一种SNaPshot多重分析系统的构建方法与流程

一种snapshot多重分析系统的构建方法
技术领域
1.本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及一种snapshot多重pcr设计方法及多重分析系统的构建方法。


背景技术：

2.测序技术是分子生物学最重要的检测手段，是基因多态性和基因突变检测的金标准，也是其他众多技术方法的参考标准。测序技术的优势在于，直接测定样本的基因序列，得到基因变异的精确情况，并且能够对某一段dna序列进行多位点突变检测，或未知突变检测，广泛应用在肿瘤靶向药物个体化治疗检测、遗传疾病基因突变检测、血液病基因突变检测、hla分型与配型、病原微生物耐药性检测等等诸多领域。第一代dna测序技术用的是1975年由sanger和coμlson开创的链终止法或maxam和gilbert发明的化学法(链降解)。其中常用的sanger测序(双脱氧末端终止法)的原理是将被荧光标记的ddntp掺入到dntp中，由于ddntp随机掺入，pcr产物从引物之后的第一个碱基开始，每一个位置都有可能是ddntp。由于ddntp缺乏链延伸所需要的3'-oh，链的延伸就选择性地在g、a、t或c处终止。这样的pcr产物与普通pcr不一样，不能形成一条电泳带，而是一组长度相差一个碱基的成百上千种片段。它们具有共同的起始点，终止在不同的的核苷酸上，每一个碱基都有相同的概率被终止。将得到的不同大小的片段进行毛细管电泳，通过对荧光信号的采集和拼接，最终获得目的片段的序列。其特点是高读长；检测通量中的；检测灵敏度低；单孔成本低，适用于少数基因的少量位点测序，广泛应用于临床检测和科研研究。
3.snapshot多重分析系统又称为小测序技术，是一种基于引物单碱基延伸的方法，在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddntp，紧挨多态位点5’端的不同长度延伸引物和pcr产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经abi测序仪跑胶后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。snapshot多重分析系统能够对多个snp进行多重分析，可用于筛选和验证snp，能通过简单快速的检测流程来检测snp相关项目，提高检测效率，降低检测成本。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种snapshot多重分析系统的构建方法，建立快速简单的检测流程来检测snp相关项目，提高检测效率，降低检测成本。
5.本发明通过以下技术方案来实现上述技术目的：
6.本发明提供一种snapshot多重分析系统的构建方法，包括多重pcr反应系统的构建、snapshot反应系统的构建、snapshot产物纯化系统构建、上机体系的构建以及结果分析；
7.多重pcr反应系统的构建包括以下步骤：
8.根据待测基因的snp位点序列信息设计多重pcr引物，并确定各引物的最低退火温度，作为反应程序关键参数；
9.采用基础单独pcr反应体系和程序、基础多重pcr反应体系和程序跑胶验证有无相应的条带被扩增；
10.若单独pcr中有位点未被扩增，则重新设计该位点的多重pcr引物并重复上述操作；
11.若单独pcr中位点均被扩增，则调整多重pcr反应体系和程序保证不同条带亮度一致。
12.作为本发明的一种实施方式，多重pcr反应系统的构建中，基础单独pcr反应体系为：10
×
buffer 1μl、dntp 0.4μl、正向引物0.5μl、反向引物0.5μl、taq-酶0.4μl、ddh2o 6.5μl、样本dna模板1μl；
13.基础单独pcr反应程序为：预变性95℃3min，95℃30s、58℃30s、72℃60s、30个循环，72℃10min；
14.基础多重pcr反应体系为：
15.ddh2o3μl多重pcr扩增引物工作液1μl样品dna1μl2*vazyme mix5μltotal10μl
16.其中，多重pcr扩增引物工作液中各正反引物均为0.5μm；
17.基础多重pcr反应程序为：
