类器官高效编辑方法与流程

1.本技术涉及基因编辑技术，更具体的涉及运用慢病毒侵染的方法对类器官进行基因编辑的技术。


背景技术：

2.类器官是体外培养的三维结构的细胞培养物，主要来源于组织、胚胎干细胞或诱导多功能干细胞，由于它的自我更新及分化能力，可分化成多个类器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关系统。对于类器官的研究，以前很多都是在pdx小鼠上建立模型，进行相关研究，这种方法费时且花费高，自从3d模型出现后，越来越多的人选择在3d模型进行疾病及治疗研究，可以节省时间成本。目前针对类器官编辑的方法有两种，一种是电转化，首先电转化时类器官数量受限制，只是小体积电转染，即进行电转染时，所述同时进行电转染的类器官总体积较小。这样并不能满足之后应用，如文库构建；其次对于较大的质粒，单次电转效率较低，而如果分两步电转，会造成类器官活率下降的问题；另一种是慢病毒侵染，这种方法不受类器官慢病毒转染类器官时同时转染的类器官的总细胞起始量的限制，但现有技术中慢病毒侵染类器官时，会出现侵染效率与编辑效率双低的问题；这些类器官来源基本上都是正常组织或肿瘤组织，很少有从pdx小鼠瘤分离原代肿瘤细胞来源类器官进行编辑，本技术在慢病毒侵染的基础上，通过对类器官培养基及侵染方法、侵染时间的改进，大大地增加了大质粒侵染及编辑效率，为了深入研究癌症发生机制以及药物新靶点的发现提供研究基础。


技术实现要素：

3.为了解决现有技术中肿瘤原代肿瘤细胞来源的类器官不易培养、侵染效率及编辑效率较低等问题，本技术提供了一种基因编辑类器官的方法，其包括：用慢病毒转染将cas9酶及grna同时导入类器官并进行表达。
4.1.一种基因编辑类器官的方法，其包括：
5.将包装有cas9蛋白编码序列及grna编码序列的慢病毒与类器官混合形成混合物；
6.将所述慢病毒与所述类器官的混合物共同培养。
7.2.根据项1所述的方法，其中所述类器官由人源肿瘤异种移植模型(pdx)动物瘤分离的原代肿瘤细胞培养而成，
8.其中，在原代肿瘤细胞培养得到类器官的过程中使用基质胶。
9.3.根据项2所述的方法，其中将所述慢病毒与所述类器官混合前，所述类器官经温和的蛋白消化酶处理以与所述基质胶分离并分裂成均一大小的小型类器官，所述蛋白消化酶优选tryple。在一些实施方案中，所述经温和的蛋白消化酶处理的时间为3至15分钟。在一些实施方案中，所述经温和的蛋白消化酶处理的时间为10分钟。
10.4.根据项1-3中任一项所述的方法，其中在将所述慢病毒与所述类器官混合时，还在所述混合物中加入了助染试剂，优选所述助染试剂为transdux max转染试剂或与其有效
成分相同的转染试剂。
11.5.根据项1-4中任一项所述的方法，其中所述cas9蛋白为spcas9蛋白。
12.6.根据项1-5中任一项所述的方法，其中cas9蛋白编码序列及grna编码序列通过同一慢病毒表达载体包装到慢病毒中。
13.7.根据项6中所述的方法，其中所述慢病毒表达载体还进一步包含筛选标记基因，优选所述筛选标记为荧光蛋白。
14.8.根据项6或7中的方法，其中所述慢病毒表达载体大于9kb，例如9.5kb，10kb，11～30kb、12～25kb、13～20kb、14kb等。
15.9.根据项1-8中任一项所述的方法，其中所述共同培养包括：
16.离心孵育步骤和基质胶培养步骤，
17.其中，所述离心孵育步骤是对所述混合物进行离心，所述离心孵育步骤中不加入基质胶；
18.所述基质胶培养步骤是将离心后的所述混合物中的类器官与基质胶混合并在培养基中培养。
19.10.根据项9所述的方法，所述离心的条件为100～800g，0.5～3h；优选地为500～800g，1～2h；最优选地为600g，1h。
20.11.根据项9或10所述的方法，其中所述共同培养还包括：
21.在离心孵育步骤和基质胶培养步骤之间的静置孵育步骤，
22.所述静置孵育步骤是将所述混合物静置孵育1～6h，例如3～6h，4.5～5h等；优选地为4h。
23.12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，所述离心孵育步骤在常温下进行。
24.13.一种用慢病毒转染类器官的方法，其包括：
25.将慢病毒与类器官混合形成混合物；
26.将所述慢病毒与所述类器官的混合物共同培养。
27.在一些实施方案中，所述类器官为由人源肿瘤异种移植模型(pdx)动物瘤分离的原代肿瘤细胞培养而成。
28.在一些实施方案中，所述类器官为经较大类器官经过蛋白酶消化处理形成的小型类器官。
29.在一些实施方案中，所述经温和的蛋白消化酶处理的时间为3至15分钟。在一些实施方案中，所述经温和的蛋白消化酶处理的时间为10分钟。
30.14.根据项13所述的方法，其中在将所述慢病毒与所述类器官混合时，还在所述混合物中加入了助染试剂，优选所述助染试剂为transdux max转染试剂或与其有效成分相同的转染试剂。
31.15.根据项13或14的方法，其中所述共同培养包括：
32.离心孵育步骤和基质胶培养步骤，
33.其中，所述离心孵育步骤是对所述混合物进行离心，所述离心孵育步骤中不加入基质胶；
34.所述基质胶培养步骤是将离心后的所述混合物中的类器官与基质胶混合并在培养基中培养。
35.16.根据项15中所述的方法，所述离心的条件为100～800g，0.5～3h；优选地为500～800g，1～2h；最优选地为600g，1h。
36.17.根据项15或16所述的方法，其中所述共同培养还包括：
37.在离心孵育步骤和基质胶培养步骤之间的静置孵育步骤，
38.所述静置孵育步骤是将所述混合物静置孵育1～6h；优选地为3～6h；最优选地为4h。
39.在一些实施方案中，所述离心孵育步骤在常温下进行。
40.18.一种使用如项1～12中任一项所述方法编辑的类器官。在一些实施方案中，所述类器官为经过如项1～12中任一项所述方法编辑7至10天后的类器官，例如经过如项1～12中任一项所述方法编辑8天或9天后的类器官，或者经过如项1～12中任一项所述方法编辑11、12、13、14、15、16、17、18、或19天的类器官。
41.19.一种由项18中所述的类器官组成的类器官基因文库。
42.20.一种将如项18中所述的类器官用于疾病机理及治疗研究的用途。
43.21.一种使用如项19中所述的类器官基因文库进行高通量筛选的方法，所述高通量筛选选自：功能基因筛选、药物靶点筛选、药物敏感基因筛选、及耐药基因筛选中的任意。
44.在上述实施方案中，优选原代肿瘤细胞为原代肠癌细胞。
45.本技术的技术方案一方面解决了获取大量类器官来源的问题，另一方面提高了类器官的编辑效率，简化了筛选流程，同时解决了较大质粒侵染类器官效率低的问题。使用本技术的技术方案，可以更为轻松地大量获取经精准编辑的类器官，为基于类器官的基因功能研究，药物筛选、研究及开发提供了进一步的支持。
附图说明
46.图1为来源于原代肿瘤细胞的类器官；
47.图2为传代后的类器官；
48.图3侵染3天后类器官的白光(左图)和绿色荧光图片(右图)；
49.图4为一步法侵染类器官样本1第10天的白光(左图)和绿色荧光图片(右图)；
50.图5为一步法侵染类器官样本2第10天的白光(左图)和荧光图片(右图)；
51.图6为两步法侵染20天后的类器官，用于显示编辑效率，其中6a为白光图片，6b为gfp荧光图片，6c为mcherry荧光图片；
52.图7类器官电转后48小时白光(左)及荧光(右)图片；
53.图8pcrispr-gfp质粒图谱。
