一种睾丸内MYH11基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用

一种睾丸内myh11基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种睾丸内myh11基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用。


背景技术：

2.平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain， smmhc)由myh11基因编码，位于第16号染色体上，由1972个氨基酸组成。smmhc又称为“sm-mhc”(smooth muscle-myosin heavychain,sm-mhc)或“myh11”(myosin heavy polypeptide 11,myh11)。 myh11是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，vsmcs) 收缩过程中的重要标志物，在肌肉生理学和平滑肌收缩功能中发挥着重要作用，其选择性过表达会使气道平滑肌收缩速度加快从而引起哮喘等呼吸系统疾病。myh11基因突变可引起很多肿瘤相关疾病，如 myh11基因的错义突变和移码突变可导致肠道瘤和腹主动脉瘤形成。
3.精子发生是一个复杂的分化过程，很大程度上依赖于细胞骨架的动态变化以及马达蛋白的作用，细胞骨架系统控制着细胞的形态，由微丝、微管和中间丝组成。肌球蛋白(myosin)是一种atp水解酶，能够将atp上的化学能转换成机械能，产生运动所需要的能量，同时 myosin又参与了顶体发生，囊泡运输，基因转录和核形成等过程。 actin和myosin在精子发生过程中合作促进精子发生，它们互相影响共同控制着细胞迁移的过程。男性的生精管壁含有收缩的平滑肌样的管周细胞，被认为是精子运输的重要细胞。研究表明，大部分精子发生受损的男性其睾丸管周细胞中的myh11缺失会导致睾丸管周细胞的收缩能力降低从而使男性生育能力的下降，因此myh11在男性生殖系统的发育过程中发挥重要作用。myh11由动力蛋白选择性剪切外显子形成的，通过atp水解以及结构域的改变为细胞运动提供能量。任何结构域的破坏都会影响细胞的运动和收缩功能。
4.肌球蛋白作为一种多功能蛋白，一方面通过与微丝、微管及钙结合蛋白的结合参与细胞的迁移运动，另一方面通过atp酶水解和结构改变为细胞活动提供能量。倘若通过基因编辑手段全身性敲除 myh11基因后得到纯合子鼠甚至杂合子鼠的概率会很低，条件性敲除技术可以提升基因编辑鼠子代的存活率。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种睾丸内myh11 基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用。
6.第一方面，本发明提供一种睾丸内myh11基因敲除小鼠模型的构建方法，包括：
7.构建靶向同源重组载体，将所述靶向同源重组载体、grna和cas9 蛋白导入小鼠中；
8.所述靶向同源重组载体中5'-loxp位点插入区域位于2号内含子内， 3'-loxp位点插入区域位于3号内含子内。
9.进一步地，所述5'-loxp位点插入位置可以为myh11基因2号内含子的任一位点，所
述3'-loxp位点插入位置可以为myh11基因3号内含子内的任一位点。
10.进一步地，所述靶向同源重组载体靶向区域包括如seq id no.1 所示的核苷酸序列。靶向区域即为5'-loxp位点和3'-loxp位点之间的区域。
11.进一步地，所述grna包括：
12.grna1:5
’‑
caggggtcctaaccttatatagg-3’，
13.grna2:5
’‑
tgtgtgcgctgaagaggtactgg-3’。
14.进一步地，所述导入小鼠中为：
15.导入小鼠的受精卵内，发育得到flox小鼠，将所述flox小鼠和睾丸组织特异性表达vasa-cre酶的小鼠进行交配得到f1代flox杂合子小鼠。
16.第二方面，本发明提供一种引物组合，包括：
17.上游同源臂扩增引物对：
18.f1:5
’‑
aggagcatcgggtcctcatttat-3’，
19.r1:5
’‑
gtggattcggaccagtctga-3’；和/或，
20.下游同源臂扩增引物对：
21.f2:5
’‑
acgtaaacggccacaagttc-3’，
22.r2:5
’‑
cgtgaaatgggcatagtcaaact-3’；和/或，
23.loxp位点检测引物对：
24.f3:5
’‑
tttcagcggcatctctagtttgt-3’，
25.r3:5
’‑
