背景技术：
：：1、cd40是一种位于细胞膜表面、分子量为50kd的共刺激蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(tnfr)家族，其在抗原呈递细胞(包括树突细胞、b细胞、单核细胞和巨噬细胞)中组成型地表达，也表达于其他多种细胞，例如内皮细胞、成纤维细胞、胸腺上皮细胞等。此外，还发现cd40在多种肿瘤细胞(例如慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、肾癌、肺癌等)中表达。cd40在细胞表面形成三聚体，相应配体cd40l(即cd154)主要表达于激活的t细胞表面。cd40和cd40l的相互作用是t细胞活化的共刺激信号。t细胞上cd40l与cd40的结合可以激活多种通路，包括nf-κb(核因子κb)信号通路。2、尽管诸如塞鲁单抗(selicrelumab)、达西组单抗(dacetuzumab)、apx005等的靶向cd40的激动型抗体在临床试验中显示出其在多种适应症中均有临床活性，但是这些激动型抗体与剂量限制性毒性的不良事件相关(hassan sb等人，anti-cd40-mediated cancerimmunotherapy:an update of recent and ongoing clinical trials.immunopharmacolimmunotoxicol 2014；36:96–104)。目前主要不良事件为肝毒性，这些激动型抗体在肝细胞表面非特异性激活表达cd40的免疫细胞，导致肝毒性，降低了治疗指数。3、人的cldn18基因具有两个不同的1号外显子，转录后经过可变剪接最终生成仅在n端具有不同序列的两个蛋白亚型cldn18.1和cldn18.2。两种cldn18亚型蛋白均由261个氨基酸组成，均具有四个跨膜结构域，但是两者分布于不同的组织，cldn18.1主要表达在肺组织中，cldn18.2仅表达在分化的胃粘膜上表皮细胞上，不表达在胃干细胞上(sahin,ugur,et al."claudin-18 splice variant 2 is a pan-cancer target suitable fortherapeutic antibody development."clinicalcancer research14.23(2008):7624-7634.)。cldn18.2在多种肿瘤组织中高度表达，比如非小细胞肺癌(25％)、胃癌(70％)、胰腺癌(50％)和食道癌(30％)，但是在正常组织中几乎没有表达(kumar,v.,et al.(2018)."emerging therapies in the management of advanced-stage gastric cancer."frontpharmacol 9:404)，由于其在肿瘤细胞和正常组织中的表达差异性，目前已经成为非常有潜力的一个抗肿瘤药物作用靶点。4、因此亟需开发一种靶向cldn18.2和cd40的双特异性抗体，以达到特异性杀伤肿瘤细胞且不引起肝毒性等不良事件，为癌症治疗提供更多的可能性。技术实现思路0、发明概述1、本发明公开了一种新的同时靶向cd40和cldn18.2的双特异性抗体、编码所述双特异性抗体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、采用所述双特异性抗体治疗与cd40和/或cldn18.2相关的疾病的方法，以及所述双特异性抗体在个体治疗、预防和/或诊断与cd40和/或cldn18.2相关疾病中的用途。该双特异性抗体能够实现病灶位置特异性高强度激活免疫细胞，而在不能形成交联效应的肝细胞等位置实现低激动活性，从而实现特异性杀伤肿瘤细胞而不引起肝毒性等不良事件。2、第一个方面，本发明提供了特异性结合cd40和cldn18.2的双特异性抗体(抗cd40×cldn18.2双特异性抗体)，其包含(i)抗cd40抗体或其片段，和(ii)抗cldn18.2抗体或其片段。在一个实施方案中，所述抗cldn18.2抗体或其片段是单结构域抗体(vhh)。3、在一个实施方案中，本发明提供了一种抗cd40×cldn18.2双特异性抗体，其包含：4、(i)结构为vh-ch1-fc-vhh的重链，和5、(ii)结构为vl-cl的轻链，6、其中vh和vl组合形成与cd40特异性结合的第一抗原结合部分，vhh形成与cldn18.2特异性结合的第二抗原结合部分，任选地，vhh通过接头与fc连接。7、在一个实施方案中，本发明提供了一种抗cd40×cldn18.2双特异性抗体，其包含：8、(i)结构为vh-ch1-fc-vhh的重链，和9、(ii)结构为vl-cl的轻链，10、其中11、所述vh包含如seq id no:11所含有的3个重链cdr，所述vl包含如seq id no:10所含有的3个轻链cdr，所述vhh包含如seq id no:18所含有的3个cdr；12、所述vh包含如seq id no:12所含有的3个重链cdr，所述vl包含如seq id no:10所含有的3个轻链cdr，所述vhh包含如seq id no:18所含有的3个cdr；13、所述vh包含如seq id no:13所含有的3个重链cdr，所述vl包含如seq id no:10所含有的3个轻链cdr，所述vhh包含如seq id no:18所含有的3个cdr；或者14、所述vh包含如seq id no:14所含有的3个重链cdr，所述vl包含如seq id no:10所含有的3个轻链cdr，所述vhh包含如seq id no:18所含有的3个cdr。