液滴微流控辅助的双鼠李糖脂高产菌株筛选方法

1.本发明属于微生物和微流控技术领域，具体涉及液滴微流控辅助的双鼠李糖脂高产菌株筛选方法。


背景技术：

2.鼠李糖脂(rhamnolipids，rls)是目前研究最深入、应用最广泛的一种生物表面活性剂，鼠李糖脂可以显著降低界面表面张力，乳化性能优异，可促进烃类、油脂类等疏水底物的降解，已在化工、医药、化妆、石油开采和环境污染治理等行业中获得广泛的应用。合成鼠李糖脂的微生物主要是铜绿假单胞菌，其合成的鼠李糖脂主要包括含一个鼠李糖基的单鼠李糖脂(mono-rls)和含两个鼠李糖基的双鼠李糖脂(di-rls)。其中双鼠李糖脂比单鼠李糖脂具有更好的乳化能力和更低的临界胶束浓度。在污染物降解领域，双鼠李糖脂对污染物溶解效率更高，因而具有更好的市场应用前景。
3.目前高产鼠李糖脂菌株的筛选主要依赖ctab-mb平板筛选法，合成鼠李糖脂的菌株在不透明的ctab-mb平板上可以将mb特异性溶解，形成深蓝色的溶解圈，根据菌株形成的溶解圈的大小即可粗略判断鼠李糖脂的产量。然而该方法的筛选特异性很差，原因在于很多铜绿假单胞生长过程中会产生大量色素，影响深蓝色溶解圈的形成，此外该方法只能对鼠李糖脂产量进行直观的判断，无法精确判定菌株产量，在筛选过程中常常会因为多数菌株形成的溶解圈大小差异不明显导致无法筛选获得高产菌株。此外，ctab-mb平板筛选法只能人工将菌落点在平板上，该筛选方式通量小、效率低无法应用于大规模的筛选。ctab-mb筛选存在的另外一个瓶颈在于，该方案只能对总鼠李糖脂进行粗略定量，无法实验特异性用于筛选双鼠李糖脂高产菌株。
4.微流控超高通量荧光激活液滴分选平台(fluorescence-activated droplet sorting，fads)是近些年来新兴的一种单细胞分选平台，该平台可对单细胞进行封装培养，利特异性荧光底物对菌株的次级代谢产物、一些特异性酶类的产量进行荧光定量，通过筛选平台对荧光强度符合筛选阈值的液滴进行分选收集，最终获得大量备选液滴。该筛选方法的通量高、特异性强，但其使用难点在于特异性荧光底物的合成，因为多数天然产物，如鼠李糖脂，本身不产生荧光因此必须利用特异性小分子探针间接对酶或产物进行定量。然而探针的设计合成成本高、难度大，迫切需要开发一种新的fads筛选技术，用于天然产物合成菌株的筛选。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明提供了一种利用液滴微流控辅助的双鼠李糖脂高产菌株筛选方法。
6.为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
7.液滴微流控辅助的双鼠李糖脂高产菌株筛选方法，包括：
8.分析鼠李糖脂合成的关键基因的转录水平和双鼠李糖脂产量的关系，选择转录水
平和双鼠李糖脂产量正相关的关键基因作为荧光筛选标记，构建含该关键基因的荧光报告质粒；
9.将导入荧光报告质粒的菌细胞封装在微液滴中，以荧光蛋白的信号强度表征该关键基因的转录水平，利用不同鼠李糖脂生产菌株胞内荧光蛋白信号强度的差异进行液滴微流控筛选。
10.作为一种优选的实施方式，通过阿拉伯糖诱导型启动子外源诱导关键基因的表达，比较在不同诱导浓度下鼠李糖脂产量的变化其双鼠李糖脂组分的变化关系，以获取关键基因转录水平和双鼠李糖脂产量的关系。
11.作为一种优选的实施方式，将作为荧光筛选标记的关键基因的启动子连接到不含启动子的荧光蛋白表达质粒上，从而以荧光蛋白的信号强度表征该关键基因的转录的水平。