54.发明详述
55.癌症是全世界的一大健康难题，我们还需要更多创新靶向疗法。在新药和新疗法的研发过程中，好的肿瘤模型由于可以较好地复制肿瘤的组织复杂性与遗传异质性，往往影响着研发最终的成败。而与诸多临床前模型相比，类器官在成功率、维护难度、筛选难度上均表现出了良好的潜力。而基因编辑技术有助于针对性地生成具有目的突变的类器官，提供更加灵活丰富的类器官模型。然而，现有技术中类器官的基因编辑效率很低，编辑流程花费时间较长，并且难以扩大编辑规模。
56.为解决上述技术问题，本技术提供了改进的基因编辑类器官的方法；转染类器官
的方法；用所述基因编辑类器官的方法编辑的类器官以及使用所述方法构建类器官文库的方法，用所述构建类器官文库的方法构建的类器官基因文库；以及所述基因编辑的类器官以及所述类器官文库的用途。
57.定义
58.如本文所用，术语“原代肠癌细胞”是指从肠癌病人肠道恶性肿瘤组织或者pdx肿瘤模型小鼠肿瘤中分离的肠瘤细胞，以及通过将所述肠癌细胞在不经任何修饰改造的情况下，在体外进行扩增培养获得的细胞。
59.如本文所用，术语“原代肿瘤细胞”是指从肿瘤病人的肿瘤或者pdx肿瘤模型动物肿瘤中分离的肿瘤细胞，以及通过将所述肿瘤细胞在不经任何修饰改造的情况下，在体外进行扩增培养获得的细胞。本文所述原代肿瘤细胞包括例如原代肠癌细胞、原代黑色素瘤细胞，原代甲状腺癌细胞，原代肾癌细胞，原代皮肤癌细胞，原代骨癌细胞。
60.如本文所用，术语“类器官”是指一类由干细胞，可以是多能干细胞或成体干细胞，在体外培养时形成的能够进行自我组装的微观三维结构。在本技术中如无特别指明，则可与“肿瘤类器官”互换使用，即其为由肿瘤原代肿瘤细胞培养而成具有三维结构和肿瘤微环境的细胞团块。
61.如本文所用，术语“pdx动物模型”是指将肿瘤患者的肿瘤组织移植至重症免疫缺陷型动物体内，并使肿瘤组织在所述重症免疫缺陷型动物体内生长而构建成的一种肿瘤模型。在一些实施方案中，所述重症免疫缺陷型动物包括重症免疫缺陷型的大鼠、小鼠等。在一些实施方案中，所述重症免疫缺陷型动物包括fpg大鼠、f334rg大鼠、rag2大鼠、scid大鼠、nude小鼠、beige小鼠、xid小鼠、scid小鼠、nod/scid小鼠、bnx小鼠等。当所述重症免疫缺陷型动物为重症免疫缺陷型小鼠时，则所述“pdx动物模型”为“pdx小鼠模型”。“pdx小鼠瘤”则是指“pdx小鼠模型中”由患者肿瘤组织移植形成的肿瘤。
62.如本文所用，术语“助染试剂”是指帮助慢病毒侵染细胞的试剂，能够增加病毒与细胞的接触，最大限度促进病毒感染细胞，其包括polybrene(聚凝胺)，transdux等试剂，优选地为polybrene，transdux，更优选地为transdux。本领域技术人员应当知晓，具有与transdux等转染试剂相同有效成分的其他转染试剂也可用于本技术的技术方案中以发挥同样的作用。
63.如本文所用，术语“基质胶”是一种基底膜基质，在细胞或类器官培养的过程中，可聚合形成具有生物活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜结构、组成、物理特性和功能。基质胶主要是一些多糖和蛋白,或蛋白聚糖，这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。在一些实施方案中，所述基质胶可以提取自动物组织。在一些实施方案中，所述基质胶提取自富含胞外基质蛋白的ehs小鼠肿瘤。
64.如本文所用，术语“spcas9”是指来源脓性链球菌的cas9蛋白。如cong l,ran fa,cox d,lin s,barretto r,habib n,hsu pd,wu x,jiang w,marraffini la,zhang f.multiplex genome engineering using crispr/cas systems.science.2013.15；339(6121):819-23.公开文献所述。公开文献所述。
65.如本文所用，术语“慢病毒表达载体”是一种基于hiv基因组的病毒载体，其包含包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，并可携带外源核酸序列。当所述慢病毒表达载体与包含有可提供所有的转录并包装rna到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白的慢病毒
regularly interspaced short palindromic repeats,成簇规律间隔短回文重复序列)基因编辑系统中用于在靶标核酸序列的特定位置制造双链断裂的一种核酸内切酶。所述crispr基因编辑系统还进一步包括一条短rna，称为grna。所述grna包含与靶标核酸序列互补的序列，且当其与靶标核酸序列互补杂交则可招募cas9至靶标核酸序列的特定位置。术语“spcas9”是指来源脓性链球菌的cas9蛋白，如cong l,ran fa,cox d,lin s,barretto r,habib n,hsu pd,wu x,jiang w,marraffini la,zhang f.multiplex genome engineering using crispr/cas systems.science.2013.15；339(6121):819-23公开文献所述。
73.如本文所用，术语“筛选标记基因”是一种已知功能及序列的基因，通过所述已知的功能或序列可区分包含“筛选标记基因”的细胞、病毒或生物体及不包含“筛选标记基因”的细胞、病毒或生物体。常见的“筛选标记基因”包括荧光素酶基因、抗性基因等。所述“筛选标记基因”转录或表达的rna或蛋白等可调节生理功能的物质称为“筛选标记”。
74.如本文所用，所述“高通量筛选”通过对包含不同基因型的细胞混合物施加某种外部压力来富集或减少所述细胞混合物中某些基因型细胞的比例，并通过测序或二代测序(“ngs”)等方法测定经施加外部压力后细胞混合物中不同基因型的拷贝数并进行分析，从而鉴定出编码基因、非编码rna和调节元件的功能，实现对海量基因型同时进行筛选和分析的目的。所述高通量筛选包含例如cn106637421a中所述的高通量功能性筛选。
75.如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的各个值的通常误差范围。提及“约”值或参数在本文中包括(及描述)针对该值或参数本身的实施方案。如本文所使用的，当术语“约”在数值之前时，表示该数值上或下10％的范围内。例如，“约100”涵盖90和110。
76.除非本文另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
77.基因编辑类器官的方法
78.目前类器官编辑方法，有两种，一种为电转化，另一种为慢病毒侵染，经过一系列预实验，基于慢病毒转染体现出的更高效的编辑效率和对类器官更小的损伤性，并且解决了用电转方法类器官起始量受限的问题，因此本技术主要采用慢病毒侵染方法。此外，发明人还比较了使用慢病毒一步将cas9蛋白和sgrna同时导入类器官的方法与分两步法将cas9蛋白和sgrna分别导入类器官的方法，结果显示出一步法显著的优势。其效率更高，流程更短，且对类器官损伤更小，最大限度地保留了类器官的正常功能，不会影响后续实验。因此，本技术提供了一种基因编辑类器官的方法，其包括：将包装有cas9蛋白编码序列及grna编码序列的慢病毒与类器官混合形成混合物；将所述慢病毒与所述类器官的混合物共同培养。在一些实施方案中，与cas9蛋白编码序列同时导入类器官并进行表达的grna多于1种。在一些实施方案中，与cas9蛋白编码序列同时导入类器官并进行表达的grna多于一种且分别靶向不同的目的基因序列。在一些实施方案中，所述方法导致类器官基因组中的一个或多个基因修饰。在一些实施方案中，所述方法导致类器官形成嵌合体。