[0018][0019]
作为本发明的一种实施方式，多重pcr反应系统的构建中，多重pcr反应体系的调整包括引物浓度的调整和模板浓度的调整；和/或
[0020]
多重pcr反应程序的调整包括退火温度的调整。
[0021]
作为本发明的一种实施方式，snapshot反应系统的构建包括以下步骤：
[0022]
根据待测基因的snp位点序列信息设计测序引物；
[0023]
采用基础单独pcr反应体系和程序、基础snapshot反应体系和程序跑胶验证有无相应的条带扩增；
[0024]
若单独pcr中有位点未被扩增，则重新设计该位点的测序引物并重复上述操作；
[0025]
若单独pcr中位点均被扩增，则调整snapshot反应体系和程序至保证所有位点均被扩增。
[0026]
作为本发明的一种实施方式，snapshot反应系统的构建中，基础单独pcr反应体系为：10
×
buffer 1μl、dntp 0.4μl、正向引物0.5μl、反向引物0.5μl、taq-酶0.4μl、ddh2o 6.5μl、样本dna模板1μl
[0027]
基础单独pcr反应程序为：预变性95℃3min，95℃30s、58℃30s、72℃60s、30个循
环，72℃10min；
[0028]
基础snapshot反应体系为：
[0029]
ddh2o1μl多重pcr测序引物工作液1μl多重pcr纯化产物3μlsnapshot mix5μltotal10μl
[0030]
其中，多重pcr测序引物工作液各引物终浓度均为0.001μm；
[0031]
基础snapshot反应程序为：
[0032][0033]
作为本发明的一种实施方式，snapshot反应体系的调整包括测序引物浓度和模板的调整；和/或
[0034]
snapshot反应体系程序的调整包括退火温度的调整。
[0035]
作为本发明的一种实施方式，纯化体系的构建包括以下步骤：
[0036]
采用基础纯化体系和程序对snapshot反应系统扩增后的产物进行上机检测，若纯化产物上机后存在杂峰，则调整纯化反应体系和程序至无杂峰。
[0037]
作为本发明的一种实施方式，还包括pcr产物酶解系统的构建，所述酶解反应体系的构建位于多重pcr反应系统的构建和snapshot反应系统的构建之间。
[0038]
作为本发明的一种实施方式，pcr产物酶解系统的构建包括以下步骤：
[0039]
采用基础酶解反应体系和程序对多重pcr产物进行酶解；
[0040]
若酶解产物上机后存在杂峰，则调整酶解纯化体系和程序。
[0041]
本发明的另一目的在于提供一种snapshot多重分析系统，采用上述的构建方法构建得到，适于通过快速简单的检测流程检测snp相关项目。
[0042]
本发明所提供的snapshot多重分析系统，是一种基于引物单碱基延伸的方法，在单管反应中，能够对多个snp进行多重分析的方法，利用此系统可筛选和验证snp。snapshot既拥有sanger测序中ddntp单碱基延伸就终止的特点，又具有片段分析通量较高的属性。若同时检测5个位点，首先通过pcr扩增含有snp的目标区域，然后再通过4种不同荧光基团标记的ddntp单碱基延伸，获得snp的信息，最后通过毛细管电泳基因分析仪得到snp检测结果。
[0043]
本发明是在已有sanger测序检测snp的基础上，建立快速简单的snapshot多重分析检测流程来检测snp相关项目，提高检测效率，降低检测成本。
附图说明
[0044]
图1为本发明实施例中cyp2c19基因单独pcr跑胶结果图；
[0045]
图2为本发明实施例中cyp2c19基因多重pcr跑胶结果图；
[0046]
图3为本发明实施例中cyp2c19基因snapshot上机结果峰图；
[0047]
图4为本发明实施例中cyp2c19基因*2位点sanger测序法检测图；
[0048]
图5为本发明实施例中cyp2c19基因*8位点sanger测序法检测图；
[0049]
图6为本发明实施例中cyp2c19基因*17位点sanger测序法检测图；
[0050]
图7为本发明实施例中cyp2c19基因*3位点sanger测序法检测图；
[0051]
图8为本发明实施例中cyp2c19基因*4位点sanger测序法检测图；