12.作为一种优选的实施方式，使用绿色荧光蛋白作为转录的指示剂。
13.作为一种优选的实施方式，将荧光报告质粒通过质粒转化的方式转入到鼠李糖脂生产菌株的感受态细胞中，将导入荧光报告质粒的感受态细胞封装在微液滴中用于液滴微流控筛选。
14.作为一种优选的实施方式，设置筛选阈值，收集信号强度超过阈值的液滴用于后续鉴定。
15.作为一种优选的实施方式，对收集的液滴加入破乳剂破碎，释放菌细胞；对菌细胞进行平板培育获得单克隆菌落后，在发酵培养基中对单克隆菌落进行发酵培养，分离提取发酵液中的鼠李糖脂，比较单双鼠李糖脂的含量。
16.作为一种优选的实施方式，以双鼠李糖脂合成关键基因rhlc作为荧光筛选标记。
17.鼠李糖脂合成的关键基因有3个分别为rhla、rhlb、rhlc。rhla的作用是合成羟基烷氧基烷酸(haa)合成酶，rhlb、rhlc分别催化在haa上加成第一个和第二个鼠李糖基，合成单鼠李糖脂和双鼠李糖脂。本发明所用关键基因为rhlc，其可以催化由单鼠李糖脂形成双鼠李糖脂的反应，通过增加rhlc的转录活性即可增加双鼠李糖的产量。
18.本发明首先建立了双鼠李糖脂合成关键基因rhlc的转录与双鼠李糖脂产量的正相关关系。通过阿拉伯糖诱导型启动子外源诱导rhlc的表达，比较在不同诱导浓度下鼠李糖脂产量的变化其双鼠李糖脂组分的变化关系。明确并建立双鼠李糖脂和rhlc基因转录间的正相关关系。
19.进一步的，以pprobe-at为载体，将rhlc基因的启动子连接到载体上，构建重组质粒作为荧光报告质粒。该报告载体是一个不含启动子的gfp蛋白表达质粒，当靶标基因的启动子重组到载体上后，靶标基因的转录水平即可通过gfp蛋白的表达量进行表征。将rhlc基因的启动子通过同源重组的方式构建到pprobre-at载体上，构建荧光表达载体。
20.本发明通过gfp荧光报告系统，首次将基因转录水平与产物产量进行关联，建立了首套转录依赖的fads筛选平台，可应用于多种合成机制清晰的天然产物的筛选。且本发明的筛选方法精度高、通量大、特异性强、可定向筛选高产双鼠李糖脂的菌株，克服了目前ctab-mb平板筛选技术筛选效率低，且无法定向筛选高产双鼠李糖的瓶颈。
附图说明
21.图1是rhlc转录和双鼠李糖脂产量正相关关系的验证。
22.图2是不同菌株中应荧光报告质粒产生的gfp信号差异情况检测。
23.图3是含有荧光报告质粒pat-rhlc的菌株在微球中产生荧光的情况的观察。
24.图4是正负对照菌株在液滴微流控系统中产生荧光信号的差异情况。
25.图5是从石油环境样本中筛选高产双鼠李糖脂菌株的荧光强度分布情况。
26.图6是液滴微流控筛选获得的12株高产菌株的系统发育和鼠李糖脂产量情况。
具体实施方式
27.本发明通过借助液滴微流控筛选平台，通过构建基因转录相依赖的荧光报告质粒，利用fads技术的原理，通过环境样本的收集，利用专用培养基对目标菌株进行初步筛选，对获得的单克隆菌株进行收集并制作成感受态系统，随后利用质粒转化的方式导入到环境来源菌株细胞中。利用液滴封装技术，使用水-油相互剪切形成油包水的微液滴(droplet)，并将菌细胞封装在微液滴中。经过一段时间的培养，菌株质粒在液滴中生长，从而导致报告系统的荧光发生变化。随后使用筛选平台，设置一定的筛选阈值，超过这一阈值的液滴可被收集起来用于后续进一步鉴定。本发明的整理操作流程如图1所示。
28.下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
