气压脉冲供液的同轴电喷射按需细胞包封方法和装置

1.本发明针对海藻酸钠水凝胶微囊的细胞包封问题，提出以应用广泛的海藻酸钠水凝胶为壳层，以羧甲基纤维素钠水溶液为芯材料的同轴电流体动力学(electrohydrodynamic,ehd)的按需(on-demand)微囊制备装置。通过调节气源压强和电磁阀导通时间实现脉冲供液，实现水凝胶微囊的按需喷射，属于细胞包封和微囊化技术领域。


背景技术：

2.内外层结构的水凝胶微囊对干细胞包封，维持其干细胞特性具有重要的意义。对于一些特定的干细胞，液态芯的水凝胶微囊相比实心(芯材料也为水凝胶)更加有利于干细胞的培养和功能保持。目前报导的液态芯水凝胶微囊的制备包括微流控芯片技术。电流体动力学微滴喷射方法也被用于水凝胶微囊的制备。利用普通的ehd喷射制备出包裹细胞的海藻酸钠微球，而后利用电化学方法包被壳层材料，最后利用柠檬酸钠溶液将海藻酸钠芯材料液化。这样的方法步骤繁琐，对细胞的活性有不利影响。
3.基于同轴喷嘴的ehd微滴喷射是产生芯-壳结构的微囊的重要技术选项。微囊的壳层流体通过同轴喷嘴外层注入，微囊的芯流体从同轴喷嘴的内层注入。将内外层流体以一定比例稳恒地挤出。在喷嘴和收集电极之间施加电压。内外层流体在电场力作用下形成泰勒锥，泰勒锥断裂后形成具有内外层结构的微滴。收集装置中含有使得外层流体材料凝胶化的机制。液滴被收集后，外层迅速凝胶化形成水凝胶微囊，将内层流体包封在内。在微囊材料选择方面，海藻酸钠是目前应用最广泛的一种细胞包封天然生物材料，具有优良的生物相容性和生物降解性、以及低毒性的特点。利用海藻酸钠溶液中的古龙酸盐链段与氯化钙溶液中ca
2+
离子间协同作用，可形成表面光滑、圆整、均匀性好的微囊，具有凝胶化简单、快速等优点。当其作为一种包封系统时，可以简单、快速地封装细胞，保持被包裹细胞的活力。为了形成芯-壳结构，在海藻酸钠凝胶化之前，必须尽量减少芯-壳流体之间的混合，可以通过在芯流体中添加1％的羧甲基纤维素钠来提高其粘度。纤维素是植物细胞壁中的主要多糖，因其对哺乳动物细胞无毒性而被选为粘度调节剂。基于纤维素的芯液和基于海藻酸盐的壳液的高粘度以及海藻酸盐在氯化钙溶液中的快速凝胶动力学对于形成具有液芯和水凝胶的微胶囊至关重要。申请人也成功利用海藻酸钠水凝胶包封含有细胞的rpmi-1640细胞培养基。
4.有报导利用同轴(co-axial)的ehd喷射技术制备海藻酸钠水凝胶外壳和纤维素钠内芯的微囊。内芯保持流体特性并包含细胞。目前的同轴ehd微滴喷射技术是在连续供液下的连续喷射，并不是按需的。它的喷射周期取决于多个因素，包括电压u、喷口与接收电极之间的几何关系、以及供液流速q等。根据同轴ehd的喷嘴处液面形变研究，发现在稳恒的供液条件下微滴喷射分为两个阶段：前期液面长度缓慢线性拉伸。后期当液面长度超过某个临界值lc液面在电场力作用下迅速伸长，液面断裂形成微滴。这一行为与单喷嘴ehd微滴喷射是相似的。本技术中提出：向喷嘴内外层同时脉冲性地供液(例如可以通过脉冲气压实现)，使得喷嘴处的液面长度短暂超过所谓的阈值长度lc。如果没有外加电压，微滴不足以产生。
而如果在喷嘴-收集板之间施加电压，在电场的辅助下，液面会加速拉伸形变，并最终断裂，形成微滴。值得指出的是：在单喷嘴ehd喷射中观察到类似的液面变化规律。因此，上述气压脉冲供液的ehd微滴喷射这种混合驱动的喷射方法对于单喷嘴的情况已经有报道。例如：利用气压脉冲和ehd混合驱动，实现微滴按需喷射。具体地，利用高速电磁阀控制高压气体进入储液腔，在储液腔内产生脉冲压强，驱动短暂的泊肃叶流动，实现脉冲式供液。这种气动和ehd的混合方法，不仅继承了传统ehd微滴喷射制备较小直径微滴的优势，同时实现了按需喷射。对于同轴喷嘴的ehd喷射，尚无相关报道。


