一种瓜类细菌性果斑病菌的RPA检测引物、探针及检测方法

一种瓜类细菌性果斑病菌的rpa检测引物、探针及检测方法
技术领域
1.本发明属于rpa检测技术领域，具体涉及一种瓜类细菌性果斑病菌的rpa检测引物、探针及检测方法。


背景技术：

2.瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch，bfb)的病原为西瓜嗜酸菌(acidovorax citrulli，简称a.citrulli)，严重危害西瓜、甜瓜等葫芦科作物，是一种重要的细菌性检疫病害。该病害是一种能通过种子传播的病害，生育期的叶片、果实和种子都能带病，十分影响果实的产量和质量，严重时能导致毁灭性危害。上世纪90年代，首次在我国报道发生，随后新疆、海南、上海、浙江等地偶有报道发生，在《各地区发生的全国农业植物检疫性有害生物名单(2016)》中，我国已经有12个省市有发生。
3.该病害已经开始严重威胁我国西瓜、甜瓜等重要葫芦科作物产业发展，且该病害引起的病害症状与另外一种细菌性叶斑病的症状十分相似，肉眼难于辨别。该细菌病害常见的检测方法有症状鉴别、pcr检测、巢式pcr检测、酶联免疫吸附测定、定量pcr(qpcr)检测等方法，这些方法或灵敏度低，或耗时长，或试剂仪器昂贵。所以亟待寻找一种快速、简便方法来检测、诊断该种细菌性病害。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种瓜类细菌性果斑病菌的rpa检测引物、探针及检测方法，根据病原菌特有的基因序列，设计出特异性引物、探针，建立了瓜类细菌性果斑病菌的快速等温可视化检测方法，实现在恒温环境下，快速诊断、鉴别和检测瓜类细菌性果斑病菌，具有灵敏度高、特异性好等优点，为该病害的检疫、检测、防控提供技术支持。
5.为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种检测瓜类细菌性果斑病菌的rpa引物组，包括瓜类细菌性果斑病菌的rpa引物对ac-f1、ac-r1和检测探针ac-nfo，所述瓜类细菌性果斑病菌的rpa引物对ac-f1和ac-r1的扩增产物大小为342bp，引物ac-r1的5'末端标记生物素，检测探针ac-nfo的5’末端标记fam，3’末端标记c3spacer，探针中间距5’末端32bp位置处采用dspacer修饰，具体核苷酸序列如下：
7.ac-f1:5
’‑
acaacgatgttgtcattaaattggcgaggatgg-3’；
8.ac-r1:5
’‑
biotin-tgaagtccaagccagctgaaagtactacctttg-3’；
9.ac-nfo:5
’‑
[6fam]-gccgcattgaaaaccgtcgtcgtgatggaga[thf]gacgccgccagaagc-[c3spacer]-3’。
[0010]
一种检测瓜类细菌性果斑病菌的rpa试剂盒，包括所述瓜类细菌性果斑病菌的rpa引物对ac-f1、ac-r1和探针ac-nfo。
[0011]
进一步，所述检测瓜类细菌性果斑病菌的rpa试剂盒还包括相应的核酸检测试纸条。
arborescens(树状微杆菌)，pectobacterium carotovorum subsp.brasiliense(黄瓜茎基腐病菌)，escherichia coli(大肠杆菌)，agrobacterium sp.(农杆菌)，-为阴性对照。
[0028]
图4为本发明实施例3中rpa的灵敏度检测图,其中：m为2k plus
ꢀⅱꢀ
marker；a-i为浓度为2.5
×
10
9-2.5
×
101cfu/ml的a.citrulli菌液；-为阴性对照。
[0029]
图5为本发明实施例3中侧流试纸的灵敏度检测图，其中：m为2k plus
ꢀⅱꢀ
marker；a-i为浓度为2.5
×
10
9-2.5
×
101cfu/ml的a.citrulli菌液；nc为阴性对照。