ttgctcattcacagtcacatagcc-3’。
26.本发明进一步提供包括所属引物组合的试剂盒。
27.本发明进一步提供所述引物组合，或所述试剂盒在构建myh11 基因敲除小鼠模型中的应用；
28.本发明进一步提供所述构建方法，或所述引物组合在构建雄性生殖缺陷小鼠模型和泌尿系统疾病小鼠模型中的应用。
29.本发明具备如下有益效果：
30.本发明公开了一种构建myh11基因睾丸组织条件性敲除小鼠模型的方法及应用，所述方法借助crispr/cas9基因编辑技术，靶向敲除myh11基因的第3号外显子，同时利用cre-loxp重组系统，采用受精卵偏好同源重组修复等途径，提高同源重组效率，实现组织和细胞条件性基因敲除。对于构建得到的myh11基因敲除小鼠，经测序发现在睾丸中其序列在目标位置发生3号外显子缺失突变和非同源重组修复。该模型小鼠杂合子具备雄性睾丸发育缺陷，膀胱组织发育缺陷的表型和特点，可用于研究雄性生殖缺陷疾病、泌尿系统疾病中的机理研究。
附图说明
31.图1为本发明实施例1提供的cko区域4种碱基的比率分布图。
32.图2为本发明实施例1提供的cko区域上游3000bp和下游3000bp 序列于小鼠基因组进行blast比对的相似性分析结果示意图。
33.图3位本发明实施例1提供的敲除靶位构建示意图。
34.图4为本发明实施例1提供的同源重组载体内部同源臂和cko的构建图谱。
35.图5为本发明实施例1提供的同源重组载体内部5'同源臂碱基序列图谱。
36.图6为本发明实施例1提供的3'同源臂碱基序列图谱。
37.图7为本发明实施例1提供的敲除小鼠构建流程图。
38.图8为本发明实施例1提供的引物设计策略示意图。
39.图9为本发明实施例1提供的f1和r1引物的pcr产物电泳图；其中，泳道1，2，8和21是以f2代flox鼠的基因组为模板进行的pcr的结果，泳道m为分子marker，泳道wt为对照组野生型鼠，泳道water为以灭菌水为模板进行的pcr阴性对照组。
40.图10为本发明实施例1提供的f2和r2引物的pcr产物电泳图；其中，泳道1，2，8和21是以f2代flox鼠的基因组为模板进行的pcr产物，泳道m为分子marker，泳道wt为对照组野生型鼠，泳道water为以灭菌水为模板进行的pcr阴性对照组。
41.图11为本发明实施例1提供的pcr测序结果示意图。
42.图12为本发明实施例1提供的敲除小鼠基因型鉴定的引物设计策略示意图。
43.图13为本发明实施例1提供的f5+r5引物pcr电泳图；其中泳道 15为杂合子鼠(flox/+,vasa-cre)的pcr结果。
44.图14为本发明实施例1提供的vasa-mf+vasa-mr引物pcr电泳图；其中泳道15为杂合子鼠(flox/+,vasa-cre)的pcr结果。
45.图15为本发明实施例1提供的southern blot检测的设计策略示意图。
46.图16为本发明实施例1提供的southern blot检测的探针分析结果图。
47.图17为本发明实施例1提供的cko杂合子雄鼠的精子活力分析结果图。
48.图18为本发明实施例1提供的睾丸组织切片的he染色图。
49.图19为本发明实施例1提供的膀胱组织切片的he染色图。
50.图20为本发明实施例1提供的肺组织、胸主动脉和肌肉组织切片的he染色图。
具体实施方式
51.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
52.实施例1
53.1、myh11基因grna靶标序列设计和载体构建
54.myh11基因(ncbi参考序列：nm_001161775；ensembl： ensmusg00000018830)位于小鼠第16号染色体上，存在41个外显子(转录本：ensmust00000090287)，本发明发现其3号外显子位于编码区的5.85％区域，其缺失会导致myh11基因进行移码突变；并且myh11基因3号外显子区域不从属于其它基因，敲除后不会引起其它基因发生序列缺失；所以评估myh11基因3号外显子是敲除效率最高且脱靶概率最低的作用位点，选择为条件性敲除区域(cko区域)，评估数据见图1和图2。图2为cko区域4种碱基的比率分布图。分析同源臂和cko区域的序列以确定gc含量。没有发现显着的高gc含量区域。因此该区域适合进行pcr筛选和测序分析。cko全长为 7157bp。碱基a(24.27％1737)|碱基c(22.15％1585)|碱基t(27.74％ 1985)|碱基g(25.85％1850)。图3为cko区域上下游3000bp序列于小鼠基因组进行blast比对的相似性分析表：3号外显子上游的3000 bp和下游部分3000bp没有发现与基因组其它区域有同源性。敲除靶位构建策略见图3，同源臂和cko的构建图谱见图4。cko区域的缺失应导致的鼠myh11基因功能的丧失。
