一种三基因联合检测的FISH探针组合及其应用的制作方法

一种三基因联合检测的fish探针组合及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种三基因联合检测的fish探针组合及其应用。


背景技术：

2.高级别b细胞淋巴瘤伴随着myc、bcl-2和bcl-6基因易位，其遗传学特征为同时存在myc和bcl-2(或bcl-6)的基因重排(双打击)，或同时存在myc、bcl-2和bcl-6基因重排(三打击)。其治疗有别于传统b细胞淋巴瘤，对传统化疗不敏感，加强r-chop效果不理想。三靶标的b细胞淋巴瘤代表一类独立的病理亚型。随着精准诊断与分子靶向治疗的需求，myc抑制剂(如pi3k激酶抑制剂等)、bcl2小分子抑制剂和bcl6抑制剂的研究都在陆续开展。检测这三个靶标有助于判断患者预后效果并选择治疗方式。
3.荧光原位杂交(fish，fluorescence in situ hybridization)属于细胞遗传学检测方法，基于核酸杂交，通过被标记的核酸探针与固定于固相载体上的样本核酸进行原位杂交，在合适的光源激发下，进行镜下信号识别，完成基因异常的检测。fish通过滤块与不同荧光基团实现多色检测。淋巴瘤三打击靶标的fish检测中一般使用三组双色探针分别用于myc、bcl2和bcl6基因的重排检测，一般采用连续三张切片，分别杂交不同探针，观察每一个样本区一种探针的检测状况，进行综合判断。
4.fish常用荧光素包括红、绿双色，可以通过三通或双通滤块直接观察信号。多色fish(m-fish)最多可以进行四色检测(红、绿、青和金)，但青色基团(如香豆素)易淬灭，金色基团商品化厂家较少，临床应用并不广泛。另外，由于激发/发射光谱较宽，缺少合适的滤块组件，无法同时在一个视野中观察四色信号。
5.因此，如何实现对多组探针同时进行判读，进而对多基因进行快速检测，已成为亟待解决的问题。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种三基因联合检测的fish探针组合及其应用，通过对其中一种探针同时使用红色荧光素和绿色荧光素标记，混合后呈现黄色，从而实现在单个滤光镜下完成三基因的联合检测，操作简单，检测用时更短，效率更高。
7.为达此目的，本发明采用如下技术方案：
8.第一方面，本发明提供了一种三基因联合检测的fish探针组合，所述三基因联合检测的fish探针组合同时检测myc基因、bcl-2基因和bcl-6基因的易位情况；
9.其中，检测myc基因的探针、检测bcl-2基因的探针和检测bcl-6基因的探针的荧光素标记方式均不同，所述荧光素标记方式包括使用红色荧光素标记、使用绿色荧光素标记或同时使用红色荧光素和绿色荧光素标记中的任意一种。
10.本发明中，对其中一种探针同时使用红色荧光素和绿色荧光素标记，混合后呈现黄色，从而实现了在单张样本上对三组探针进行同时判读，从而对myc基因、bcl-2基因和
bcl-6基因的状态进行低成本的快速检测，提升了检测的靶标通量；在单个滤光镜下即可完成三基因的信号判读，操作更简单，检测更迅速，效率更高，同时降低了临床检测成本；检测结果与预期相符，灵敏度和特异性极好。
11.优选地，所述检测myc基因的探针的制备模板包括rp11-524d19、rp11-1039b2、ctd-2533c10、rp11-440n18、ctd-2205h22、rp11-55j15、ctd-2160f24和rp11-485i14克隆质粒。
12.优选地，所述检测bcl-2基因的制备模板包括ctd-2145c18、rp11-280c1、ctd-2270p21、ctd-2166h2和rp11-977f4克隆质粒。
13.优选地，所述检测bcl-6基因的探针的制备模板包括rp11-1058l21、rp11-58m14、rp11-116n23、rp11-465m10、rp11-44h4和rp11-464d9克隆质粒。
14.优选地，所述荧光素标记在dutp。
15.优选地，所述红色荧光素包括tritc。
16.优选地，所述绿色荧光素包括fluorescein。
17.第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的三基因联合检测的fish探针组合的制备方法，所述制备方法包括：
18.分别将探针的制备模板与缓冲液、dntps、荧光素标记的dutp、dna聚合酶以及dnasei混合，标记后，得到所述三基因联合检测的fish探针组合。