[0030]
图6为本发明实施例3中侧流试纸模拟田间人工接种瓜类细菌性果斑病样本的lf-rpa检测图，其中：a、b为阳性对照，c、d为实验室接种甜瓜样品检测，e为健康植株、f为阴性对照。
具体实施方式
[0031]
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
[0032]
实施例1设计并筛选特异性引物对
[0033]
(一)设计引物：
[0034]
对瓜类细菌性果斑病菌的长度为651bp的orf特异性序列cp029373.1(896040-896693)，具体核苷酸序列如seq id no.1所示，设计12对不同的rpa引物，其中引物对设置tm值在65-75℃之间，扩增长度在150-294bp之间，将备选的rpa引物对分别配置成浓度为10μm的溶液。
[0035]
设计的13对不同rpa引物对具体序列参见表1，从5’到3’。
[0036]
表1
[0037]
[0038][0039]
(二)筛选过程如下：
[0040]
分离纯化瓜类细菌性果斑病菌，按常规方法提取dna备用，以提取的dna为模板进行pra检测，其中，rpa反应体系为：复溶液29.5μl、无菌去离子水13.0μl、10μmol/l的正/反向引物各2.0μl、280mmol/l醋酸镁溶液2.5μl、dna模板1.0μl、总体积50.0μl；rpa反应条件为：37℃保温或水浴15min。
[0041]
向rpa反应管中加入50.0μl酚氯仿异戊醇(25：24：1)，混匀后12000rpm离心1min，取3.0μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，rpa结果如图1所示。
[0042]
由图1可知，本发明设计的13对引物对有多对可以对目标病原菌进行特异扩增，扩增产物浓度高，引物对d、e、f等对该病原菌的dna有较好的扩增效果，亮度高、无杂带，特异性好、效率高、灵敏度高，本发明选用了其中的d引物对，并命名为rpa引物对ac-f1和ac-r1，参见图2。
[0043]
实施例2瓜类细菌性果斑病病原菌rpa检测引物的特异性试验
[0044]
dna模板分别来自参考细菌：pseudomonas syringae(甜瓜细菌性叶斑病菌)，erwinia carotovora(大白菜软腐病)，e.chrysanthemi(水稻基腐病菌)，xanthomonas oryzae(水稻细菌性条斑病菌)，microbacterium arborescens(树状微杆菌)，
pectobacterium carotovorum subsp.brasiliense(黄瓜茎基腐病菌)，escherichia coli(大肠杆菌)，agrobacterium sp.(农杆菌)。
[0045]
纯化瓜类细菌性果斑病菌及各参考细菌，将引物对ac-f1和ac-r1分别配置成浓度为10.0μmol/l的溶液，按常规方法提取dna备用，以提取的dna为模板进行rpa检测，其中，rpa反应体系为：复溶液29.5μl、无菌去离子水13.0μl、10μmol/l的正/反向引物各2.0μl、280mmol/l醋酸镁溶液2.5μl、dna模板1.0μl、总体积50.0μl；rpa反应条件为：37℃保温或水浴15min。
[0046]
向各rpa反应管中加入50.0μl酚氯仿异戊醇(25：24：1)，混匀后12000rpm离心1min，取3μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，rpa结果如图3所示。
[0047]
由图3可知，rpa引物对ac-f1和ac-r1对瓜类细菌性果斑病菌的dna有较好的扩增效果，特异性好，对参考菌株无扩增条带。
[0048]
试验表明：本发明设计的rpa引物对ac-f1和ac-r1有很好的特异性，对参考菌株无扩增条带，所选取的引物对可以用于对瓜类细菌性果斑病菌的rpa检测。