55.(1)设计3号外显子两端的grna，序列如下(seq id no.2-3)：
56.grna1：5
’‑
caggggtcctaaccttatatagg-3’，
57.grna2：5
’‑
tgtgtgcgctgaagaggtactgg-3’。
58.(2)设计靶向同源重组载体，5'-loxp位点插入区域为2号内含子内，上游同源臂长度为1626bp，同源臂序列见图5。3'-loxp位点插入区域为3号内含子内，下游同源臂序列为725bp，同源臂序列见图6。同源重组载体作用后有效cko区域的大小2253bp。cas9核酸内切酶(货号：#m0386m)采购于neb(北京)有限公司，是一种rna 介导的核酸内切酶，可以催化双链dna的特异位点进行切割。将 grna组合、cas9核酸酶和同源重组载体共注射到受精卵内，以此来实现把两个同方向的lox-p位点插入到myh11基因3号外显子的两端以制备出flox小鼠。
59.2、敲除小鼠建系流程
60.经过原核注射后得到的嵌合体子代f0(founder)，与野生型鼠进行交配，产生f1代杂合子小鼠。f1与vasa-cre鼠杂交后，得到f2代 flox杂合子鼠(flox/+,vasa-cre)。敲除小鼠建系总流程见图7。flox 小鼠需要首先验证同源臂序列的准确性，还有loxp位点是否已插入3 号外显子两端。所有引物设计策略见图8。设计引物f1和r1，pcr区域为上游同源臂，5'-loxp位点，3号外显子和3'-loxp位点。r1引物序列里包括了3'-loxp的序列。引物信息如下(seq id no4-5)：
61.f1:5
’‑
aggagcatcgggtcctcatttat-3’，
62.r1:5
’‑
gtggattcggaccagtctga-3’。
63.pcr产物大小约为4kd，tm＝60℃。pcr产物电泳结果图见图9；其中，泳道1，4，8和21分别是以f4代flox鼠的基因组为模板进行的pcr的结果，泳道m为分子marker，泳道wt为对照组野生型鼠，泳道water为以灭菌水为模板进行的pcr阴性对照组。
64.设计引物f2和r2，pcr区域为5'-loxp位点，3号外显子和3'-loxp 位点和下游同源臂。f2引物序列里包括了5'-loxp的序列。引物信息如下(seq id no6-7)：
65.f2:5
’‑
acgtaaacggccacaagttc-3’，
66.r2:5
’‑
cgtgaaatgggcatagtcaaact-3’。
67.pcr产物大小约为3.4kd，tm＝60℃。pcr产物电泳结果图见图 10；其中，泳道1，2，8和21是以f4代flox鼠的基因组为模板进行的 pcr产物，泳道m为分子marker，泳道wt为对照组野生型鼠，泳道 water为以灭菌水为模板进行的pcr阴性对照组。
68.设计引物f3和r3，pcr区域用来做测序鉴定，检测loxp位点及 cko区域的序列准确性。引物信息如下(seq id no8-9)：
69.f3:5
’‑
tttcagcggcatctctagtttgt-3’70.r3:5
’‑
ttgctcattcacagtcacatagcc-3’71.以子代f2 flox鼠序列1的基因组为模板，pcr产物通过pmd19-t 载体(购于宝日医生物技术(北京)有限公司，货号：6013)连接后，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果见图11。结果显示loxp位点已成功插入，cko序列没有因为基因编辑过程而发生突变。
72.flox小鼠与睾丸特异性vasa-cre工具鼠(购于赛业生物科技有限公司，品系名称：c57bl/6j-ddx4
em1cyagen
。基因名：ddx4。ncbi号： 13206)进行杂交。该flox小鼠与表达cre重
组酶小鼠杂交之前，myh11 基因表达正常；当flox小鼠与vasa-cre鼠进行杂交后，可实现在睾丸组织内敲除myh11基因，而在其它组织内该基因正常表达。
73.3、敲除小鼠基因型鉴定
74.对f3代及以后繁殖的小鼠根据图示位置设计引物进行cko区域的鉴定，设计两对引物，第一对引物对应的pcr产物用来鉴定小鼠是否为纯合子或者杂合子，第二对引物对应的pcr产物用来鉴定小鼠是否转入vasa-cre基因。引物设计策略见图12。
75.第一对pcr引物序列(annealing temperature 60.0℃)(seq id no10-11):
76.f5:5
’‑
tagaaagttcccatgacttttccca-3’，
77.r5:5
’‑
gtcccttcagaaagaactaacgtg-3’。