79.在一些实施方案中，所述类器官由从组织中分离出的干细胞通过植入三维框架分化生长而成或由pdx动物模型瘤分离的原代肿瘤细胞培养而成。由于使用pdx动物模型分离的原代肿瘤细胞进行类器官培养，在培养过程中不用添加其他因子辅助，且不影响类器官
生长，可在类器官上进行药物筛选，这样不会因为添加辅助因子而影响药物在类器官上的作用。因此，在优选的实施方案中，所述类器官由pdx动物模型瘤分离的原代肿瘤细胞培养而成。在一些实施方案中，所述pdx动物模型在包括重症免疫缺陷型大鼠模型或重症免疫缺陷型小鼠模型上建立。在一些实施方案中所述pdx动物模型在选自fpg大鼠、f334rg大鼠、rag2大鼠、scid大鼠、nude小鼠、beige小鼠、xid小鼠、scid小鼠、nod/scid小鼠、bnx小鼠的动物模型上建立。在一些实施方案中，所述类器官由pdx小鼠瘤分离的原代肿瘤细胞培养而成。在一些实施方案中，将所述pdx小鼠瘤分离的原代肿瘤细胞培养为所述类器官的步骤包括：将基质胶与pdx小鼠瘤分离的原代肿瘤细胞混合后共同培养。其中，在一些实施方案中，将所述慢病毒与所述类器官混合前，所述类器官经温和的蛋白消化酶处理以与所述基质胶分离并分裂成均一大小的小型类器官，所述蛋白消化酶优选tryple。在一些实施方案中，在当所述原代肿瘤细胞形成3d结构，其中心腔由单层上皮和隐窝状区域围绕，加入温和的蛋白消化酶溶液，吹打类器官并将其消化成均一大小的类器官。在一些特定的实施方案中，所述温和的蛋白消化酶为tryple，其处理所述类器官的时间为约3至15分钟。在一些实施方案中，tryple处理所述类器官的时间为3至15分钟。在一些实施方案中，tryple处理所述类器官的时间为4至14分钟。在一些实施方案中，tryple处理所述类器官的时间为5至13分钟。在一些实施方案中，tryple处理所述类器官的时间为6至12分钟。在一些实施方案中，tryple处理所述类器官的时间为7至11分钟。在一些实施方案中，tryple处理所述类器官的时间为约10分钟，例如约8至9分钟。
80.在本文中，tu是指transduction units的简写,某些病毒是可以整合到宿主染色体内，如慢病毒(lentivirus)，所以采用tu(transduction units)来表示慢病毒的滴度。滴度单位：tu/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。tu即为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
81.通常可以采用稀释计数法或定量pcr法来测定慢病毒的tu。
82.在本技术中，例如可以采用梯度稀释方法来测定慢病毒的tu。运用梯度稀释的方法检测病毒滴度，步骤如下：(1)接种2000-5000个目的细胞于96孔培养板中，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养；(2)细胞接种过夜后，按照梯度稀释的方法分别加入含有不同体积的浓缩后病毒原液的细胞培养基，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养；(3)病毒侵染24h后，更换细胞培养基，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养；(4)病毒侵染48h后，弃去细胞原液，用pbs缓冲液清洗后，置于37℃、5％co2细胞培养箱中进行静置培养；(5)静置培养48h-72h后，可观察到被病毒成功侵染的细胞可呈现gfp荧光；(6)通过流式或者荧光分光光度计检测gfp荧光强度，通过计算被侵染细胞所占的荧光比例评估病毒侵染效率，并按照如下公式一计算病毒滴度。
[0083][0084]
在一些实施方案中，将所述pdx小鼠瘤分离的原代肿瘤细胞种在基质胶中培养，其中所述pdx小鼠瘤分离的原代肿瘤细胞的密度为：5e+03个/孔，优选地为1e+04～5e+04个/孔，更优选地为1e+05个/孔。
[0085]
所述cas9蛋白为spcas9。在一些实施方案中，所述cas9蛋白编码序列及所述grna编码序列通过同一慢病毒表达载体包装到慢病毒中。在一些实施方案中，所述cas9蛋白编
码序列及所述grna编码序列位于通过不同慢病毒表达载体包装到不同慢病毒中。在一些实施方案中，所述cas9蛋白编码序列与部分所述grna编码序列通过相同慢病毒表达载体包装到同一慢病毒中且另一部分grna编码序列通过另外的慢病毒表达载体包装导另外的慢病毒中。在一些实施方案中，所述慢病毒载体选自：pv2、pcmv、px458等。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体还进一步包含筛选标记基因，优选所述筛选标记为荧光蛋白。在一些实施方案中，所述荧光蛋白为gfp。由实施例可以看出，使用本技术的技术方案，可以提升较大质粒的转染效率，例如图8中超过9kb的pcrispr-gfp质粒。因此，在一些实施方案中，所述慢病毒载体大于9kb，例如9.5kb，10kb，11～30kb、12～25kb、13～20kb、14kb等。经过纯化，慢病毒可以更好地定量以及更高效地感染类器官。
[0086]
在一些实施方案中，用慢病毒转染将cas9酶及grna同时导入类器官并进行表达时，所述表达通过慢病毒上带有的启动子启动表达。在一些实施方案中，cas9蛋白编码序列及grna编码序列前还带有一个外源的启动子，在所述编码序列整合入宿主基因组之后，所述外源启动子将启动cas9蛋白和grna的表达。在一些特定的实施方案中，所述外源启动子选自真核生物启动子的一种。在一些特定的实施方案中，所述外源启动子源自哺乳动物启动子。在一些实施方案中，所述外源启动子选自：cmv、ef1a、β肌动蛋白基因启动子，sv40、pgk1、ubc、cag、tre、uas、u6。在一些实施方案中，所述表达通过慢病毒将cas9蛋白编码序列及grna编码序列定点整合至宿主细胞基因组中，借用宿主细胞中天然存在的启动子进行表达。。在一些实施方案中，所述cas9蛋白及grna位于同一慢病毒载体。在一些实施方案中，所述cas9蛋白为spcas9蛋白。
[0087]
在一些实施方案中，在在将所述慢病毒与所述类器官混合时，还在所述混合物中加入了助染试剂，优选所述助染试剂为transdux max转染试剂或与其有效成分相同的转染试剂。
[0088]
在一些实施方案中，在一些实施方案中，将所述慢病毒与所述类器官共同培养包括：离心孵育步骤和基质胶培养步骤。其中，所述离心孵育步骤是对所述混合物进行离心，所述离心孵育步骤中不加入基质胶；所述基质胶培养步骤是将离心后的所述混合物中的类器官与基质胶混合并在培养基中培养。在一些实施方案中，所述离心的条件为100～800g，0.5～3h；优选地为500～800g，1～2h；最优选地为600g，1h。
[0089]
在一些实施方案中，所述共同培养还进一步包括在离心孵育步骤和基质胶培养步骤之间的静置孵育步骤，所述静置孵育步骤是将所述混合物静置孵育1～6h；优选地为3～6h；最优选地为4h。在一些实施方案中，所述离心孵育、静置孵育和基质胶是在利于所述类器官生长的温度、湿度及二氧化碳浓度下进行的。在一些实施方案中，所述利于所述类器官生长的温度为37℃。