29.下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
30.本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。
31.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
32.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
33.实施例1
34.本实施例用于说明rhlc基因的转录和菌株双鼠李糖脂产量存在正相关关系
35.基于对鼠李糖脂合成路径的研究，本实施例选择双鼠李糖脂合成关键糖基转移酶rhlc为筛选靶标，该酶可以催化一分子单鼠李糖脂和一分子鼠李糖基结合形成一分子双鼠李糖脂。尽管对rhlc催化鼠李糖脂合成机制的认识已经很清晰，然而rhlc基因的转录是否和双鼠李糖脂存在正相关关系还尚不明确。为了验证筛选靶标的特异性，本实施例通过外源诱导rhlc基因的转录来人工调控其表达量，从而验证其在不同表达量情况下的鼠李糖脂及双鼠李糖脂含量的变化，明确rhlc转录和双鼠李糖脂含量变化间的正相关关系。
36.结果如图2所示，通过外源添加阿拉伯糖诱导rhlc基因的转录，通过对总鼠李糖脂的测定发现，提高rhlc的转录不影响菌株总鼠李糖脂的产量。对提取的总鼠李糖脂进行tlc检测发现，rhlc表达量的提升伴随着单鼠李糖脂产量的减少，但是并未发现双鼠李糖脂产量有所增加。由于tlc检测的灵敏度较低，为了进一步明确双鼠李糖脂产量的变化，本实施例采用lc-ms的手段对鼠李糖脂提取物进行了测定，结果表明，在外源添加0.5％阿拉伯糖诱导的情况下，菌株双鼠李糖脂产量有显著增加。
37.实施例2
38.本实施例用于说明荧光报告质粒pat-rhlc具有非常强的宿主特异性
39.在验证了rhlc基因和双鼠李糖脂产量存在正相关关系的基础上，本实施例选择了pprobe-at为载体，将rhlc基因的启动子连接到载体上，构建重组质粒pat-rhlc。pprobe-at载体不含有启动子序列，从而其无法在宿主中合成gfp蛋白，将rhlc基因的启动子连接到该载体上后，rhlc启动子的活性即可用gfp蛋白的荧光强度来表示。为了验证pat-rhlc报告质粒的宿主特异性，我们将该质粒导入了实验室保存的三株铜绿假单胞菌菌株中，与此同时pao1和dh5α菌株也被分别用来作为正对照和负对照。
40.经过过夜培养后，对菌株的gfp荧光蛋白水平进行了定量。结果如图3所示，在三株实验室保存的铜绿假单胞菌中，gfp信号强度在不同菌株间出现明显差异。此外，在负对照菌株dh5α中，gfp蛋白的荧光信号显著低于正对照菌株和另外三株实验室保存的铜绿假单胞菌菌株。以上结果表明，本实施例构建的荧光报告质粒pat-rhlc具有非常强的宿主特异性，可用于检测不同菌株的rhlc基因转录情况。
41.实施例3
42.本实施例用于说明荧光报告质粒可以在微球中产生gfp荧光信号，因而可以用于液滴微流控筛选。
43.为了检验荧光报告系统在液滴微流控平台中的工作情况，我们将含有报告质粒的pao1正对照菌株pao1/pat-rhlc进行了微液滴的封装和培养。由于微液滴的封装有一点的空包率，即很多液滴在封装过程中无法将菌细胞包裹在液滴内部，从而导致含有荧光的微球只能以较低的比例存在与整个体系中。为了验证这一理论，本实施例对pao1/pat-rhlc菌株封装培养后的液滴进行荧光显微镜的观察，确定液滴中荧光微球的比例及其泄露情况。
44.结果如图4所示，荧光及明场照片显示，荧光报告系统可以微球在体系中产生明显的荧光，荧光微球所占比例约为5％。
