一种标记橡胶树白粉菌的荧光载体及其表达方法和应用

1.本发明属于转基因白粉菌细胞技术领域，涉及一种标记橡胶树白粉菌的荧光载体。


背景技术：

2.白粉菌为植物白粉病的病原真菌，在重要粮食作物和经济作物上可引起严重的产量损失。通过转基因技术进行白粉菌致病基因的功能研究对病害防控具有重要意义。因为白粉菌为专性活体寄生，无法离开植物活体组织培养，所以难以对其进行转基因操作。这和兼性寄生真菌是不同的，兼性寄生真菌可在人工培养基上培养，更有利于遗传操作。
3.白粉菌的转基因技术有电击转化法和农杆菌介导的转化法。基因转化操作过程中需要保证白粉菌细胞能寄生于植物活体组织，用于转化的质粒携带合适的抗性基因，并在植物表面施加抑菌剂进行抗性胁迫筛选。比如，应用携带抗性基因tub2的质粒转化瓜类白粉菌，并用药剂多菌灵mbc进行转化子筛选。被转化的细胞则具有多菌灵抗性，在植物叶片上生长。
4.目前对白粉菌的转基因技术仍具有一些缺点和限制，比如载体表达不稳定、被转化基因无法稳定遗传、外源基因无法表达等。再者，仅通过抑菌剂进行转化子筛选仍然无法很好地保证转化成功率。