19.优选地，同时使用红色荧光素和绿色荧光素标记的探针的反应体系中，fluorescein标记的dutp与tritc标记的dutp的物质的量比为(1.3～1.5):1，例如可以是1.3:1、1.35:1、1.4:1、1.45:1或1.5:1等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
20.本发明中，对同时使用红色荧光素和绿色荧光素标记的探针的制备方法进行改进，使探针的黄色信号更加均一。实验结果显示，对探针进行双荧光素混合标记的效果优于对探针分别进行单荧光素标记后再混合，fluorescein标记的dutp与tritc标记的dutp的物质的量比例在(1.3～1.5):1的范围内时，黄色信号更加清晰明确，检测效果更好。
21.第三方面，本发明提供了一种三基因联合检测的fish试剂盒，所述三基因联合检测的fish试剂盒包括第一方面所述的三基因联合检测的fish探针组合。
22.优选地，所述三基因联合检测的fish试剂盒还包括杂交缓冲液、通透剂、消化剂以及原位杂交染色液。
23.优选地，所述杂交缓冲液包括柠檬酸钠缓冲液(ssc)。
24.由于fish探针中的荧光素标记具有随机掺入的特性，在杂交时探针会竞争性杂交，因而导致核酸杂交信号均一性差。本发明中的杂交缓冲液增加了体系的稳定性，促使体系均一，改善了杂交的效果。
25.优选地，所述四乙酸在所述通透剂中的质量分数为1.5％～3％，例如可以是1.5％、2％、2.5％或3％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
26.优选地，所述聚乙二醇在所述通透剂中的质量分数为6％～8％，例如可以是6％、6.5％、7％、7.5％或8％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
27.优选地，所述吐温在所述通透剂中的质量分数为1％～3％，例如可以是1％、1.5％、2％、2.5％或3％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
28.作为优选技术方案，以质量分数计，本发明所述通透剂包括四乙酸1.5％～3％、聚乙二醇6％～8％和吐温1％～3％。
29.本发明中，使用通透剂对样本进行预处理，增加了样本的通透性，提升了杂交及染色的效果；与传统高温煮片的预处理方法相比，可以避免高温导致的核裂解或核酸断裂，改善了信噪比，提升了检测的灵敏度和准确性。
30.优选地，所述消化剂包括胃蛋白酶。
31.第四方面，本发明提供一种第三方面所述的三基因联合检测的fish试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，所述使用方法包括：
32.使用消化剂对样本进行消化，加入三基因联合检测的fish探针组合进行变性和杂交，再进行染色，观察。
33.优选地，所述消化剂的终浓度为3～5mg/ml，例如可以是3mg/ml、3.5mg/ml、4mg/ml、4.5mg/ml或5mg/ml等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
34.优选地，所述消化剂消化的时间为5～8min，例如可以是5min、5.5min、6min、6.5min、7min、7.5min或8min等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
35.优选地，所述三基因联合检测的fish探针组合的终浓度为10～20ng/μl，例如可以是10ng/μl、11ng/μl、12ng/μl、13ng/μl、14ng/μl、15ng/μl、16ng/μl、17ng/μl、18ng/μl、19ng/μl或20ng/μl等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
36.优选地，所述变性的条件为75～90℃孵育2～8min，温度例如可以是75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃或90℃等，时间例如可以是2min、2.5min、3min、3.5min、4min、4.5min、5min、5.5min、6min、6.5min、7min、7.5min或8min等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