45.实施例4
46.本实施例用于检测荧光报告系统在正负对照菌株中的荧光强度差异情况。
47.为了测试荧光报告质粒体系在液滴微流控系统中筛选的可行性，本实施例基于铜绿假单胞菌pao1构建了两类菌株：一是含有荧光报告质粒pat-rhlc的正对照菌株pao1/pat-rhlc；二是含有原始报告质粒但是无法表达gfp信号的菌株pao1/pat。将这两类菌株分别以液滴进行包裹培养后，利用分选平台进行信号收集和分选。
48.结果如图5所示，正对照菌株产生的gfp荧光信号的范围为0.5a.u.到3.5a.u.，其信号主要集中在0.8a.u.附近。然而负对照菌株产生的gfp信号则要显著低于正对照菌株，其范围区间为0.3a.u.到0.6a.u.。这些结果表明荧光报告系统在液滴微流控系统中具有非常强的特异性，可以识别不同液滴的信号强度，因而可以应用于液滴微流控平台筛选。
49.实施例5
50.本实施例用于说明转录依赖的荧光报告系统可以用于从环境样本中筛选高产双鼠李糖脂的菌株。
51.为了从环境样本上筛选高产双鼠李糖脂菌株，本实施例选取石油样本作为筛选的菌株库。通过假单胞菌筛选平板首先对油泥样本中的微生物进行初步筛选，该平板可以特异性筛选获得假单胞菌。对假单胞菌平板上生产出来的单克隆菌落进行富集后，制作成感受态细胞，随后利用质粒热击转化的方式将荧光报告质粒pat-rhlc导入到菌细胞中，经过
短暂(15min)复壮后对菌细胞进行液滴封装和筛选。考虑到铜绿假单胞菌模式菌株pao1的双鼠李糖脂产量已经较为突出，也是常用的鼠李糖脂发酵菌株，而其在液滴微流控系统中的荧光信号强度已经达到了0.8a.u.。因此，本实施例将高产双鼠李糖脂菌株的筛选阈值设定为2.4a.u.，这个信号强度是pao1菌株的3倍。
52.整个筛选过程持续了8个小时，为了展示筛选过程中的信号收集和液滴分选情况，本实施例选取了筛选过程中的6000s的一个时间段进行了展示。结果如图5所示，可以观察到整个6000s的筛选过程中多数液滴的信号强度都低于模式菌株pao1，荧光信号超过筛选阈值2.4a.u.的液滴比例更低，表明本实施例的筛选的灵敏度强，可以从背景信号中精确筛选出目标菌株。
53.实施例5
54.本实施例用于鉴定液滴微流控筛选平台筛选获得的高产双鼠李糖脂备选菌株的性能。
55.经过8小时的液滴微流控筛选，我们对超过设定阈值的荧光液滴进行了收集，随后加入破乳剂对液滴进行破碎，释放菌细胞。对菌细胞在pia平板上进行进一步培养获得单克隆菌落后，对单菌落进行保种。通过16s rdna通用引物对菌株的系统发育地位进行鉴定。并在发酵培养基中对单菌落进行发酵培养，分离提取发酵液中的鼠李糖脂，利用硫酸蒽酮法对总鼠李糖脂含量进行测定，利用lc-ms对单双鼠李糖脂的含量进行比较。
56.结果如图6所示，系统发育树的结果表明液滴微流控平台筛选获得的12株备选菌株多数为铜绿假单胞菌，其中只有jldr1为粘质沙雷氏菌。此外通过对总鼠李糖脂含量的测定发现多数菌株的总鼠李糖脂含量高于pao1菌株，只有jldr2和jldr3两株菌的总鼠李糖脂含量略低于pao1。通过lc-ms对菌株的单双鼠李糖脂比例测定发现，12株备选菌株的双鼠李糖脂比例范围为73％到86％，其中菌株jldr10的双鼠李糖脂含量为86％，远高于pao1菌株的72％。综合考虑鼠李糖脂总产量和双鼠李糖脂比例后，我们认为菌株jldr7是一株性能优异的，具备工业生产双鼠李糖脂的菌株，原因在于该菌株的鼠李糖脂产量高，且双鼠李糖脂的占比达83％。