[0052]
图9为本发明实施例中cyp2c19基因*6位点sanger测序法检测图；
[0053]
图10为本发明实施例中cyp2c19基因*9位点sanger测序法检测图；
[0054]
图11为本发明实施例中cyp2c19基因*7位点sanger测序法检测图；
[0055]
图12为本发明实施例中all基因样本1单独pcr跑胶图；
[0056]
图13为本发明实施例中all基因样本2单独pcr跑胶图；
[0057]
图14为本发明实施例中all基因样本3单独pcr跑胶图；
[0058]
图15为本发明实施例中all基因多重pcr跑胶图；
[0059]
图16为本发明实施例中未经酶解、纯化优化的all基因snapshot上机结果峰图；
[0060]
图17为本发明实施例中经过酶解、纯化优化的all基因snapshot上机结果峰图；
[0061]
图18为本发明实施例中all基因slc01b1-tt位点sanger测序法检测图；
[0062]
图19为本发明实施例中all基因tpmt-10-aa位点sanger测序法检测图；
[0063]
图20为本发明实施例中all基因mthfr-1298-ac位点sanger测序法检测图；
[0064]
图21为本发明实施例中all基因nudt15-3-cc位点sanger测序法检测图；
[0065]
图22为本发明实施例中all基因tmpt-7-gg位点sanger测序法检测图；
[0066]
图23为本发明实施例中all基因mthfr-677-cc位点sanger测序法检测图；
[0067]
图24为本发明实施例中all基因tmpt-5-gg位点sanger测序法检测图；
[0068]
图25为本发明实施例中all基因slc01b1-tt位点sanger测序法检测图。
具体实施方式
[0069]
以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语均属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
[0070]
实施例1
[0071]
本实施例提供一种基于snapshot多重分析系统检测cyp2c19基因常见snp位点引物体系优化方法，具体包括以下步骤：
[0072]
(1)多重pcr反应系统的构建
[0073]
步骤一：利用primer-blast根据待测基因cyp2c19的序列信息设计待测snp位点的多重pcr引物，并通过ncbiprimerblast查询各引物的最低退火温度，作为反应程序关键参数，具体结果如下表1所示：
[0074][0075]
步骤二、采用基础单独pcr反应体系和程序、基础多重pcr反应体系和程序跑胶验证有无相应的条带被扩增，详细步骤如下：
[0076]
(a)采用基础单独pcr反应体系和程序进行扩增，基础单独pcr反应体系为：10
×
buffer 1μl、dntp 0.4μl、正向引物0.5μl、反向引物0.5μl、taq-酶0.4μl、ddh2o 6.5μl、样本dna模板1μl；
[0077]
基础单独pcr反应程序为：预变性95℃3min，95℃30s、58℃30s、72℃60s、30个循环，72℃10min。
[0078]
对扩增得到的产物分别进行跑胶验证，均有相应条带扩增出来，结果如图1所示，图1中，1、2、3和4分别为4个cyp2c19样本，每个样本从左至右依次为5个snp位点的单独pcr跑胶结果。
[0079]
采用基础多重pcr反应体系和程序进行扩增，基础多重pcr反应体系为：
[0080]
ddh2o3μl多重pcr扩增引物工作液1μl样品dna1μl2*vazyme mix5μl
total10μl
[0081]
其中，多重pcr扩增引物工作液如下：
[0082][0083]
基础多重pcr反应程序为：
[0084][0085]
对扩增得到的产物进行跑胶验证，均有相应条带扩增出来，但是各条带的亮度并不一致。
[0086]
步骤三，根据步骤二中的条带亮度结果，分别调整多重pcr反应体系中的引物浓度、模板浓度以及多重pcr反应程序中退火温度、循环数，直至各条带亮度一致(也即扩增效率一致)为止。
[0087]