37.优选地，所述杂交的条件为36.5～37.5℃孵育4～8h，温度例如可以是36.5℃、37℃或37.5℃等，时间例如可以是4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h、7.5h或8h等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
38.优选地，所述使用方法还包括使用通透剂进行通透的步骤。
39.优选地，所述通透的时间为3～8min，例如可以是3min、3.5min、4min、4.5min、5min、5.5min、6min、6.5min、7min、7.5min或8min等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
40.作为优选技术方案，本发明所述的三基因联合检测的fish试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，包括：
41.向样本中加入通透剂，孵育3～8min；
42.使用终浓度为3～5mg/ml的胃蛋白酶消化5～8min，洗涤；
43.加入终浓度为10～20ng/μl的三基因联合检测的fish探针组合以及杂交缓冲液，75～90℃变性2～8min，再36.5～37.5℃杂交4～8h，去除未杂交的探针；
44.使用原位杂交染色液进行染色，观察。
45.第五方面，本发明提供了一种三基因联合检测的装置，所述三基因联合检测的装置同时检测myc基因、bcl-2基因和bcl-6基因的易位情况；
46.所述三基因联合检测的装置包括：
47.预处理模块：对样本进行通透及消化；
48.杂交模块；使用三基因联合检测的fish探针组合对样本进行变性及杂交；
49.显色及分析模块：使用原位杂交染色液对杂交后的样本进行染色，并进行分析。
50.第六方面，本发明提供第一方面所述的三基因联合检测的fish探针组合、第三方面所述的三基因联合检测的fish试剂盒或第五方面所述的三基因联合检测的装置中的任意一种或至少两种的组合在制备三基因联合检测产品中的应用。
51.优选地，所述三基因联合检测产品同时检测myc基因、bcl-2基因和bcl-6基因的易位情况。
52.相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
53.(1)本发明通过对探针的标记方式进行改进，实现了在单个样本上对三组探针进行同时判读，提升了检测的通量，操作也更加简便，用时更短，效率更高，成本更低；
54.(2)本发明对同时使用红色荧光素和绿色荧光素标记的探针的制备方法进行改进，使用双荧光素同时进行混合标记，并优化绿红荧光素之间的比例，探针的黄色信号更加均一，图像也更加清晰，便于观察；
55.(3)本技术使用通透剂对样本进行预处理，避免了传统高温煮片对样本核酸的破坏，提高了信噪比，检测的灵敏度与特异性也得到了提升；
56.(4)使用本发明中的fish探针组合对样本进行检测，结果符合预期，准确性和特异性达到100％，与常规双色断裂探针进行对比，检测准确度更高。
附图说明
57.图1a为测试例1中使用实施例4制备的三基因联合检测的fish试剂盒的染色结果图片(放大倍数为1000
×
)；
58.图1b为测试例1中使用实施例5制备的三基因联合检测的fish试剂盒的染色结果图片(放大倍数为1000
×
)；
59.图1c为测试例1中使用实施例6制备的三基因联合检测的fish试剂盒的染色结果图片(放大倍数为1000
×
)；
60.图2a为测试例2中使用实施例4制备的三基因联合检测的fish试剂盒对人外周血培养细胞染色的结果图片(放大倍数为1000
×
)；
61.图2b为测试例2中使用实施例4制备的三基因联合检测的fish试剂盒对组织切片样本染色的结果图片(放大倍数为1000
×
)；
62.图2c为测试例2中使用对比例2中的myc基因断裂检测探针对人外周血培养细胞染色的结果图片(放大倍数为1000
×
)；
63.图2d为测试例2中使用对比例2中的myc基因断裂检测探针对组织切片样本染色的结果图片(放大倍数为1000
×
)；
64.图2e为测试例2中使用对比例2中的bcl-2基因断裂检测探针对人外周血培养细胞染色的结果图片(放大倍数为1000
×
)；