[0090]
构建基因编辑类器官的方法
[0091]
本技术还提供了一种基因编辑类器官的方法，其包括：首先将包装有cas9蛋白编码序列及sgrna编码序列的慢病毒加入到包含原代肿瘤细胞的液体基质中；然后将所述慢病毒与所述原代肿瘤细胞共同培养；之后筛选经编辑的原代肿瘤细胞；最后利用基质胶将经筛选的原代肿瘤细胞培养成类器官；其中将所述慢病毒加入到包含原代肿瘤细胞的液体基质中时，所述原代肿瘤细胞为非贴壁状态。在一些实施方案中，在利用饲养层细胞对原代肿瘤细胞进行扩增培养之后，去除饲养层细胞以控制所述饲养层细胞占饲养层细胞和原代
肿瘤细胞总数的比例在5％以下，优选在4％以下，进一步优选在3％以下，进一步优选在2％以下，进一步优选在1％以下。在一些实施方案中，所述cas9蛋白为spcas9蛋白。
[0092]
在一些实施方案中，所述原代肿瘤细胞为pdx动物瘤分离的原代肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述pdx动物属于scid大鼠、nude小鼠、beige小鼠、xid小鼠、scid小鼠、nod/scid小鼠或bnx小鼠。在一些实施方案中，所述原代肿瘤细胞为pdx小鼠瘤分离的原代肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述原代肿瘤细胞为pdx小鼠瘤分离的原代肠癌细胞，所述pdx小鼠瘤由人类肠癌组织分离并接种至重症免疫缺陷小鼠而形成。
[0093]
在一些实施方案中，与所述cas9蛋白编码序列共同导入原代肿瘤细胞的grna编码序列多于1种，且每种序列编码的grna靶向不同基因位点，从而导致原代肿瘤细胞基因组中的一个或多个基因修饰。在一些实施方案中，与所述cas9蛋白编码序列同时导入原代肿瘤细胞的grna编码序列仅靶向同一基因位点。
[0094]
在一些实施方案中，所述在一些实施方案中，所述cas9蛋白编码序列及所述grna编码序列通过同一慢病毒表达载体包装到慢病毒中。在一些实施方案中，所述cas9蛋白编码序列及所述grna编码序列位于通过不同慢病毒表达载体包装到不同慢病毒中。在一些实施方案中，所述cas9蛋白编码序列与部分所述grna编码序列通过相同慢病毒表达载体包装到同一慢病毒中且另一部分grna编码序列通过另外的慢病毒表达载体包装导另外的慢病毒中。在一些实施方案中，所述慢病毒载体选自：pv2、pcmv、px458等。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体还进一步包含筛选标记基因，优选所述筛选标记为荧光蛋白。在一些实施方案中，所述荧光蛋白为gfp。
[0095]
在一些实施方案中，所述cas9蛋白编码序列及所述grna编码序列通过慢病毒上带有的启动子启动表达。在一些实施方案中，所述cas9蛋白编码序列及所述grna编码序列前还带有一个外源的启动子，在所述编码序列整合入宿主基因组之后，所述外源启动子将启动cas9蛋白和grna的表达。在一些特定的实施方案中，所述外源启动子选自真核生物启动子的一种。在一些实施方案中，所述外源启动子选自：cmv、ef1a、β肌动蛋白基因启动子，sv40、pgk1、ubc、cag、tre、uas、u6。在一些实施方案中，所述表达通过慢病毒将cas9蛋白编码序列及grna编码序列定点整合至宿主细胞基因组中，借用宿主细胞中天然存在的启动子进行表达。
[0096]
在一些实施方案中，在将所述慢病毒加入包含原代肿瘤细胞的液体基质的步骤中，还向所述液体基质中加入助染试剂。在一些实施方案中，所述助染试剂为polybrene。在一些优选的实施方案中，所述试剂为transdux max转染试剂或与其有效成分相同的转染试剂。
[0097]
在一些实施方案中，所述将所述慢病毒与所述原代肿瘤细胞共同培养包括离心孵育步骤和贴壁培养步骤，其中，所述离心孵育步骤是对加入有慢病毒的包含原代肿瘤细胞的液体基质进行离心，所述离心孵育的过程中，原代肿瘤细胞为非贴壁状态；所述贴壁培养步骤是将离心后的包含慢病毒和原代肿瘤细胞的液体基质加入到包含贴壁培养的饲养层细胞的培养基中进行静置培养。在一些实施方案中，所述饲养层细胞选自成纤维细胞、子宫上皮细胞、大鼠肝细胞，优选为成纤维细胞，进一步优选为小鼠成纤维细胞。在一些实施方案中，所述离心的条件为200～1000g，1～2h；优选地为600～1000g，1～2h；最优选地为600g，1h。
[0098]
在一些是实施方案中，所述共同培养还包括：在离心孵育步骤和贴壁培养步骤之间还包括静置孵育步骤，所述静置孵育步骤是将离心后的包含慢病毒和原代肿瘤细胞的液体基质静置孵育1～6h，优选为2～4h，进一步优选为4h，在所述静置孵育步骤中，所述原代肿瘤细胞为非贴壁状态。
[0099]
在一些实施方案中，筛选经编辑的原代肿瘤细胞时所述原代肿瘤细胞达到了≥约70％的汇合度，例如约例如75％、80％、90％、95或100％的汇合度。在一些实施方案中，由于所述慢病毒表达载体还进一步包含筛选标记基因，且所属筛选标记为荧光蛋白，因此所述筛选通过流式细胞仪基于荧光强度进行。
[0100]
在一些实施方案中，利用基质胶将经筛选的原代肿瘤细胞培养成类器官的步骤包括：将原代肿瘤细胞与基质胶混合后在类器官培养基中共同培养。在一些实施方案中，将所述原代肿瘤细胞与其同等体积的基质胶共同培养。
[0101]
转染类器官的方法
[0102]
本技术还提供了一种转染类器官的方法，其包括将慢病毒与类器官混合形成混合物；以及将所述慢病毒与所述类器官的混合物共同培养。在一些实施方案在，在将所述慢病毒与所述类器官混合时，还在所述混合物中加入了助染试剂。在一些实施方案中，所述助染试剂选自polybrene。在一些优选的实施方案中，所述助染试剂为transdux max转染试剂或与其有效成分相同的转染试剂。
[0103]
在一些实施方案中，所述类器官为由人源肿瘤异种移植模型(pdx)动物瘤分离的原代肿瘤细胞培养而成。在一些实施方案中，所述类器官为经较大类器官经过蛋白酶消化处理形成的小型类器官。在一些实施方案中，各所述小型类器官由约在一些实施方案中，所述经温和的蛋白消化酶处理的时间为3至15分钟。在一些实施方案中，所述经温和的蛋白消化酶处理的时间为10分钟。
[0104]
在一些实施方案中，将所述慢病毒与所述类器官的混合物共同培养包括离心孵育步骤和基质胶培养步骤，其中，所述离心孵育步骤是对所述混合物进行离心，所述离心孵育步骤中不加入基质胶；所述基质胶培养步骤是将离心后的所述混合物中的类器官与基质胶混合并在培养基中培养。
[0105]
在一些实施方案中，所述离心的条件为100～800g，0.5～3h；优选地为500～800g，1～2h；最优选地为600g，1h。在一些实施方案中，所述共同培养还包括：在离心孵育步骤和基质胶培养步骤之间的静置孵育步骤，所述静置孵育步骤是将所述混合物静置孵育1～6h；优选地为3～6h；最优选地为4h。
[0106]
基因编辑的类器官及其用途
[0107]