最终确定出的多重pcr反应体系为：
[0088][0089][0090]
其中，多重pcr扩增引物工作液如下：
[0091][0092]
反应程序为：
[0093][0094]
至此，基于snapshot多重分析系统检测cyp2c19基因常见snp位点的多重pcr反应系统的构建完成。
[0095]
结果如图2所示，图2中，样本1、样本2、样本3和样本4分别为4个不同cyp2c19样本多重pcr跑胶结果。
[0096]
(2)多重pcr产物酶解体系的构建
[0097]
采用基础酶解反应体系和程序对多重pcr产物进行酶解；
[0098]
若酶解产物上机检测后有杂峰，则调整酶解体系和条件。
[0099]
最终确定出的酶解体系为：多重pcr产物酶解体系为：sap酶1μl；exoi酶0.5μl，多重pcr产物3μl；ddh2o3.5μl；
[0100]
酶解条件为：
[0101]
37℃30min95℃15min12℃∞
[0102]
(3)snapshot反应系统的构建
[0103]
步骤一、利用primer-blast根据待测基因cyp2c19的序列信息设计待测snp位点的测序引物，具体结果如下表所示：
[0104][0105]
步骤二、采用基础单独pcr反应体系和程序，基础多重pcr反应体系和程序跑胶验证有无相应的条带被扩增，详细步骤如下：
[0106]
(a)采用基础单独pcr反应体系和程序进行扩增，基础pcr反应体系为：10
×
buffer 1μl、dntp 0.4μl、正向引物0.5μl、反向引物0.5μl、taq-酶0.4μl、ddh2o 6.5μl、样本dna模板1μl；
[0107]
基础pcr反应程序为：预变性95℃3min，95℃30s、58℃30s、72℃60s、30个循环，72℃10min。
[0108]
对扩增得到的产物分别进行跑胶验证，均有相应条带扩增出来。
[0109]
(b)采用基础snapshot反应体系和程序进行扩增，基础snapshot反应体系为：
[0110][0111][0112]
其中，测序引物工作液用ddh2o稀释，终浓度分别为0.001、0.001、0.001、0.001、0.001、0.001、0.001、0.001μm，如配置500μl测序引物工作液分别加入母液0.5μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl，再加入496.5μlddh2o稀释。
[0113]
反应程序为：
[0114][0115]
对扩增得到的产物进行跑胶验证，均有相应条带扩增出来，但是各条带的亮度并不一致。
[0116]
步骤三，根据步骤二中的条带亮度结果，分别调整基础snapshot反应体系中的引物浓度、模板浓度以及基础snapshot反应程序中退火温度、循环数，直至各条带亮度一致(也即扩增效率一致)为止。
[0117]
首先通过扩增引物的退火温度对多重pcr的退火温度进行调整，同时通过产物的条带亮度调整扩增引物的比例和体系中相应试剂的用量。
[0118]
最终确定出的snapshot反应体系为：
[0119]
ddh2o1μl多重pcr测序引物工作液1μl多重pcr纯化产物3μlsnapshot mix5μltotal10μl
[0120]
其中，测序引物工作液用ddh2o稀释，终浓度分别为0.005、0.0015、0.0025、0.0012、0.005、0.005、0.0035、0.0025μm，如配置500μl测序引物工作液分别加入母液2.5μl、0.75μl、1.25μl、2.5μl、2.5μl、1.75μl、2.5μl，再加入486.25μlddh2o稀释。
[0121]
反应程序为：
[0122][0123]
至此，基于snapshot多重分析系统检测cyp2c19基因常见snp位点的snapshot反应系统的构建完成。
[0124]
(4)纯化系统构建
[0125]
采用基础纯化体系对snapshot反应系统扩增后的产物进行上机检测，若上机结果存在杂峰，则调整纯化体系。
[0126]
最终确定出的纯化体系为：
[0127]
试剂体积ddh2o3.5μl10
×
la buffer0.5μlsap酶(1u/μl)1μl
pcr产物3μltotal8μl