技术实现要素：

5.基于上述的背景中描述的技术内容，本技术提出了一种基于气压脉冲供液和同轴电流体动力学(ehd)混合驱动的按需(on-demand)水凝胶微囊制备装置和方法。外层(壳层)流体为海藻酸钠水溶液，内层(芯)流体为羧甲基纤维素钠水溶液。
6.本发明采用的技术方案为气压脉冲供液的同轴电喷射按需细胞包封装置，该装置包括腔体1、内层流体储液腔2、同轴喷嘴3、电磁阀4、电磁阀控制器5、调压阀6、进气路径7、排气路径8、气压传感器9、高压气源10、加液孔11、收集器12和高压电源13。
7.外层流体存储于腔体1的底部并与同轴喷嘴3的外层连通；内层流体存储于内层流体储液腔2内并与同轴喷嘴3的内层连通；内层流体和外层流体是隔开的，但共享共同液面上方的空间，以及共同的气压压强。腔体1通过在顶部的排气路径8连接外界的大气压；腔体1通过电磁阀4和调压阀6连接高压气源10；电磁阀控制器5连接并控制电磁阀4的导通时间，调压阀6控制电磁阀前端的气压压强；腔体1侧壁设有气压传感器9；加液孔11设置在腔体1顶部的一侧。高压电源13正负极分别连接同轴喷嘴3和收集器12，收集器12置于喷嘴3下方，以便于收集微滴。
8.进一步地，所述的外层流体为海藻酸钠溶液，储存于腔体1底部。内层流体为混合有细胞的羧甲基纤维素钠溶液，储存于内层储液腔2内。电磁阀4短暂导通，在腔体1的液面上方空间产生气压脉冲，从而实现脉冲式供液。
9.进一步地，喷射工作通过高压电源13在同轴喷嘴3和收集器12之间施加恒定的电压，产生恒定的电场。第一个正压过程使内外层流体按照一定比例从同轴喷嘴3喷出形成液带，使得液面体积短暂超过阈值vc，随后液带会在电场力作用下迅速形变，形成“泰勒锥”，而后泰勒锥断裂形成微滴。液滴具有壳-芯结构，滴入置于喷管下方盛有cacl2水溶液的收集器中，海藻酸钠水溶液与cacl2反应迅速形成水凝胶，将液态的芯流体包封，形成水凝胶微囊。
10.进一步地，第一个负压过程会使的未断裂的液体重新返回储液腔内。第一个负压过程以后的压强振荡幅值迅速衰减，腔体1液面上方空间的气压会趋于外界大气压。脉冲式供液有效抑制气压脉冲以外的时间中发生微滴喷射，从而实现按需喷射。
11.具体实施步骤描述如下：
12.s1：配置海藻酸钠水溶液和羧甲基纤维素钠水溶液通过加液孔分别注入腔体1和内层流体储液腔2，作为外层流体和内层流体。依据需要将细胞混入羧甲基纤维素钠水溶液中作为内层流体以便被包封。并配置cacl2加入收集器中。
13.s2：调节高压气源使其压强p0至常用最适压强值并通过电磁阀控制器达到需要的
工作频率与导通时间，在调节好之后喷口处液体体积应短暂大于临界体积vc。
14.s3：打开喷嘴与收集板之间的电压并调节大小使得在气压脉冲与电场的双重作用下微滴开始正常产生，装置开始按需产生直径较小的内外层结构的微液滴。
15.s4：具有内外层结构的微液滴被盛有cacl2的收集器收集，海藻酸钠壳层与cacl2反应，成为包裹具有流体特征的羟甲基纤维素钠溶液的微胶囊。
16.与现有技术相比较，本发明设计了一种基于气压脉冲供液的同轴ehd微囊制作方法，微囊外层(壳)为海藻酸钠水凝胶；被包封的内层流体为羧甲基纤维素钠水溶液(可根据需要混合细胞)。通过调节电磁阀导通时间、电磁阀前端气压压强、及高压电源输出控制微滴产生过程，内外层流体供液功能通过共享的气压脉冲实现，使得系统更加小型化。
附图说明
17.图1为基于脉冲供液的按需同轴ehd微滴装置结构示意图；(a)为基于脉冲供液的按需同轴ehd微滴产生装置组成连接图；(b)内外喷管几何尺寸示意图。
18.图2为供液气压脉冲波形图。
具体实施方式
19.以下结合附图和实施例对本发明进行详细描述。
20.微囊化装置示意图如图1所示。该装置由腔体1、内层流体储液腔2、同轴喷嘴3、电磁阀4、电磁阀控制器5、调压阀6、进气路径7、排气路径8、气压传感器9、高压气源10、加液孔11、收集器12、高压电源13组成。
21.外层流体存储于腔体1底部，与同轴喷嘴3的外层连通。内层流体存储于内层流体储液腔2内，与同轴喷嘴3的内层连通。内、外层流体是隔开的，但是共享共同液面上方的空间，以及共同的气压压强。腔体1通过在顶部的排气路径8连接外界的大气压。腔体1通过电磁阀4和调压阀6连接高压气源10。电磁阀控制器5连接并控制电磁阀4的导通时间，调压阀6控制电磁阀前端的气压压强。腔体1侧壁设有气压传感器9；加液孔11设置在腔体1顶部的一侧。高压电源13正负极分别连接同轴喷嘴3和收集器12，收集器12置于喷嘴3下方以便于收集微滴。