78.纯合子鼠的pcr产物为200bp，杂合子鼠的pcr产物为200bp和 138bp，野生型小鼠的pcr产物为138bp。本实例以cko杂合子鼠(flox/+,vasa-cre)基因组为模板进行pcr，电泳图见图13；其中， 15泳道为cko杂合子鼠的pcr电泳结果，泳道m为分子marker，泳道 wt为对照组野生型鼠，泳道water为以灭菌水为模板进行的pcr阴性对照组。
79.设计第二对pcr引物序列(annealing temperature 60.0℃) (seq id no12-13):
80.vasa-mf:5
’‑
cacgtgcagccgtttaagccgcgt-3’81.vasa-mr:5
’‑
ttcccattctaaacaacaccctgaa-3
82.cre纯合子鼠和cre杂合子鼠的pcr产物为240bp，野生型鼠的 pcr产物为0。本实例以杂合子cko杂合子鼠(flox/+,vasa-cre)基因组为模板进行pcr，电泳图见图14；其中，15泳道为cko杂合子鼠的pcr电泳结果，泳道m为分子marker，泳道wt为对照组野生型鼠，泳道water为以灭菌水为模板进行的pcr阴性对照组。
83.取f4代得到的4只cko杂合子鼠(flox/+,vasa-cre)，取尾尖组织提取dna，进行southern blot实验，用来检测同源重组载体是否整合到myh11基因3号外显子处，还可以验证cas9打靶系统是否存在脱靶现象。设计5’探针和3’探针，引物序列如下(seq id no14-17)：
[0084]5’
probe forward primer:5
’‑
aaagaggagatggaaatgggtc tgg-3’，
[0085]5’
probe reverse primer:5
’‑
tgagccctgaccttgctaccttct
ꢀ‑3’
。
[0086]3’
probe forward primer:5
’‑
acacaccctgcctgctgttgtag ttt-3’，
[0087]3’
probe reverse primer:5
’‑
ggccaagacccagttgtgtctctctt
‑ꢀ3’
。
[0088]
选择dna内切酶avrll和aflii对f1代同源重组后的基因组 myh11基因的cko区域进行限制性内切，整体检测策略见图15；其中，5’probe-avrii探针可以捕获到7.64kb的wt片段和4.17kb 的mt片段；3’probe-aflii探针可以捕获到4.77kb的wt片段和3.38 kb的mt片段。southern blot的检测，经过5’探针和3’探针的捕获后，分析曝光结果见图16。结果说明f1代得到4只cko鼠杂合子 loxp位点整合成功，且cas9打靶系统的脱靶效率为0。
[0089]
4、敲除小鼠雄性生殖系统发育分析
[0090]
f4代经过基因型鉴定得到的cko杂合子雄鼠，对其进行麻醉，取附睾内的常熟精子进行精子活力分析，与野生型鼠的对比分析结果见图17；其中，cko杂合子鼠精子活率以及精子活力相比野生型鼠略有降低，但差异无统计学意义，而精子直线速率、曲线速率明显下降，差异具有统计学意义；cko杂合子鼠的精子畸形率、侧摆幅值、摆动性、鞭打频率、线性度、移动角度以及前进性相比于野生型没有差异。
[0091]
对cko杂合子雄鼠和野生型鼠的睾丸组织进行he染色，结果见图18。其中，野生型小鼠(myh11+/+)睾丸组织结构正常，生精上皮机构和基底膜完整曲细精管排列紧密，形态清晰，边界完整，各级升级细胞层次分明，间质细胞排列均匀。cko杂合子小鼠(myh11+/-) 睾丸组织的曲细精管边界不完整(图中箭头)，生精上皮与基底膜分离(图中三角)，曲细精管官腔狭窄，原始生精细胞数量增加。
[0092]
对cko杂合子雄鼠和野生型鼠的膀胱组织进行he染色，结果见图19。其中，野生型鼠(myh11+/+)膀胱结构规则，黏膜皱襞完整，平滑肌排列整齐。cko杂合子鼠(myh11+/-)的膀胱组织容明显体积增大，膀胱壁明显变薄，粘膜屏障变薄，部分脱落，平滑肌层数增加，排列不规则，平滑肌间隙增大(图中箭头)。
[0093]
对cko杂合子鼠和野生型鼠的肺组织、胸主动脉、肌肉组织和肌肉组织进行he染色，结果见图20。其中，肺组织的he染色结果观察，野生型鼠肺组织气道官腔平滑，结构清晰，气泡间隔未见增生； cko杂合子鼠肺组织气道官腔完整，肺泡大小及肺泡间隔与野生型相比未见显著变化。胸主动脉的he染色结果观察，野生型鼠胸主动脉内、中、外三层管壁结构完整，管壁厚度均匀，血管平滑肌细胞清晰可见，且排列整齐；cko杂合子鼠胸主动脉与管壁完整，平滑肌排列整齐，野生型小鼠对比无显著差异。肌肉组织的he染色结果观察，野生型鼠与cko杂合子鼠肌束结构均致密光滑，肌束排列规则，二者之间未见显著差异。
[0094]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。