本技术还提供了使用前述任一种方法编辑的类器官；以及所述类器官的用途。在一些实施方案中，所述类器官为肿瘤类器官。在一些实施方案中，所述肿瘤类器官由pdx小鼠瘤分离的原代肿瘤细胞培养而成，然后经过如前所述的基因编辑类器官的方法编辑。在一些实施方案中，所述肿瘤类器官由如前所述的构建基因编辑类器官的方法由原代肿瘤细胞起始构建而成。在一些实施方案中，所述类器官为经过前述任一种方法基因编辑7天之后的类器官。在一些实施方案中，所述类器官为经过前述任一种方法基因编辑10天之后的类器官。在一些实施方案中，所述类器官为经过前述任一种方法基因编辑10至20天的类器官，例如经过基因编辑11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天或19天的类器官。
[0108]
在一些实施方案中，所述类器官可用于，例如寻找或研究肿瘤对某种抗癌药物耐药或敏感的驱动基因或进行抗肿瘤药物相关的试验。例如，在一些实施方案中，所述肿瘤器官为肠癌肿瘤类器官，因此其可用于研究肠癌的敏感及耐药机制、并初步测试药物的有效性。由于类器官更接近于真实的肿瘤，因此与2d细胞相比，直接用类器官进行肿瘤功能及治疗等相关研究可以节省在细胞系上的研究的时间及花费，有助于更快的突破肿瘤治疗的瓶颈。类器官文库、其构建方法及用途
[0109]
本技术还提供了使用前述任一种方法构建类器官基因文库的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：使用靶向不同基因序列的grna编码序列分别通过前述“基因编辑类器官的方法”或“构建基因编辑类器官的方法”编辑或构建类器官，形成多种分别具有不同突变的类器官，然后将所述具有不同突变的类器官混合在一起形成类器官基因文库。在一些实施方案中，所述构建类器官文库的方法包括：使用前述“基因编辑类器官的方法”，通过向类器官同时加入具有合适量的多种靶向不同基因序列的grna编码序列获取包含含有不同突变的类器官文库。
[0110]
因此，本技术还提供了使用上述方法构建的类器官基因文库。在一些实施方案中，所述类器官基因文库为肿瘤类器官文库。在一些实施方案中，所述类器官文库为结直肠癌类器官文库。
[0111]
由此，本技术还提供了上述类器官文库的用途，包括用于疾病机理及治疗研究的用途。本发明还提供了一种使用如前所述的类器官基因文库进行高通量筛选的方法，所述高通量筛选选自：功能基因筛选、药物靶点筛选、药物敏感基因筛选、及耐药基因筛选。
[0112]
本技术的技术方案一方面解决了获取大量类器官来源的问题，另一方面提高了类器官的编辑效率，简化了筛选流程，同时解决了较大质粒侵染类器官效率低的问题。使用本技术的技术方案，可以更为轻松地大量获取经精准编辑的类器官，寻找有效的耐药或敏感的驱动基因，为基于类器官的基因功能研究、药物筛选、研究及开发提供了进一步的支持。
[0113]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
[0114]
应当理解，以上描述以及随后的实施例旨在说明而不是限制本发明的范围。在本发明范围内的其他方面，优点和修改对于本发明所属领域的技术人员将是显而易见的。
实施例
[0115]
实施例1类器官培养、传代及编辑效率检测方法
[0116]
1.1类器官培养
[0117]
将原代肠癌细胞用200g离心5min；用1ml枪头小心将培养基吸去，不要触碰细胞沉淀；用5ml移液管加入预冷的dmem/f12(gibco，货号：12634-010)培养基(含15mm hepes gibco货号：15630-080，1x glutamax gibco货号：35050-061)，清洗细胞，200g，5min离心；用1ml枪头小心将培养基吸去，不要触碰细胞沉淀；在冰上，向原代细胞中加入培养基(accuroid，货号：32031)以形成细胞悬浊液1，调整原代细胞密度，使每25ul所述细胞悬浊液1中的原代细胞量为1e+05个，加入与所述细胞悬浊液等体积的基质胶(corning，货号：
356231)，并混匀成细胞悬浊液2；将24孔培养板提前至少30min放入37℃预热，在每孔中心位置加入50μl所述细胞悬浊液2，不要产生气泡；在37℃放置10min，每孔沿孔壁加入适量类器官培养基，将所述24孔培养板置于37℃，5％co2培养箱中进行培养(见图1)；铺板后2-3天换液，观察类器官生长状态，换液后2-3天进行传代。
[0118]
1.2类器官传代
[0119]
吸去培养基，用1ml枪头向每孔加入1ml gcdr(stemcell，货号：07174)，消化1min；用1ml枪头吹打类器官，每孔约20次，转入离心管中；室温下，20rpm，震荡10min；450g，离心5min；用1ml枪头慢慢地吸去上清，不要触碰类器官沉淀；加入预冷dmem/f12培养基5-10ml，清洗类器官；450g，5min离心；用1ml枪头慢慢地吸去上清；按照1：2传代。在冰上向类器官加入类器官培养基(accuroid，货号：32031)形成类器官与类器官培养基的混合物1，之后加入与前述混合物1等体积的在冰上融化的基质胶(corning，货号：356231)，配置成混合物2；将混合物2加入至37℃预热30min的24孔板中，在每孔中心位置加入50μl，并于37℃放置10min；每孔沿板壁加入750μl类器官培养基，37℃，5％co2培养(见图2)；每2到3天换液一次，观察类器官生长状态，铺板后7-10天传代。
[0120]
1.3编辑效率检测方法
[0121]
电转或慢病毒侵染类器官10天时，吸去培养基，按1ml/孔加入tryple，吹打类器官，转入离心管中，消化5min。
[0122]
基因组dna提取；按照tiangen试剂盒血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(dp304)方法操作。
[0123]
基因组扩增；加入q5热启动高保真2x缓冲液(neb，货号：m0494l)及1μg模板，按照产品说明书进行操作。
[0124]
对扩增产物进行一代测序。
[0125]
实施例2电转化及慢病毒侵染在类器官编辑中的比较
[0126]
2.1电转化
[0127]
选择增殖速度稳定的类器官，约7天传代一次，用1ml枪头将24孔培养板中培养基吸去。
[0128]
用1ml枪头每孔加入0.5ml tryple(life technology，货号：12604013)，吹打类器官20次，加入离心管中，37℃消化3-10min，将类器官消化成均一大小即可。450g，5min离心。用1ml枪头慢慢地吸去上清，加入5-10ml opti-mem(gibco，货号：31985-062)，清洗类器官。450g，离心5min。用1ml枪头慢慢地吸去上清，用200μl枪头加入100μl opti-mem重悬，加入1mm电转杯(btx，货号：610)中，每个电转条件加入10μg gfp mrna(绿色荧光蛋白mrna)，用btx电转仪进行电转，每个电转条件使用2e+05个细胞。
[0129]
向电转后的类器官分别加入1ml类器官培养基，室温，40min，450g，离心5min。用1ml枪头慢慢地吸去上清，每个电转条件加入75μl类器官培养基，混匀形成类器官与培养基的混合物3，加入75ul基质胶，混匀，然后加至37℃预热30min的24孔培养板中，在每孔中心位置加入50μl后，于37℃放置10min。在每孔沿孔壁加入750μl类器官培养基，37℃，5％co2培养；48-96h观察荧光。
[0130]
2.2慢病毒侵染
[0131]
选择增殖速度稳定的类器官，约7天传代一次，用1ml枪头将培养基吸去。
[0132]