技术实现要素：

5.为了解决上述背景技术中提到的问题，本发明以橡胶树白粉菌为研究材料，提供了一种标记橡胶树白粉菌的荧光载体，有助于在进行白粉菌基因转化的过程中更严格地控制转化质量，实现准确地计算转化效率，从而更好地保证对后续转基因白粉菌细胞的研究和利用。
6.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
7.一种标记橡胶树白粉菌的荧光载体，所述荧光载体为基于pjnarg质粒改造的质粒pjnarg-rp60-gfp，该质粒pjnarg-rp60-gfp在xcmi酶切位点处被插入了一个多菌灵抗性基因，质粒pjnarg-rp60-gfp的多克隆位点在启动子rp60和gfp绿色荧光蛋白编码基因之间。
8.本发明中，所述多菌灵抗性基因来自于瓜类白粉菌的tub2多菌灵抗性基因。
9.本发明中，所述多菌灵抗性基因的启动子为橡胶树白粉菌的核糖体蛋白编码基因启动子rp60。
10.本发明中，所述荧光载体的表达方法包括以下步骤：
11.步骤一：将质粒pjnarg-rp60-gfp和白粉菌分生孢子混合，利用电击转化法将此混合质粒转化至白粉菌细胞；
12.步骤二：将转化后的白粉菌细胞侵染幼嫩橡胶叶片进行培养；
13.步骤三：筛选白粉菌细胞并进行荧光检测，其中：
14.所述筛选方式为：对接种后的橡胶叶片喷施多菌灵药剂，多菌灵药剂的浓度为0.4
μg/ml，通过药剂筛选的方法获得成功转化的白粉菌细胞；
15.所述荧光检测为：当电击转化成功时，质粒pjnarg-rp60-gfp会被导入白粉菌细胞，pjnarg-rp60-gfp质粒中的启动子rp60则会启动gfp绿色荧光蛋白基因表达，在荧光显微镜gfp通道下，可观察到被成功转化的白粉菌细胞被激发出绿色荧光。
16.相比于现有技术，本发明具有如下优点：
17.1、本发明提供了用于评价白粉菌转化效率的有力工具，即用电击转化法转化含有荧光基因的质粒，使其在白粉菌细胞中表达荧光基因，并通过荧光标记所转化的白粉菌细胞计算白粉菌转化效率，从而有利于研究其他同时导入白粉菌细胞的外源或自身基因的作用；
18.2、本发明使用的载体中，多菌灵抗性基因的启动子是由橡胶树白粉菌的rp60启动子替换质粒pjnarg-rp60-gfp中的rp27启动子所得，其在橡胶树白粉菌中具有较高的启动子活性，更加有利于启动质粒中gfp绿色荧光蛋白基因的表达。
附图说明
19.图1为本发明橡胶树白粉菌菌丝的gfp信号检测示意图。
20.图2为本发明橡胶树白粉菌分生孢子的gfp信号检测示意图。
21.图3为本发明橡胶树白粉菌qrt-pcr检测转化效率示意图。
22.图4为质粒pjnarg-rp60-gfp的结构示意图。
具体实施方式
23.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
24.本发明提供了一种标记橡胶树白粉菌的荧光载体，该荧光载体有利于在橡胶树白粉菌转化的过程中控制转化质量，计算白粉菌细胞转化效率。所述荧光载体为基于pjnarg质粒改造的适用于荧光标记橡胶树白粉菌的质粒pjnarg-rp60-gfp。该质粒pjnarg-rp60-gfp在xcmi酶切位点处被插入了一个多菌灵抗性基因，即来自于瓜类白粉菌的tub2多菌灵抗性基因。多菌灵抗性基因的启动子选用橡胶树白粉菌的核糖体蛋白编码基因启动子rp60。在真菌中，核糖体蛋白编码基因的启动子具有较好的组成性激活的活性。多克隆位点位于该质粒pjnarg-rp60-gfp的真菌组成型启动子rp27和gfp绿色荧光蛋白编码基因之间。但目前rp27启动子在橡胶树白粉菌中的启动子活性较差，因此本发明将质粒pjnarg-rp60-gfp中的rp27启动子替换为橡胶树白粉菌的rp60启动子，拟启动质粒中gfp绿色荧光蛋白基因的表达。
25.荧光载体的表达方法包括以下步骤：
26.步骤一、在白粉菌转化中，将10μg质粒pjnarg-rp60-gfp和白粉菌分生孢子混合，利用电击转化法将此混合质粒转化至白粉菌细胞；具体电击转化过程为：收集生长7d左右的白粉菌孢子，加入电击缓冲液(含0.5wt％吐温20)，重悬浮，分装孢子液与质粒混合(总体积不超过200μl)，冰上放置15min；电击转化1.7kv/ms，间隔5s，电击3次，冰上放置5min。5000rpm离心5min，吸出缓冲液，加ddh2o重悬。
27.步骤二：将转化后的白粉菌细胞侵染幼嫩橡胶叶片(如古铜期橡胶叶片)进行培养,可在25℃和湿度较高的环境下进行培养。
28.步骤三：筛选白粉菌细胞并进行荧光检测：
29.1、筛选：
30.接种后的橡胶叶片喷施多菌灵药剂，多菌灵药剂浓度为0.4μg/ml，通过药剂筛选的方法获得成功转化的白粉菌细胞。
31.2、荧光检测：
32.当电击转化成功时，质粒pjnarg-rp60-gfp会被导入白粉菌细胞，pjnarg-rp60-gfp质粒中的启动子rp60则会启动gfp绿色荧光蛋白基因表达，在荧光显微镜gfp通道下，可观察到被成功转化的白粉菌细胞被激发出绿色荧光。
33.为确保荧光载体表达实验的准确性，以上荧光载体的表达方法设置三次生物学重复，每次生物学重复包含三次技术重复，并且在整个实验过程中，使用未转化的白粉菌细胞作为实验对照，以排除白粉菌细胞自发荧光的干扰：如图1和图2所示，左侧均为未转化的白粉菌细胞，无法发出荧光；右侧均为转化的白粉菌细胞，可以发出荧光。
34.通过荧光显微观察，根据绿色荧光对转化后的白粉菌细胞进行转化效率评价，其中：
35.转化效率(％)＝发射绿色荧光的白粉菌细胞数/所有被观察的白粉菌细胞数
×
100％。
36.转化效率结果如表1所示：
37.表1橡胶树白粉菌转化效率统计
[0038][0039]
同时，提取转化后的及未转化的白粉菌基因组总rna，反转录成cdna并进行quantitative real time-pcr检测，定量计算白粉菌的转化效率，具体结果如图3所示。
[0040]
由此可知，用电击转化法转化含有荧光基因的质粒pjnarg-rp60-gfp，使其在白粉菌细胞中表达荧光基因，并通过荧光标记所转化的白粉菌细胞，能够计算白粉菌转化效率，从而有利于研究其他同时导入白粉菌细胞的外源或自身基因的作用。
[0041]
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。