[0128]
纯化程序为：
[0129]
温度反应时间37℃60min75℃15min18℃∞
[0130]
(5)上机系统的构建及结果分析
[0131]
按照hi-di 9μl、liz 120 0.05μl、纯化产物1μl配制10.05μl的上机体系并进行上机检测，使用genemarker查看snapshot上机结果，其中panel设置为snapshot，liz设置为120，内标颜色设置为orange，判断内标、引物峰和操作是否正常；根据上机结果中峰图、片段大小和颜色判断snp位点的基因型，结果图3所示。
[0132]
(6)验证检测结果的准确性
[0133]
利用本领域公知的sanger测序法检测上述样本中的cyp2c19相关基因snp位点信息，以此验证本发明实验的可行性。
[0134]
实验结果如图4-11所示，从图中可以看出，利用sanger测序法检测样本中cyp2c19相关基因snp位点的结构与图3中检测得到的结果一致，说明本发明的snapshot多重分析试剂盒检测结果和sanger测序法检测结果一致。
[0135]
实施例2
[0136]
本实施例提供一种基于snapshot多重分析系统检测all的5种基因常见snp位点检测方法，具体包括以下步骤：
[0137]
(1)多重pcr反应系统的构建
[0138]
步骤一：利用primer-blast根据待测基因all的序列信息设计待测snp位点的多重pcr引物，并确定各引物的最低退火温度和循环数，作为反应程序关键参数，具体结果如下表所示：
[0139][0140][0141]
步骤二、采用基础pcr反应体系和程序，基础多重pcr反应体系和程序跑胶验证有无相应的条带被扩增，详细步骤如下：
[0142]
采用基础pcr反应体系和程序进行扩增，基础pcr反应体系为：10
×
buffer 1μl、dntp 0.4μl、正向引物0.5μl、反向引物0.5μl、taq-酶0.4μl、ddh2o 6.5μl、样本dna模板1μl；
[0143]
基础pcr反应程序为：预变性95℃3min，95℃30s、58℃30s、72℃60s、30个循环，72℃10min。
[0144]
对扩增得到的产物分别进行跑胶验证，均有相应条带扩增出来，结果如图12-14所示，其中图12、图13和图14分别代表3个all样本。
[0145]
(b)采用基础多重pcr反应体系和程序进行扩增，基础多重pcr反应体系为：
[0146]
ddh2o3μl多重pcr扩增引物工作液1μl样品dna1μl
2*vazyme mix5μltotal10μl
[0147]
其中，多重pcr扩增引物工作液如下：
[0148][0149]
基础多重pcr反应程序为：
[0150][0151][0152]
对扩增得到的产物进行跑胶验证，均有相应条带扩增出来，但是各条带的亮度并不一致。
[0153]
步骤三，根据步骤二中的条带亮度结果，分别调整多重pcr反应体系中的引物浓度、模板浓度以及多重pcr反应程序中退火温度、循环数，直至各条带亮度一致(也即扩增效率一致)为止。
[0154]
最终确定出的多重pcr反应体系为：
[0155]
ddh2o6μl多重pcr扩增引物工作液2μl样品dna2μl2*vazyme mix10μltotal20μl
[0156]
其中，多重pcr扩增引物工作液如下：
[0157]
[0158]
反应程序为：
[0159][0160]
至此，基于snapshot多重分析系统检测all基因常见snp位点的多重pcr反应系统的构建完成。
[0161]
结果如图15所示，图中从左至右4个泳道分别为marker和样本1、样本2、样本3的多重pcr跑胶结果。
[0162]
(2)多重pcr产物酶解体系的构建
[0163]
采用基础酶解反应体系和程序对多重pcr产物进行酶解；
[0164]
若酶解产物上机检测后有杂峰，则调整酶解体系和条件。
[0165]
最终确定出的酶解体系为：sap酶1μl；exoi酶0.5μl，多重pcr产物3μl；ddh2o3.5μl；
[0166]
酶解条件为：
[0167]
37℃30min95℃15min12℃∞
[0168]
(3)snapshot反应系统的构建
[0169]