65.图2f为测试例2中使用对比例2中的bcl-2基因断裂检测探针对组织切片样本染色的结果图片(放大倍数为1000
×
)；
66.图2g为测试例2中使用对比例2中的bcl-6基因断裂检测探针对人外周血培养细胞
染色的结果图片(放大倍数为1000
×
)；
67.图2h为测试例2中使用对比例2中的bcl-6基因断裂检测探针对组织切片样本染色的结果图片(放大倍数为1000
×
)；
68.图3a为测试例3中使用传统方法预处理后的样本的染色结果图片(放大倍数为1000
×
)；
69.图3b为测试例3中使用通透剂预处理后的样本的染色结果图片(放大倍数为1000
×
)；
70.图4a为测试例4中myc阳性样本的检测结果图片(放大倍数为1000
×
)；
71.图4b为测试例4中myc阳性样本的检测结果图片(放大倍数为1000
×
)；
72.图4c为测试例4中bcl2阳性样本的检测结果图片(放大倍数为1000
×
)；
73.图4d为测试例4中bcl2阳性样本的检测结果图片(放大倍数为1000
×
)；
74.图4e为测试例4中bcl6阳性样本的检测结果图片(放大倍数为1000
×
)；
75.图4f为测试例4中bcl6阳性样本的检测结果图片(放大倍数为1000
×
)。
具体实施方式
76.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
77.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
78.实施例1
79.本实施例提供一种三基因联合检测的fish探针组合，所述三基因联合检测的fish探针组合同时检测myc基因、bcl-2基因和bcl-6基因的易位情况；
80.其中，检测myc基因的探针、检测bcl-2基因的探针和检测bcl-6基因的探针的荧光素标记方式均不同，检测myc基因的探针使用红色荧光素标记，检测bcl-2基因的探针使用绿色荧光素标记，检测bcl-6基因的探针同时使用红色荧光素和绿色荧光素标记。
81.其中，检测myc基因的探针的制备体系如下：
82.[0083][0084]
其中，dna模板由rp11-524d19、rp11-1039b2、ctd-2533c10、rp11-440n18、ctd-2205h22、rp11-55j15、ctd-2160f24和rp11-485i14克隆质粒(购自invitrogen)组成，按常规流程进行质粒提取，od260/280》1.9。探针长度约1.4mbp(chr8:127,995,358-129,396,342，grch37/hg19)。
[0085]
质粒标记后使用醋酸钠沉淀核酸，高速离心后获得标记探针。探针使用5μl纯化水复溶，测定浓度，避光保存。
[0086]
检测bcl-2基因的探针的制备体系如下：
[0087][0088]
[0089]
其中，dna模板由ctd-2145c18、rp11-280c1、ctd-2270p21、ctd-2166h2和rp11-977f4克隆质粒(购自invitrogen)组成，按常规流程进行质粒提取，od260/280》1.9。探针长度约768kbp(chr18:60,531,844-61,300,107，grch37/hg19)。
[0090]
质粒标记后使用醋酸钠沉淀核酸，高速离心后获得标记探针。探针使用5μl纯化水复溶，测定浓度，避光保存。
[0091]
检测bcl-6基因的探针的制备体系如下：
[0092][0093]
其中，dna模板由rp11-1058l21、rp11-58m14、rp11-116n23、rp11-465m10、rp11-44h4和rp11-464d9克隆质粒(购自invitrogen)组成，按常规流程进行质粒提取，od260/280》1.9。探针长度约858kbp(chr3:187,010,704-187,869,346，grch37/hg19)。
[0094]
质粒标记后使用醋酸钠沉淀核酸，高速离心后获得标记探针。探针使用5μl纯化水复溶，测定浓度，避光保存。
[0095]
上述过程中，fluorescein(荧光素)标记的dutp购自roche(货号11373242910)，tritc(四甲基罗丹明)标记的dutp购自roche(货号11534378910)，dnasei购自neb(货号m0303)，dna聚合酶i购自neb(货号m0209)。
[0096]
实施例2
[0097]