[0049]
实施例3瓜类细菌性果斑病病原菌rpa检测引物的灵敏度试验和试纸检测的灵敏度试验
[0050]
1)纯化瓜类细菌性果斑病菌，培养后用无菌水配制成2.5
×
10
9-2.5
×
101cfu/ml的菌液悬浮液；
[0051]
2)根据实例1、2的引物特异性结果，在引物对ac-f1和ac-r1的扩增片段中设计及检测探针，并进行修饰，命名为ac-nfo，将引物对ac-f1和ac-r1、探针ac-nfo分别配置成浓度为10μm的溶液；
[0052]
3)以步骤1)制备的菌液悬浮液为模板进行pra检测，rpa反应体系为：复溶液29.5μl、无菌去离子水12.4μl、10μmol/l的ac-nfo 0.6μl、10μmol/l的ac-f1/ac-r1各2.0μl、280mmol/l醋酸镁溶液2.5μl、dna模板1.0μl、总体积50.0μl。rpa反应条件为：36-38℃保温或水浴10-15min。
[0053]
4)向rpa反应管中加入50.0μl酚氯仿异戊醇(25：24：1)，混匀后12000rpm离心1min，取3μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，rpa结果如图4所示。
[0054]
由图4可知，引物对ac-f1/ac-r1对该病原菌的菌悬液rpa扩增灵敏度高。
[0055]
5)从步骤3)反应管中反应液吸取10μl，并与90μl无菌去离子水混匀至新的200μl管中；
[0056]
6)将核酸检测试纸条测试端插入步骤5的管中，根据试纸显色结果判定检测结果，须在5min内判定结果，试纸检测结果如图5所示。
[0057]
由图5可知，引物对ac-f1/ac-r1对该病原菌的菌悬液试纸检测敏度高。
[0058]
可见，本发明设计的引物对ac-f1和ac-r1对该病原菌菌悬液的灵敏度高，检测限度达到2.5
×
104cfu/ml，试纸与rpa检测限度一致，说明该方法的引物、检测探针可用于对菌液的pra检测、试纸检测，无需提取dna。
[0059]
实施例4瓜类细菌性果斑病病样的检测
[0060]
1)利用纯化的瓜类细菌性果斑病菌接种感病甜瓜植株，植株发病后采集有症状叶片，按质量体积比1：10比例，在病叶组织中加入无菌水，充分研磨，得到研磨汁液作为待检测对象；选取实施例1的引物、实施例3的探针，将引物对ac-f1/ac-r1、探针ac-nfo分别配置
成浓度为10μm的溶液；
[0061]
2)以步骤1)制备的研磨汁液为模板进行pra检测，rpa反应体系为：复溶液29.5μl、无菌去离子水12.2μl、10μmol/l的ac-nfo 0.6μl、10μmol/l的ac-f1/ac-r1各2.1μl、280mmol/l醋酸镁溶液2.5μl、dna模板1.0μl、总体积50μl，rpa反应条件为：37℃保温或水浴15min。
[0062]
3)从步骤2)反应管中反应液吸取8-15μl，并与无菌去离子水稀释10倍后混匀至新的200μl管中；
[0063]
4)将核酸检测试纸条测试端插入步骤3)的管中，根据试纸显色结果判定检测结果，须在5min内判定结果，试纸检测结果如图6所示。
[0064]
图6为人工接种的瓜类细菌性果斑病的lf-rpa检测图，由图6可知，a、b(阳性对照)和c、d(实验室接种甜瓜样品)试纸都出现两条深色条带，e(健康样品)、f(阴性对照)仅质控带出现深色。
[0065]
可见，本发明提供的基于重组酶聚合酶扩增(rpa)结合侧流试纸检测瓜类细菌性果斑病菌的引物、探针及检测方法对接种的瓜类细菌性果斑病能正确的检测病原菌，能方便的用于直接对病害样品的检测。
[0066]
本发明中的基于重组酶聚合酶扩增(rpa)结合侧流试纸检测瓜类细菌性果斑病菌的引物ac-f1、ac-r1和探针ac-nfo及检测方法能用于感病叶片研磨汁液的直接检测，无需提取dna，且特异性好，不受植物组织影响，是一种快速、便捷的检测方法。