15、在另一个实施方案中，本发明提供了一种抗cd40×cldn18.2双特异性抗体，其包含：16、(i)结构为vh-ch1-fc-vhh的重链，和17、(ii)结构为vl-cl的轻链，18、其中19、所述vh包含如seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6所示的3个重链cdr，所述vl包含如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3所示的3个轻链cdr，所述vhh包含如seqid no:15、seq id no:16、seq id no:17所示的3个cdr；20、所述vh包含如seq id no:4、seq id no:5、seq id no:7所示的3个重链cdr，所述vl包含如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3所示的3个轻链cdr，所述vhh包含如seqid no:15、seq id no:16、seq id no:17所示的3个cdr；21、所述vh包含如seq id no:4、seq id no:5、seq id no:8所示的3个重链cdr，所述vl包含如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3所示的3个轻链cdr，所述vhh包含如seqid no:15、seq id no:16、seq id no:17所示的3个cdr；或者22、所述vh包含如seq id no:4、seq id no:5、seq id no:9所示的3个重链cdr，所述vl包含如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3所示的3个轻链cdr，所述vhh包含如seqid no:15、seq id no:16、seq id no:17所示的3个cdr。23、在再一个实施方案中，本发明提供了一种抗cd40×cldn18.2双特异性抗体，其包含：24、(i)结构为vh-ch1-fc-vhh的重链，和25、(ii)结构为vl-cl的轻链，26、其中27、所述vh包含来自seq id no:11所含有的3个重链cdr且与seq id no:11具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列，所述vl包含来自seq id no:10所含有的3个轻链cdr且与seq id no:10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列，所述vhh包含来自seq id no:18所含有的3个cdr且与seq id no:18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列；28、所述vh包含来自seq id no:12所含有的3个重链cdr且与seq id no:12具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列，所述vl包含来自seq id no:10所含有的3个轻链cdr且与seq id no:10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列，所述vhh包含来自seq id no:18所含有的3个cdr且与seq id no:18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列；29、所述vh包含来自seq id no:13所含有的3个重链cdr且与seq id no:13具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列，所述vl包含来自seq id no:10所含有的3个轻链cdr且与seq id no:10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列，所述vhh包含来自seq id no:18所含有的3个cdr且与seq id no:18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列；或者30、所述vh包含来自seq id no:14所含有的3个重链cdr且与seq id no:14具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列，所述vl包含来自seq id no:10所含有的3个轻链cdr且与seq id no:10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列，所述vhh包含来自seq id no:18所含有的3个cdr且与seq id no:18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。31、在一个实施方案中，本发明提供了一种抗cd40×cldn18.2双特异性抗体，其包含：32、(i)结构为vh-ch1-fc-vhh的重链，和33、(ii)结构为vl-cl的轻链，34、其中35、所述vh包含如seq id no:11所示的序列，所述vl包含如seq id no:10所示的序列，所述vhh包含如seq id no:18所示的序列；36、所述vh包含如seq id no:12所示的序列，所述vl包含如seq id no:10所示的序列，所述vhh包含如seq id no:18所示的序列；37、所述vh包含如seq id no:13所示的序列，所述vl包含如seq id no:10所示的序列，所述vhh包含如seq id no:18所示的序列；或者38、所述vh包含如seq id no:14所示的序列，所述vl包含如seq id no:10所示的序列，所述vhh包含如seq id no:18所示的序列。39、在以上任一个实施方案中，本发明抗cd40×cldn18.2双特异性抗体中的单结构域抗体(vhh)是骆驼科动物vhh、部分人源化的或完全人源化的vhh、嵌合的vhh。40、在以上任一个实施方案中，本发明抗cd40×cldn18.2双特异性抗体的vhh通过接头与fc连接，所述接头可以是本领域已知或者将来获得的任何通用的柔性序列，通常是短的柔性氨基酸序列，在一个具体实施方案中，所述接头是(g4s)n，其中n是等于或大于1的整数，例如，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9的整数；gggsg；ggsgg；gsggg；sgggg；ggtgs；gtspgg；gngggs；g4s-ggsgg-g4s-sgggg；ggg；dgggs；tgekp；ggrr；egkssgsgseskvd；kesgsvsseqlaqfrsld；ggrrgggs；lrqrdgerp；lrqkdgggserp；gstsgsgkpgsgegstkg等。在一个具体实施方案中，接头选自(g4s)3。41、在以上任一个实施方案中，本发明抗cd40×cldn18.2双特异性抗体的fc区可以选自现有技术中已知的任何igg类抗体的天然fc区，例如共有或者胚系igg fc区。在一个具体实施方案中，igg fc区可以是来自不同igg亚类的fc区，例如来自igg1、igg2、igg3和igg4的fc区。