22.外层流体为海藻酸钠溶液，储存于腔体1底部。混合有细胞的羧甲基纤维素钠溶液为内层流体，储存于内层储液腔2内。电磁阀4短暂导通，在腔体1液面上方空间产生类似图2的气压脉冲。从而实现脉冲式供液。
23.喷射工作原理是通过高压电源13在同轴喷嘴3和收集器12之间施加恒定的电压，产生恒定的电场。第一个正压过程使内外层流体按照一定比例从同轴喷嘴3喷出形成液带。并使得液面体积短暂超过阈值vc，随后液带会在电场力作用下迅速形变，形成“泰勒锥”，而后泰勒锥断裂形成微滴。液滴具有壳-芯结构，滴入置于喷管下方盛有cacl2水溶液的收集器中，海藻酸钠水溶液与cacl2反应迅速形成水凝胶，将液态的芯流体包封，形成水凝胶微囊。
24.第一个负压过程会使的未断裂的液体重新返回储液腔内。第一个负压过程以后的压强振荡幅值迅速衰减，对微滴喷射过程的影响有限，最后腔体1液面上方空间的气压会趋于外界大气压。这样的脉冲式供液可以有效抑制气压脉冲以外的时间中发生微滴喷射，从
而实现按需喷射。
25.具体实施步骤描述如下：
26.s1：配置海藻酸钠水溶液和羧甲基纤维素钠水溶液通过加液孔分别注入腔体1和内层流体储液腔2，作为外层流体和内层流体。依据需要将细胞混入羧甲基纤维素钠水溶液中作为内层流体以便被包封。并配置cacl2加入收集器中。
27.s2：调节高压气源使其压强p0至常用最适压强值并通过电磁阀控制器达到需要的工作频率与导通时间，在调节好之后喷口处液体体积应短暂大于临界体积vc。
28.s3：打开喷嘴与收集板之间的电压并调节大小使得在气压脉冲与电场的双重作用下微滴开始正常产生，装置开始按需产生直径较小的内外层结构的微液滴。
29.s4：具有内外层结构的微液滴被盛有cacl2的收集器收集，海藻酸钠壳层与cacl2反应，成为包裹具有流体特征的羟甲基纤维素钠溶液的微胶囊。
30.实施例
31.研究表明当内外层流速比为1:8，可以在维持较高的包封成功率的同时控制微囊尺寸。我们提出此气压脉冲供液和ehd混合驱动的同轴微囊产生装置还有如下特性。首先：如果内外喷嘴内径和外径分别为r1、r2、r3、r4。内管的长度为l1，外管的长度为l2。为了能够让芯流体和壳流体的储液腔共享同一个压强脉冲产生装置即在相同的压强差条件下，使得内外层流体流速比值处于在1:8附近范围，需要设计配置内外喷管的几何参数。根据泊肃叶定理，芯流体的流速满足：
[0032][0033]
而如果满足π(r3+r2)明显大于(r
3-r2)，则壳流体的流速近似等于
[0034][0035]
依此可在确定流速的条件下设计配置内外喷管的几何参数。
[0036]
根据实验研究，外层流体为2％的海藻酸钠溶液时，微囊对细胞的包封效果理想。海藻酸钠浓度为2％时，粘度系数为500mpa
·
s。而1％的羧甲基纤维素钠水溶液已经被用于细胞的包封，并作为微囊的芯流体材料。1％的羧甲基纤维素钠水溶液粘度约为50mpa
·
s。如后文所述，正是由于选择1％羧甲基纤维素钠水溶液作为芯流体，才可以利用合理的几何尺寸的内外喷管实现上述内外层流速比例。因此，选择1％羧甲基纤维素钠水溶液或者其他粘度系数约为50mpa
·
s的流体作为内层流体是本发明申请的重要组成部分。
[0037]
喷管选择标准的不锈钢毛细管，内层喷管为30g，内外半径分别为0.08mm和0.15mm。外层喷管为21g，内外半径分别为0.25mm和0.4mm。这样的搭配也是商用同轴针头的常见选择。通过公式(1)(2)计算，设计外喷管长度为2mm；内喷管长度为8mm。这个条件下，内外层流体的流速比例为1:10。这个流速比例下可以很好地实现微囊和内层流体的包封。而且内外喷管的几何尺寸使得整个喷头设计、加工、组装都容易实现。喷嘴处的液体体积临界值vc约为250-300nl。设置气压脉冲幅值为3-4个大气压条件，电磁阀开启时间延时约为15-20ms。
[0038]
应该指出，内层流体选择1％纤维素钠水溶液不仅适用于细胞包封和培养，如果芯流体采用低粘度的细胞培养基，例如1640培养基的粘度仅为1mpa
·
s，如果希望实现同样的
内外层流速比例，则内喷管的长度需要达到500mm，远远大于外层喷管的长度，这样的尺寸设计显然是不合理的。