用1ml枪头每孔加入0.5ml tryple，吹打类器官20次，加入离心管中，37℃消化3-10min，类器官消化成均一大小即可；450g，5min离心；用1ml枪头慢慢地吸去上清，加入5ml dmem/f12培养基，清洗类器官；用1ml枪头慢慢吸去上清；加入200μl浓缩病毒(该病毒包装有rb1 sgrna和gfp的dna编码序列；滴度为2e+08tu/ml)及20μl类器官培养基，并加入助染试剂transdux(system biosciences，货号：lv860a-1)；600g，1h离心；在37℃静置孵育4h；加入1ml类器官培养基，混匀，450g，5min离心；用1ml枪头慢慢吸去上清，用75μl类器官培养基重悬，混匀，形成类器官与培养基的混合物4，加入与所述混合物4等体积的基质胶，混匀后加至37℃预热30min的24孔培养板中，在每孔中心位置加入50μl后，于37℃放置10min。每孔沿孔壁加入750μl类器官培养基，37℃，5％co2培养，每2到3天换液一次，每7天传代一次，3至20天持续观察荧光(见图3、图4)，分别在10天、20天检测编辑效率。
[0133]
2.3结果及分析
[0134]
慢病毒侵染条件及结果分析，(1)类器官电转时先测试不同电压下类器官电转效率及类器官生长状态，在100v，200v，300v中只有100v，1ms，2pulse条件下类器官生长状态较好，且有少量荧光，因此在100v条件下，增加脉冲次数，减少脉冲时间，测试类器官电转效率，结果发现通过电转方法，类器官仅在少数条件下具有电转效率，例如100v，0.5-1ms，2-3pulse，见表1。(2)慢病毒侵染类器官，观察荧光比例可达50％以上，检测编辑效率也可到50％左右。类器官电转化与慢病毒侵染方法相比，后者的优势明显，从荧光(见图4、7)上观察，慢病毒侵染后荧光比例明显高于电转化，而编辑效率58％，进一步验证了慢病毒侵染的优势，因此对于类器官，优选慢病毒侵染方式。
[0135]
表1类器官电转结果
[0136][0137]
实施例3一步侵染法与两步侵染法的比较
[0138]
3.1一步侵染法
[0139]
选择增殖速度稳定的类器官，约7天传代一次，用1ml枪头将培养基吸去；用1ml枪头每孔加入0.5ml tryple，吹打类器官20次，加入离心管中，37℃消化3-10min，将类器官消化成均一大小即可；450g，5min离心；用1ml枪头慢慢地吸去上清，加入5ml dmem/f12培养基，清洗类器官；用1ml枪头慢慢吸去上清，加入200μl浓缩病毒(该病毒包装有插入了rb1 sgrna编码序列的pcrispr-gfp表达载体(图8)；由金斯瑞合成；滴度为2e+08tu/ml)及20μl类器官培养基，并加入助染试剂transdux(system biosciences，货号：lv860a-1)；600g，1h
离心；在37℃静置孵育4h；加入1ml类器官培养基，混匀，450g，5min离心；用1ml枪头慢慢吸去上清，分别用75μl类器官培养基重悬，混匀成类器官与培养基的混合物5，加入与所述混合物5等体积的在冰上融化的基质胶，混匀，然后加入至37℃预热30min的24孔培养板中，于每孔中心位置加入50μl，37℃放置10min；每孔沿孔壁加入750μl类器官培养基，37℃，5％co2培养，每2到3天换液一次，7天传代一次，观察3至20天荧光，分别在10天、20天检测编辑效率。
[0140]
3.2两步侵染法
[0141]
选择增殖速度稳定类器官，约7天传代一次，吸去培养基；用1ml枪头向每孔加入0.5ml tryple，吹打类器官20次，加入离心管中，37℃消化3-10min，将类器官消化成均一大小即可；450g，5min离心；用1ml枪头慢慢地吸去上清，加入5ml dmem/f12培养基，清洗类器官；用1ml枪头慢慢吸去上清，分别加入200μl浓缩病毒(该病毒包装有插入cas9及mcherry编码序列的表达载体；滴度为2e+08tu/ml)及20μl类器官培养基，并按照产品说明书加入助染试剂transdux(system biosciences，货号：lv860a-1)；600g，1h离心；在37℃静置孵育4h；加入1ml类器官培养基，混匀，450g，5min离心；用1ml枪头慢慢吸去上清，分别用75μl类器官培养基重悬，混匀形成类器官与类器官培养基的混合物6，加入与所述混合物6等体积的在冰上融化的基质胶，混匀并加入至在37℃预热30min的24孔培养板中，在每孔中心位置加入50μl，于37℃放置10min；每孔沿24孔培养板壁加入750μl类器官培养基，37℃，5％co2培养，每2到3天换液一次，7天传代一次，观察荧光；
[0142]
取侵染10天后的类器官弃去培养基吸去；用1ml枪头每孔加入0.5ml tryple，吹打类器官20次，加入离心管中，在37℃消化3-10min，将类器官消化成均一大小即可；450g，5min离心；用1ml枪头慢慢地吸去上清，加入5ml dmem/f12培养基，清洗类器官；用1ml枪头慢慢吸去上清，分别加入200μl浓缩cas9慢病毒(该病毒包装有插入rb1 sgrna及gfp编码序列的表达载体；金斯瑞合成；滴度为2e+08tu/ml)及20μl类器官培养基，并按照产品说明书加入助染试剂transdux(system biosciences，货号：lv860a-1)；600g，1h离心；在37℃静置孵育4h；加入1ml类器官培养基，混匀，450g，5min离心；用1ml枪头慢慢吸去上清，用75μl类器官培养基重悬，混匀形成类器官与培养基的混合物7，加入与所述混合物等体积的在冰上融化的基质胶，混匀并将其加入于37℃预热30min的24孔培养板中，在每孔中心位置加入50μl，于37℃放置10min；每孔沿24孔培养板壁加入750μl类器官培养基，37℃，5％co2培养，每2到3天换液一次，7天传代一次，观察荧光，侵染10天、20天检测编辑效率。
[0143]
3.3结果与分析
[0144]
用同样的sgrna进行类器官编辑，只是采用不同的侵染步骤，结果见表2，一步法是用同时插入了cas9蛋白编码dna序列及sgrna编码dna序列的浓缩慢病毒侵染类器官，两步法是先用包装有sgrna表达载体的慢病毒侵染类器官，10天后，再用包装有cas9表达载体的慢病毒侵染类器官，两种侵染方法从荧光图片上并无明显差别，分别如图4和图6所示，但一步法侵染在以下方面存在优势，(1)完成时间：一步法从开始到结束仅需10天，荧光及编辑效率就都已稳定，但两步法，从首次慢病毒侵染到第二次慢病毒侵染结束需要12天，由于两次侵染对类器官造成一定伤害，因此编辑效率达到稳定的时间长于20天；(2)编辑效率：一步法侵染10天后，编辑效率可达58％，且编辑效率已稳定，与侵染20天检测无差别，而两步法在侵染完成10天时无编辑效率，在侵染完成20天时编辑效率仅为6％；两者相比，一步法
侵染类器官无论从时间还是编辑效率上都占有优势。
[0145]
表2两种侵染方法编辑效率结果
[0146]
侵染方法检测时间编辑效率一步法10天58％两步法20天6％
[0147]
实施例4运用2d侵染与3d侵染方法编辑类器官的比较
[0148]
4.1运用2d方式侵染类器官
[0149]
选择增殖速度稳定的类器官，约7天传代一次，将24孔培养板中1个孔内的类器官培养基用1ml枪头吸去，加入1ml新鲜类器官培养基；加入50μl包装有同时表达sgrna和cas9载体的慢病毒(pcrispr-gfp；金斯瑞合成；如图8所示)，37℃，5％co2培养24h；用1ml枪头吸去培养基，加入1ml新鲜培养基，37℃，5％co2培养72h，观察荧光。
[0150]
4.2运用3d方式侵染类器官
[0151]