步骤一、利用primer-blast根据待测基因all的序列信息设计待测snp位点的测序引物，具体结果如下表所示：
[0170]
[0171]
步骤二、采用基础单独pcr反应体系和程序，基础多重pcr反应体系和程序跑胶验证有无相应的条带被扩增，详细步骤如下：
[0172]
(a)采用基础pcr反应体系和程序进行扩增，基础pcr反应体系为：10
×
buffer 1μl、dntp 0.4μl、正向引物0.5μl、反向引物0.5μl、taq-酶0.4μl、ddh2o 6.5μl、样本dna模板1μl；
[0173]
基础pcr反应程序为：预变性95℃3min，95℃30s、58℃30s、72℃60s、30个循环，72℃10min。对扩增得到的产物分别进行跑胶验证，均有相应条带扩增出来。
[0174]
(b)采用基础snapshot反应体系和程序进行扩增，基础snapshot反应体系为：
[0175][0176]
其中，多重pcr测序引物工作液用ddh2o稀释，终浓度分别为0.001、0.001、0.001、0.001、0.001、0.001、0.001、0.001μm，如配置500体系，分别为0.5μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl，再加入496μlddh2o溶解。
[0177]
反应程序为：
[0178][0179]
对扩增得到的产物进行跑胶验证，均有相应条带扩增出来，但是各条带的亮度并不一致。
[0180]
步骤三，根据步骤二中的条带亮度结果，分别调整基础snapshot反应体系中的引物浓度、模板浓度以及基础snapshot反应程序中退火温度、循环数，直至各条带亮度一致(也即扩增效率一致)为止。
[0181]
最终确定出的snapshot反应体系为：
[0182][0183][0184]
其中，多重pcr测序引物工作液用ddh2o稀释，终浓度分别为0.003、0.004、0.002、0.005、0.006、0.002、0.003、0.005μm，如配置500体系，分别为1.5μl、2μl、1μl、2.5μl、3μl、1μl、1.5μl、2.5μl，再加入485μlddh2o溶解。
[0185]
反应程序为：
[0186][0187]
至此，基于snapshot多重分析系统检测all基因常见snp位点的snapshot反应系统的构建完成。
[0188]
(4)纯化系统构建
[0189]
采用基础纯化体系对snapshot反应系统扩增后的产物进行上机检测，若上机结果有杂峰，则调整纯化体系。
[0190]
最终确定出的纯化体系为：
[0191]
试剂体积ddh2o3.5μl10
×
la buffer0.5μlsap酶(1u/μl)1μlpcr产物3μltotal8μl
[0192]
纯化程序为：
[0193]
温度反应时间37℃60min75℃15min18℃∞
[0194]
(5)上机系统的构建及结果分析
[0195]
按照hi-di 9μl、liz 120 0.05μl、纯化产物1μl配制10.05μl的上机体系并进行上机检测，使用genemarker查看snapshot上机结果，其中panel设置为snapshot，liz设置为120，内标颜色设置为orange，判断内标、引物峰和操作是否正常；根据上机结果中峰图、片段大小和颜色判断snp位点的基因型。
[0196]
图16和图17为上机结果，其中，图16为未经过酶解系统和纯化系统优化的上机结果，而图17为经过酶解系统和纯化系统优化后的上机结果。从图中可以看出，图16中的杂峰较多，结果并不理想，而图17分析得到了目的基因的峰图。
[0197]
(6)验证检测结果的准确性
[0198]
利用本领域公知的sanger测序法检测上述样本中的all相关基因snp位点信息，以此验证本发明实验的可行性。
[0199]
实验结果如图18-25所示，从图中可以看出，利用sanger测序法检测样本中all相关基因snp位点的结构与图17中检测得到的结果一致，说明本发明的snapshot多重分析试剂盒检测结果和sanger测序法检测结果一致。
[0200]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。