本实施例提供一种三基因联合检测的fish探针组合，与实施例1的区别仅在于，检测bcl-6基因的探针的制备体系不同，其余材料及制备方法均与实施例1相同。
[0098]
本实施例中，检测bcl-6基因的探针的制备体系如下：
[0099][0100][0101]
实施例3
[0102]
本实施例提供一种三基因联合检测的fish探针组合，与实施例1的区别仅在于，在制备bcl-6基因的探针时，分别使用fluorescein标记的dutp和tritc标记的dutp对探针进行标记，再进行混合，其余材料及制备方法均与实施例1相同。
[0103]
检测bcl-6基因的探针(a组分)的制备体系如下：
[0104][0105]
检测bcl-6基因的探针(b组分)的制备体系如下：
[0106][0107][0108]
实施例4
[0109]
本实施例提供一种三基因联合检测的fish试剂盒，所述三基因联合检测的fish试剂盒包括实施例1中的三基因联合检测的fish探针组合、杂交缓冲液、通透剂、消化剂以及原位杂交蓝染染色液(购自广州安必平医药科技股份有限公司)；
[0110]
其中，所述杂交缓冲液为柠檬酸钠缓冲液；
[0111]
以质量分数计，所述通透剂含有四乙酸2％、聚乙二醇7％和吐温2％，余量为水；
[0112]
所述消化剂为胃蛋白酶(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。
[0113]
其中，三基因联合检测的fish探针组合溶于柠檬酸钠缓冲液中，制成杂交液，杂交液中，检测myc基因的探针的浓度为10ng/μl，检测bcl-2基因的探针的浓度为16ng/μl，检测bcl-6基因的探针的浓度为20ng/μl。
[0114]
实施例5
[0115]
本实施例提供一种三基因联合检测的fish试剂盒，与实施例4的区别仅在于，使用实施例2中的三基因联合检测的fish探针组合替换实施例1中的三基因联合检测的fish探针组合，其余材料及条件与实施例4相同。
[0116]
实施例6
[0117]
本实施例提供一种三基因联合检测的fish试剂盒，与实施例4的区别仅在于，使用实施例3中的三基因联合检测的fish探针组合替换实施例1中的三基因联合检测的fish探针组合，其中，采用a组分制备的探针的浓度为16ng/μl，采用b组分制备的探针的浓度为10ng/μl，其余材料及条件与实施例4相同。
[0118]
测试例1
[0119]
使用实施例4～6制备的三基因联合检测的fish试剂盒分别与人外周血培养细胞进行杂交检测，步骤如下：
[0120]
(1)预处理：
[0121]
重悬细胞后取3μl细胞悬液滴加到载玻片上，室温下晾干；
[0122]
玻片正面朝上，滴加200μl胃蛋白酶工作液(终浓度为4mg/ml)消化5min；
[0123]
加入2
×
ssc室温孵育5min；
[0124]
分别使用70％、90％和100％乙醇梯度脱水，各孵育2min；
[0125]
取出玻片，室温晾干。
[0126]
(2)变性杂交：
[0127]
滴加10μl杂交液到杂交区域，封片；
[0128]
78℃变性2min，37℃杂交6h。
[0129]
(3)复染(避光操作)：
[0130]
72
±
1℃下使用0.3％np-40(1
×
ssc配置)孵育2min；
[0131]
室温下使用0.1％np-40(2
×
ssc配置)孵育30s；
[0132]
室温下使用70％乙醇洗涤2min；
[0133]
取出玻片，在暗处晾干；
[0134]
加入10μl原位杂交蓝染染色液染色，暗处存放，待观察。
[0135]
使用实施例4制备的三基因联合检测的fish试剂盒的染色图片如图1a所示。由图可以看出，图片所示细胞中含有2个绿色信号、2个红色信号和2个黄色信号，整体信号均匀度好，信号清晰；与实施例4的结果图片相比，实施例5的结果图片(如图1b所示，箭头指示偏绿的信号点)背景偏绿，影响整体观察，且容易与bcl-2的绿色信号混淆；实施例6中采用分别标记探针再进行混合的方法，探针分布不均匀，不同细胞核个体间有明显差异，且容易出现假信号(如图1c所示，长箭头指示的绿色信号偏弱，因而显现为假红色信号；短箭头表示
正常的黄色信号)。上述结果表明，同时使用红色荧光素和绿色荧光素标记的探针的制备方法与检测结果密切相关，只有同时进行双荧光素混合标记，且绿红荧光素的物质的量比例在(1.3～1.5):1的范围内时，黄色信号清晰，检测效果较好。
[0136]
对比例1
[0137]