选择增殖速度稳定的类器官，约7天传代一次，吸去培养基；用1ml枪头向每孔加入0.5ml tryple，吹打类器官20次，加入离心管中，37℃消化3-10min，将类器官消化成均一大小即可；450g，5min离心；用1ml枪头慢慢地吸去上清，加入5ml dmem/f12培养基，清洗类器官；用1ml枪头慢慢吸去上清，分别加入200μl包装有同时表达sgrna和cas9载体的慢病毒及20μl类器官培养基，并按照产品说明书加入助染试剂transdux(system biosciences，货号：lv860a-1)，600g，常温1h离心；在37℃静置孵育4h；加入1ml类器官培养基，混匀，450g，5min离心；用1ml枪头慢慢吸去上清，用75μl类器官培养基重悬，混匀成类器官与培养基的混合物8，加入与所述混合物8等体积的在冰上融化的基质胶，混匀并加入至37℃预热30min的24孔板中，每孔中心位置加入50μl，于37℃放置10min；每孔沿孔壁加入750μl类器官培养基，37℃，5％co2培养，每2到3天换液一次，7天传代一次，观察荧光，在此后第10天检测编辑效率。
[0152]
4.3结果及分析
[0153]
(1)用2d侵染方式侵染类器官比较方便，不用进行类器官消化、孵育等步骤，直接加病毒即可，但侵染效率为0％，说明这种方式不适用于类器官侵染；(2)用类器官与慢病毒以共同离心孵育的方式侵染类器官(3d侵染)，在过程上较2d侵染方式繁琐，但从结果来看，无论是荧光还是编辑效率都很好，编辑效率见表3，荧光图片见图4；从两种侵染方式来看，用3d方式侵染类器官，在不影响类器官生长的情况下，可以得到较好的侵染效率，同时也得到了较高的编辑效率
[0154]
表3类器官3d侵染方法的编辑效率
[0155]
sgrna靶向基因编辑效率rb158％dapk146％
[0156]
实施例5慢病毒一步侵染编辑类器官的方法优化
[0157]
5.1不同慢病毒体积侵染
[0158]
选择增殖速度稳定的类器官，约7天传代一次，用1ml枪头吸去培养基，每孔加入0.5ml tryple，吹打类器官20次，加入离心管中，37℃消化10min，类器官消化成均一大小即可；450g，5min离心；用1ml枪头慢慢地吸去上清，加入5-10ml dmem/f12培养基，清洗类器
官；用1ml枪头慢慢吸去上清；总共5组类器官，分别加入50μl、100μl、150μl、200μl、250μl浓缩病毒(该病毒包装有插入rb1 sgrna编码序列的pcrispr-gfp载体；金斯瑞合成；滴度为2e+08tu/ml)及20μl类器官培养基，并加入助染试剂transdux(system biosciences，货号：lv860a-1)；600g，1h离心；分别加入1ml类器官培养基，混匀，450g，5min离心；用1ml枪头慢慢吸去上清，分别用75μl类器官培养基重悬每组类器官，混匀形成类器官与培养基的混合物10，加入与所述混合物10等体积的在冰上融化的基质胶，混匀并加入至37℃预热30min的24孔培养板中，在每孔中心位置加入50μl，37℃放置10min；每孔沿孔壁加入750μl类器官培养基，37℃，5％co2培养，3至10天观察荧光。
[0159]
结果与分析：不同体积慢病毒侵染类器官结果，见表4
[0160]
表4不同体积慢病毒侵染类器官的效率
[0161]
慢病毒病毒体积结果50μl荧光比例约为5％100μl荧光比例约为10％150μl荧光比例约为20％200μl荧光比例约为40％250μl荧光比例约为50％
[0162]
从表中可以看到，小于200μl慢病毒侵染效率均不好，随着慢病毒体积增加，侵染效率也逐渐提高，但加入250μl慢病毒侵染类器官时，侵染一周后，出现类器官逐渐死亡的现象，可能在病毒量增加至200μl以上时，类器官侵染的起始数量也要随之增加，否则就会出现随着培养时间增加，类器官逐渐死亡的现象，因此在类器官侵染时选择加入200μl慢病毒侵染类器官。
[0163]
5.2孵育：增加37℃孵育侵染类器官
[0164]
选择增殖速度稳定的类器官，约7天传代一次，用1ml枪头吸去培养基，每孔加入0.5ml tryple，吹打类器官20次，加入离心管中，37℃消化3-10min，类器官消化成均一大小即可；450g，5min离心；用1ml枪头慢慢地吸去上清，加入5-10ml dmem/f12培养基，清洗类器官；用1ml枪头慢慢吸去上清，向每组类器官中分别加入200μl浓缩病毒(该病毒包装有插入rb1 sgrna的pcrispr-gfp载体；金斯瑞合成；滴度为2e+08tu/ml)及20μl类器官培养基，并加入助染试剂transdux(system biosciences，货号：lv860a-1)。总共四组类器官，-600g，1h离心；四组类器官分别在37℃静置孵育1h，2h，4h，6h；分别加入1ml类器官培养基，混匀，450g，5min离心；用1ml枪头慢慢吸去上清，分别用75μl类器官培养基重悬每组类器官，混匀，加入75ul基质胶，混匀；加入至37℃预热30min的24孔培养板中每孔中心位置加入50μl，37℃放置10min；每孔沿孔壁加入750μl类器官培养基，37℃，5％co2培养，3至10天观察荧光。
[0165]
结果及分析：增加37℃静置孵育步骤后，其结果见表5
[0166]
表5不同孵育时间对类器官侵染影响
[0167][0168]
相较于无静置孵育的结果(如5.1所示)，增加静置孵育步骤后，随着孵育时间增加，200μl慢病毒侵染类器官，荧光比例达50％以上，从结果上看，短时间地静置孵育对类器官侵染效率提升并没有明显影响，而时间过长就会影响类器官的生长状态，因此，在37℃静置孵育4h为最佳时间。在没有增加静置孵育步骤时，只是将慢病毒与类器官通过离心的方式增加侵染效率，这种方法随着慢病毒量的增加，侵染效率也随之增加，当达到250μl慢病毒时，侵染效率也只有50％左右，慢病毒侵染一周后，类器官开始慢慢死亡，说明虽然侵染效率提高了，但对类器官的后期生长产生了影响。当增加了37℃孵育步骤后，200μl慢病毒侵染效率就可达50％以上，同时也不会影响类器官的生长，在解决了侵染效率的情况下，也不会影响侵染类器官的后续实验，可见增加此步骤对类器官侵染效率提高有帮助。
[0169]
5.3类器官转染体积：消化时间优化
[0170]
选择增殖速度稳定的类器官，约7天传代一次。总共四组类器官，用1ml枪头将各孔中的培养基吸去；用1ml枪头每孔加入0.5ml tryple，吹打类器官20次，加入离心管中，于37℃消化。4组类器官的消化时间分别为3min、5min、10min、15min。450g，5min离心；用1ml枪头慢慢地吸去上清，加入5ml dmem/f12培养基，清洗类器官；用1ml枪头慢慢吸去上清，分别加入200μl浓缩病毒(该病毒包装有插入rb1 sgrna的pcrispr-gfp载体；金斯瑞合成；滴度为2e+08tu/ml)及20μl类器官培养基，并加入助染试剂transdux(system biosciences，货号：lv860a-1)。600g，1h离心；在37℃静置孵育4h；加入1ml类器官培养基，混匀，450g，5min离心；用1ml枪头慢慢吸去上清，每组用75μl类器官培养基重悬每组类器官，混匀，加入75μl基质胶，混匀并加入到在37℃预热了30min的24孔培养板中。加入位置在每孔的中心，加入量为50μl。37℃放置10min，每孔沿孔壁加入750μl类器官培养基，37℃，5％co2培养，每2到3天换液一次，7天传代一次，观察荧光。
[0171]