在一个具体实施方案中，igg fc区是igg1的fc序列。在另一个的实施方案中，igg fc区可以包含突变/修饰，以实现稳定抗体的作用，或减弱fcγriib依赖的交联效应以避免出现肝毒性，例如现有技术中已知的那些修饰。在一个具体实施方案中，本发明的双特异抗cd40×cldn18.2抗体经修饰以包含无交联效应的恒定区。例如，通过将fc区中的糖基化位点n297残基突变成gly、ala、gln、asp或glu等，可以减小或消除本发明抗cd40×cldn18.2双特异性抗体的fcγriib依赖的交联效应。在一个优选的实施方案中，本发明的抗cd40×cldn18.2双特异性抗体的fc区包含n297q突变，以降低与fc受体的结合。42、在一个实施方案中，本发明抗cd40×cldn18.2双特异性抗体的轻链恒定结构域cl来自κ或λ。43、在一个实施方案中，本发明提供了一种抗cd40×cldn18.2双特异性抗体，其包含：44、(i)结构为vh-ch1-fc-vhh的重链，和45、(ii)结构为vl-cl的轻链，46、其中47、所述重链包含来自seq id no:19所含有的3个重链cdr和3个vhh所含有的cdr且与seq id no:19具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列，所述轻链包含来自seq id no:23所含有的3个轻链cdr且与seq id no:23具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列；48、所述重链包含来自seq id no:20所含有的3个重链cdr和3个vhh所含有的cdr且与seq id no:20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列，所述轻链包含来自seq id no:23所含有的3个轻链cdr且与seq id no:23具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列；49、所述重链包含来自seq id no:21所含有的3个重链cdr和3个vhh所含有的cdr且与seq id no:21具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列，所述轻链包含来自seq id no:23所含有的3个轻链cdr且与seq id no:23具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列；或者50、所述重链包含来自seq id no:22所含有的3个重链cdr和3个vhh所含有的cdr且与seq id no:22具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列，所述轻链包含来自seq id no:23所含有的3个轻链cdr且与seq id no:23具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。51、在一个实施方案中，本发明提供了一种抗cd40×cldn18.2双特异性抗体，其包含：52、(i)结构为vh-ch1-fc-vhh的重链，和53、(ii)结构为vl-cl的轻链，54、其中55、所述重链包含如seq id no:19所示的序列，所述轻链包含如seq id no:23所示的序列；56、所述重链包含如seq id no:20所示的序列，所述轻链包含如seq id no:23所示的序列；57、所述重链包含如seq id no:21所示的序列，所述轻链包含如seq id no:23所示的序列；或者58、所述重链包含如seq id no:22所示的序列，所述轻链包含如seq id no:23所示的序列。59、在一个实施方案中，本发明的抗cd40×cldn18.2双特异性抗体能够增强对抗原的免疫应答，且诱导对表达cd40的细胞(例如，表达cd40的肿瘤细胞)、对表达cldn18.2的细胞(例如，表达cldn18.2的肿瘤细胞)的抗体依赖性细胞毒性。60、第二个方面，本发明还提供了编码本发明抗cd40×cldn18.2双特异性抗体的多核苷酸(核酸)、包含所述多核苷酸的载体，优选地表达载体。61、第三个方面，本发明提供了包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是本领域通用的原核细胞和真核细胞。62、第四个方面，本发明提供了一种用于产生本发明抗cd40×cldn18.2双特异性抗体的方法，包括步骤(i)在适于表达本发明抗cd40×cldn18.2双特异性抗体的条件下培养本发明的宿主细胞，任选地，(ii)回收本发明的抗cd40×cldn18.2双特异性抗体。63、第五个方面，本发明提供了一种包含本发明抗cd40×cldn18.2双特异性抗体的免疫缀合物、试剂盒、药物组合物、组合产品或制品。在一个实施方案中，本发明提供的药物组合物、组合产品或制品还包含其它治疗剂，以及任选的药用辅料；优选地，所述其它治疗剂选自化疗剂、细胞毒性剂。64、第六个方面，本发明提供了本发明抗cd40×cldn18.2双特异性抗体、免疫缀合物、试剂盒、药物组合物、组合产品或制品的用途，用于治疗、预防和/或诊断与cd40相关的疾病，与cldn18.2相关的疾病。在一个实施方案中，与cd40相关的疾病例如是cd40表达异常的癌症。在一个实施方案中，与cldn18.2相关的疾病例如是cldn18.2表达异常的癌症。65、在一个实施方案中，本发明提供了第一至第三方面和第五方面所述的抗cd40×cldn18.2双特异性抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞、免疫缀合物、试剂盒、药物组合物、组合产品或制品在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防和/或诊断与cd40相关的疾病，与cldn18.2相关的疾病。66、第七个方面，本发明提供了治疗与cd40相关的疾病的方法，治疗与cldn18.2相关的疾病的方法，包括将治疗有效量的本发明的抗cd40×cldn18.2双特异性抗体，或本发明的免疫缀合物、药物组合物、组合产品或制品施用给有需要的患者。在一个实施方案中，与cd40相关的疾病例如是cd40表达异常的癌症。在一个实施方案中，与cldn18.2相关的疾病例如是cldn18.2表达异常的癌症。当前第1页12当前第1页12