本对比例提供一种同时检测myc基因、bcl-2基因和bcl-6基因的fish探针组合，其中，检测myc基因的探针来自广州安必平医药科技股份有限公司的myc基因断裂检测探针(荧光原位杂交法)(货号f.01054-01)，检测bcl2基因的探针来自广州安必平医药科技股份有限公司的bcl2基因断裂检测探针(荧光原位杂交法)(货号f.01172-01)，检测bcl6基因的探针来自广州安必平医药科技股份有限公司的bcl26基因断裂检测探针(荧光原位杂交法)(货号f.01069-01)。
[0138]
对比例2
[0139]
本对比例提供一种三基因联合检测的fish试剂盒，与实施例4的区别仅在于，使用对比例1中的同时检测myc基因、bcl-2基因和bcl-6基因的fish探针组合替换实施例1中的三基因联合检测的fish探针组合，其余材料及条件与实施例4相同。
[0140]
测试例2
[0141]
使用实施例4和对比例2制备的三基因联合检测的fish试剂盒分别与人外周血培养细胞和组织切片样本进行杂交检测。
[0142]
使用实施例4中的三基因联合检测的fish试剂盒与人外周血培养细胞杂交的步骤与测试例1中的相同，与组织切片样本杂交的步骤如下：
[0143]
(1)预处理：
[0144]
室温下使用二甲苯(或二甲苯替代剂)脱蜡10min；
[0145]
室温下使用100％乙醇、90％乙醇以及70％乙醇各孵育3min；
[0146]
室温下使用去离子水清洗3min，甩去多余水分；
[0147]
加入通透剂孵育5min；
[0148]
使用纯化水在80～95℃下清洗5min；
[0149]
室温下使用2
×
ssc清洗3min，室温晾干；
[0150]
滴加200μl胃蛋白酶(终浓度为4mg/ml)，37℃消化6min；
[0151]
室温下使用2
×
ssc清洗3min；
[0152]
室温下使用70％乙醇清洗2min，室温晾干。
[0153]
(2)复染(避光操作)：
[0154]
滴加10μl原位杂交蓝染染色液，在暗处存放，待观察。
[0155]
对比例2制备的三基因联合检测的fish试剂盒在使用时，将myc基因断裂检测探针、bcl-2基因断裂检测探针和bcl-6基因断裂检测探针分别与三个人外周血培养细胞样本以及三个组织切片样本进行杂交，并分别进行观察，具体的杂交步骤参见产品说明书中的指示。
[0156]
使用实施例4制备的三基因联合检测的fish试剂盒对人外周血培养细胞和组织切片样本的染色图片如图2a和图2b所示。由图可以看出，图片所示细胞中含有2个绿色信号、2个红色信号和2个黄色信号，信号均一且明显；对比例2中myc基因断裂检测探针对人外周血培养细胞和组织切片样本的染色图片如图2c和图2d所示，bcl-2基因断裂检测探针对人外
周血培养细胞和组织切片样本的染色图片如图2e和图2f所示，bcl-6基因断裂检测探针对人外周血培养细胞和组织切片样本的染色图片如图2g和图2h所示。上述图片中可以在靶位点观察到荧光信号，其余位置未出现非特异性杂交，并且可以在部分图片中观察到细胞核中的基因融合信号，但其在一个视野中仅能对一个基因进行检测及观察。上述结果表明，与常规双色断裂探针进行对比，使用本技术中的三基因联合检测的fish探针组合在样本中表现更明亮的信号，且可以同时进行三基因的判读，在双通下即可实现准确判读，检测效果更好，结果符合预期，检测准确度高。
[0157]
测试例3
[0158]
本测试例验证不同的预处理方式对样本的影响。
[0159]
传统方法的步骤如下：
[0160]
(1)预处理：
[0161]
室温下使用二甲苯(或二甲苯替代剂)脱蜡10min；
[0162]
室温下使用100％乙醇、90％乙醇以及70％乙醇各孵育3min；
[0163]
室温下使用去离子水清洗3min，甩去多余水分；
[0164]
使用纯化水在95～100℃煮沸10min；
[0165]
室温下使用2
×
ssc清洗3min，室温晾干；
[0166]
滴加200μl胃蛋白酶(终浓度为4mg/ml)，37℃消化6min；
[0167]
室温下使用2
×
ssc清洗3min；
[0168]
室温下使用70％乙醇清洗2min，室温晾干。
[0169]
(2)复染(避光操作)：
[0170]
滴加10μl原位杂交蓝染染色液，在暗处存放，待观察。
[0171]
使用通透剂的步骤如下：
[0172]
(1)预处理：
[0173]
室温下使用二甲苯(或二甲苯替代剂)脱蜡10min；