结果与分析：用不同消化时间的类器官进行慢病毒侵染，7天后观察荧光，结果见表6。
[0172]
表6不同消化时间的类器官侵染结果
[0173][0174]
从不同消化时间结果上看，类器官应消化成大小均一的，这样在侵染时才不会出现侵染不均匀的现象，但类器官消化时间太久以后，就会出现侵染后大量死亡的现象，影响类器官的生长，目前文献中提到的消化时间会在3-15min这么一个范围，这需要根据类器官的起始量、加入消化液的量以及起始类器官大小来决定的，因此不能以消化时间来作为唯一衡量的因素，只要观察到类器官大小均一即可，其侵染效率也会较高。
[0175]
5.4离心条件的优化
[0176]
选择增殖速度稳定的类器官，约7天传代一次。弃去培养基，每孔加入0.5ml tryple，将类器官消化液转入离心管中，37℃消化3-10min，常温450g离心5min；用1ml枪头慢慢地吸去上清，加入5ml dmem/f12培养基，清洗类器官；用1ml枪头慢慢吸去上清，分别加入200μl浓缩病毒及20μl类器官培养基，并加入助染试剂transdux(system biosciences，cat：lv860a-1)。将上述类器官分成四组，各组的离心转速跟时间分别为200g，1.5h；450g，1h；600g，1h；800g，1h。离心后，在37℃静置孵育4h；加入1ml类器官培养基，混匀，450g，5min离心；用1ml枪头慢慢吸去上清，分别用75μl培养基重悬后，加入75ul基质胶，混匀，加入24孔板中，每孔50μl，37℃放置10min，每孔沿孔壁加入750μl培养基，37℃，5％co2培养，每2到3天换液一次，7天传代一次，观察荧光。
[0177]
结果与分析：不同离心条件，对类器官侵染效率影响也不一样，结果显示，在200g，1.5h时，类器官与病毒离心后并不能完全离心到管底，且荧光比例《10％；在450g，1h时，荧光比例在20％左右；在800g，1h时，类器官在后期培养过程中，明显生长速度变慢，荧光比例在30％左右；600g离心1h后，不影响类器官生长速度，且荧光比例在50％以上，可以达到更高的编辑效率。
[0178]
5.5不同时间点检测的编辑效率比较
[0179]
选择增殖速度稳定的类器官，约7天传代一次。一共分为两组，用1ml枪头将各孔的培养基吸去；用1ml枪头向各孔加入0.5ml tryple，吹打类器官20次，加入离心管中，37℃消化3-10min，将类器官消化成均一大小即可；450g，5min离心；用1ml枪头慢慢地吸去上清，加入5ml dmem/f12培养基，清洗类器官；用1ml枪头慢慢吸去上清，分别加入200μl浓缩病毒(该病毒包装有插入rb1 sgrna的pcrispr-gfp载体；金斯瑞合成；滴度为2e+08tu/ml)及20μl类器官培养基，并加入助染试剂transdux(system biosciences，货号：lv860a-1)；600g，1h离心；在37℃静置孵育4h；加入1ml类器官培养基，混匀，450g，5min离心；用1ml枪头慢慢吸去上清，分别用75μl类器官培养基重悬每组类器官，混匀，加入75μl基质胶，混匀并加入
至37℃预热30min的24孔培养板中，在每孔中心位置加入50μl。37℃放置10min；每孔沿孔壁加入750μl类器官培养基，37℃，5％co2培养，每2到3天换液一次，7天传代一次，观察3至20天荧光。两组类器官分别在10天、20天检测编辑效率。
[0180]
结果与分析：类器官侵染完后，荧光在侵染后第7天左右才会稳定，因此，选择在第10天检测第一组的编辑效率，之后又培养了10天，检测第二组的编辑效率，结果见表7。
[0181]
表7不同时间检测类器官编辑效率
[0182]
时间编辑效率侵染后10天45％侵染后20天46％
[0183]
从检测结果上看，类器官侵染10天与20天编辑效率基本一致，说明类器官在慢病毒侵染10天已经稳定，可以进行后续筛选等实验，不用继续花费更多的时间等待其编辑效率稳定。
[0184]
5.6慢病毒侵染类器官流程的稳定性测试
[0185]
5.6.1慢病毒对不同样本的类器官的侵染
[0186]
选择增殖速度稳定的类器官两组，分别为具有不同突变的样本1(所用类器官同实施例1-4)和样本2，用慢病毒进行侵染。具体过程如下：
[0187]
类器官约7天传代一次，用1ml枪头将各孔的培养基吸去，每孔加入0.5ml tryple，吹打类器官20次，加入离心管中，37℃消化3-10min，类器官消化成均一大小即可；450g，5min离心；用1ml枪头慢慢地吸去上清，加入5ml dmem/f12培养基，清洗类器官；用1ml枪头慢慢吸去上清，对每组类器官分别加入200μl包装有sgrna的浓缩病毒及20μl类器官培养基，并加入助染试剂transdux(system biosciences，货号：lv860a-1)；600g，1h离心；在37℃静置孵育4h；加入1ml类器官培养基，混匀，450g，5min离心；用1ml枪头慢慢吸去上清，分别用75μl类器官培养基重悬，混匀，加入75ul基质胶，混匀并加入至37℃预热30min的24孔培养板中，每孔中心位置加入50μl，37℃放置10min；每孔沿孔壁加入750μl类器官培养基，37℃，5％co2培养，每2到3天换液一次，7天传代一次，观察3至20天荧光，在第10天检测编辑效率。
[0188]
结果与分析：使用本技术的方法对两种不同样本的类器官编辑效率见表8，类器官的荧光图像见图4、5。通过结果可以看出，本技术的慢病毒基因编辑方法对不同突变型的类器官编辑效率类似。由此说明使用本技术的类器官侵染流程进行基因编辑，其编辑效率较为稳定，不会因为类器官突变型的改变而出现太大的编辑效率差异。
[0189]
表8不同样本编辑效率
[0190]
类器官样本编辑效率样本158％样本249％
[0191]
5.6.2不同sgrna对类器官的侵染
[0192]
选择增殖速度稳定的类器官，约7天传代一次。。用1ml枪头将各孔的培养基吸去，向各孔加入0.5ml tryple，吹打类器官20次，加入离心管中，37℃消化3-10min，将类器官消化成均一大小即可；450g，5min离心；用1ml枪头慢慢地吸去上清，加入5ml dmem/f12培养基，清洗类器官；用1ml枪头慢慢吸去上清，向每组类器官中分别加入200μl包装有同时表达
sgrna和cas9的载体(滴度为2e+08tu/ml)，及20μl类器官培养基。两组类器官中加入的浓缩病毒分别包含sgrna rb1和sgrna dapk1的dna编码序列，同时加入助染试剂transdux(system biosciences，货号：lv860a-1)；600g，1h离心；在37℃静置孵育4h；加入1ml类器官培养基，混匀，450g，5min离心；用1ml枪头慢慢吸去上清，分别用75μl类器官培养基重悬，混匀，加入75ul基质胶，混匀并加入至37℃预热30min的24孔培养板中，在每孔中心位置加入50μl，37℃放置10min；每孔沿孔壁加入750μl类器官培养基，37℃，5％co2培养，每2到3天换液一次，7天传代一次，观察3至20天荧光，分别在10天检测编辑效率。
[0193]
结果及分析：不同的sgrna侵染同种类器官后，编辑效率见表9。
[0194]
表9不同sgrna编辑效率检测
[0195]
sgrna靶向的基因编辑效率rb158％dapk146％
[0196]
由此可见，用不同的sgrna侵染类器官，类器官侵染流程基本稳定，不会随着sgrna改变而出现编辑效率及侵染效率的较大变化。