高培养细胞中的次生代谢物的合成。处于不同分裂时期的细胞，对其添加的诱导子敏感性不同，因此在利用细胞培养方法生产其次生代谢物的过程中，需采用将培养的细胞调整到特定的细胞分裂期，再实施诱导子的添加，不仅可有效地提高对诱导子的使用效率，还可明显地促进培养细胞中的次生代谢物的合成。

30、本发明过程包括了利用山莨菪真叶为外植体诱导产生愈伤组织、山莨菪细胞液体培养和经三个处理环节促进山莨菪细胞完成同步分裂等过程；该方法操作可有效地促进处于不同分裂时期的山莨菪细胞调整到比较一致的特定细胞分裂期，从而可为后续深入地开展山莨菪细胞的生物技术研究，更好地促进山莨菪细胞中次生代谢物的合成提供细胞学理论基础。

31、ms培养基包括硝酸铵1650mg/l、硝酸钾1900mg/l、二水氯化钙800mg/l、七水硫酸镁370mg/l、磷酸二氢钾340mg/l、碘化钾0.83mg/l、硼酸9mg/l、四水硫酸锰22.3mg/l、七水硫酸锌8.6mg/l、二水钼酸钠0.25mg/l、五水硫酸铜0.025mg/l、六水氯化钴0.025mg/l、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l、七水硫酸亚铁27.8mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸1mg/l、盐酸硫胺素vb15.0mg/l、盐酸吡哆醇vb61.0mg/l、烟酸1mg/l和生物素vh 0.05mg/l。