[0174]
室温下使用100％乙醇、90％乙醇以及70％乙醇各孵育3min；
[0175]
室温下使用去离子水清洗3min，甩去多余水分；
[0176]
加入通透剂孵育5min；
[0177]
使用纯化水在80～95℃下清洗5min；
[0178]
室温下使用2
×
ssc清洗3min，室温晾干；
[0179]
滴加200μl胃蛋白酶(终浓度为4mg/ml)，37℃消化6min；
[0180]
室温下使用2
×
ssc清洗3min；
[0181]
室温下使用70％乙醇清洗2min，室温晾干。
[0182]
(2)复染(避光操作)：
[0183]
滴加10μl原位杂交蓝染染色液，在暗处存放，待观察。
[0184]
染色结果如图3a和图3b所示。由图3a可以看出，细胞核发生解体，染色质解凝、堆叠、融合，表明高温煮沸对细胞核造成了破坏；图3b中的细胞核的核膜完整，核分割清晰，说明使用通透剂的处理方式较为温和，避免了高温对核酸的破坏。
[0185]
淋巴瘤样本有其特殊性，核小且密集排布。处理不当时，会导致核间互融，影响后续信号的判读。胃蛋白酶消化前的组织通透是重要的步骤，通透过程使固定时的交联打开，
蛋白结构松散，方便胃蛋白酶消化。上述结果表明，使用通透剂的解交联效果更好，且较为温和，不会对细胞核或核酸造成破坏。
[0186]
测试例4
[0187]
本测试例使用实施例4制备的三基因联合检测的fish试剂盒进行检测。
[0188]
收集20例b细胞淋巴瘤ffpe样本(来自安必平检验所)，病例信息显示样本的cd10、bcl2和foxp1均呈阳性。20例样本中有18例呈cd20阳性，19例样本表现出myc高表达(19/20，95％)，14例样本表现出bcl6高表达(14/20，70％)，mum1/irf4在10例样本呈阳性(10/20，50％)。t细胞抗原、tdt和ebv编码rna在所有样本中均为阴性。20例中有10例显示高增殖指数(70％～100％)，滤泡性淋巴瘤的增殖率为30％。收集另外10例乳腺癌/肺癌ffpe样本(来自安必平检验所)作为阴性对照。
[0189]
样本切片厚度为5μm，按照下述方法进行样本预处理、变性杂交及复染。
[0190]
(1)预处理：
[0191]
室温下使用二甲苯(或二甲苯替代剂)脱蜡10min；
[0192]
室温下使用100％乙醇、90％乙醇以及70％乙醇各孵育3min；
[0193]
室温下使用去离子水清洗3min，甩去多余水分；
[0194]
加入通透剂孵育5min；
[0195]
使用纯化水在80～95℃下清洗5min；
[0196]
室温下使用2
×
ssc清洗3min，室温晾干；
[0197]
滴加200μl胃蛋白酶(终浓度为4mg/ml)，37℃消化6min；
[0198]
室温下使用2
×
ssc清洗3min；
[0199]
室温下使用70％乙醇清洗2min，室温晾干。
[0200]
(2)变性杂交：
[0201]
滴加10μl杂交液到样本区；
[0202]
85℃变性5min，37℃杂交6h。
[0203]
(3)复染(避光操作)：
[0204]
在37
±
1℃下使用2
×
ssc清洗10min；
[0205]
在37
±
1℃下使用0.1％np-40(2
×
ssc配置)孵育5min；
[0206]
在室温下使用70％乙醇洗涤3min，在暗处晾干；
[0207]
滴加10μl原位杂交蓝染染色液，在暗处存放，待观察。
[0208]
结果如图4a、图4b、图4c、图4d、图4e和图4f所示。其中，图4a和图4b为myc阳性样本的检测结果图片，可以明显看出含有2个绿色信号、3个红色信号和2个黄色信号；图4c和图4d为bcl2阳性样本的检测结果图片，可以明显看出含有3个绿色信号、2个红色信号和2个黄色信号；图4e和图4f为bcl6阳性样本的检测结果图片，可以明显看出含有2个绿色信号、2个红色信号和3个黄色信号。上述结果显示检测结果与实际样本类型相符，符合率达到100％，检测准确度高。
[0209]
综上所述，本发明使用三基因联合检测的fish探针组合配合双通滤镜，实现了在显微镜下直接观察到三个基因(myc、bcl2和bcl6)的检测信号，能够有效检测靶基因异常。与常规方法中使用三组探针与三个区域分别进行杂交、观察三次相比较，节约了检测时间，降低了检测成本，应用价值更高。
[0210]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。