GmRALF1蛋白在促进植物对磷元素吸收中的应用

gmralf1蛋白在促进植物对磷元素吸收中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程及基因工程技术领域，更具体地，涉及gmralf1蛋白在促进植物对磷元素吸收中的应用。


背景技术：

2.磷是植物生长发育必需的营养元素之一，也是限制全球农作物产量的主要因素之一。通常土壤中植物可吸收的可溶性磷(pi)的浓度低于10μm，而土壤中其他植物不可直接利用的有机磷、不溶性磷含量却相对较高。
3.植物在适应低磷环境的过程中，进化出了一些适应低磷胁迫的功能。其中一种受低磷环境上调的快速碱化因子蛋白(ralf)在植物应对低磷胁迫，改善植物磷养分吸收方面具有重要意义。植物快速碱化因子(ralf)蛋白最早在烟草中被发现，在拟南芥和番茄中过表达ralf时，会导致培养基碱化及植物的根系发育受阻。目前研究表明，ralf蛋白在调节植物根系生长和花粉管发育方面起一定作用，但其具体作用机制尚不明确。植物界中ralf家族蛋白高度保守，ralf蛋白是小分子，平均长度为80-90个氨基酸。虽然ralf基因在植物中的功能还不完全清楚，但ralf蛋白包含关键的调节功能元件，如yisy基序，它是ralf与其可能的受体结合所必需的。近期研究表明，拟南芥atralf1可以通过调节植物根细胞尺寸来调节植物根系长度；也有人证明，ralf通过激活feronia受体，导致ser899处的细胞膜h-atp2磷酸化，从而抑制拟南芥根细胞的伸长。总之，ralf蛋白在调节植物生长方面具有重要作用。目前关于枯草芽孢杆菌表达拟南芥快速碱化因子atralf23具有改善植物磷营养方面作用的研究已有结果，但是其他植物编码的快速碱化因子基因，尤其是农作物编码快速碱化因子基因方面还没有相关研究结果。关于大豆快速碱化基因gmralf1的研究是空白，特别是关于gmralf1在低磷胁迫方面的功能还未有研究报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供大豆快速碱化因子gmralf1蛋白或其编码基因gmralf1在促进植物对磷元素吸收中的应用。
5.本发明的第二个目的在于提供大豆快速碱化因子gmralf1蛋白或其编码基因gmralf1在制备促进植物对磷元素吸收的制剂或基因工程菌中的应用。
6.本发明的第三个目的在于提供一种表达大豆快速碱化因子gmralf1蛋白的基因工程菌，
7.本发明的第三个目的在于提供一种微生物肥料。
8.本发明的第四个目的在于提供所述基因工程菌或所述微生物肥料的应用。
9.本发明的第五个目的在于提供一种提高植物对磷养分吸收的方法。
10.本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
11.本发明首先利用定量pcr检测了低磷条件下大豆快速碱化因子ralf家族的基因表达情况，明确了大豆快速碱化因子gmralf1(glyma.18g002500)显著受低磷上调表达。再以
大豆快速碱化因子gmralf1基因作为目的基因，以插入35s启动子的pbes质粒作为表达载体，以枯草芽孢杆菌为表达宿主，构建了一种可高效表达大豆快速碱化因子gmralf1蛋白的基因工程菌；然后把该菌接种到已在低磷土壤基质中生长7天的大豆和拟南芥根系上，发现该菌有效改善了大豆和拟南芥的缺磷症状，并提高了大豆和拟南芥干物质和磷营养的积累。同时证明了表达快速碱化因子gmralf1的枯草芽孢杆菌相较于表达atralf23枯草芽孢杆菌在改善植物生长发育、提高植物磷养分吸收方面的效果更快、更强，表明大豆快速碱化因子gmralf1蛋白相比现有的拟南芥快速碱化因子ralf23蛋白能够更好的改善植物生长发育，提高植物磷吸收。
12.因此，本发明首先提供关于大豆快速碱化因子gmralf1蛋白或其编码基因gmralf1的以下应用：
13.大豆快速碱化因子gmralf1蛋白或其编码基因gmralf1在促进植物对磷元素吸收中的应用。
14.大豆快速碱化因子gmralf1蛋白或其编码基因gmralf1在制备促进植物对磷元素吸收的制剂或基因工程菌中的应用。
15.本发明还提供一种快速表达大豆快速碱化因子gmralf1蛋白的基因工程菌，是以大豆快速碱化因子gmralf1蛋白的编码基因为目的基因构建基因表达载体，再转化宿主菌后构建得到。
16.优选地，所述大豆快速碱化因子gmralf1蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示，为大豆快速碱化因子gmralf1蛋白有效序列。
17.进一优选地，所述大豆快速碱化因子gmralf1蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述宿主菌为枯草芽胞杆菌；所述序列是以gmralf1密码子为基础进行优化，更易于其在枯草芽胞杆菌中进行表达。
18.优选地，所述表达载体为pbes质粒。
19.进一步优选地，所述表达载体为插入35s启动子的pbes质粒，核苷酸序列如seq id no.6所示。
20.进一步优选地，所述重组表达质粒的核苷酸序列如seq id no.7所示。
21.优选地，所述宿主菌为枯草芽孢杆菌rik1285菌株。
22.本发明还提供上述任一所述快速表达大豆快速碱化因子gmralf1蛋白的基因工程菌在制备微生物肥料中的应用。
23.本发明还提供一种微生物肥料，含有上述任一所述基因工程菌，所述微生物肥料接种在土壤基质中，可以有效缓解植物的缺磷症状，增加植物干物质和磷营养的积累量。
24.通过在缺磷土壤中接种上述快速表达大豆快速碱化因子gmralf1蛋白的基因工程菌或微生物肥料，可以有效改善植物的缺磷症状，促进植物的根系生长，进一步提高植物对磷养分的吸收和对干物质的积累来改善植物生长发育状况，进而提高植物对磷元素的吸收利用，对提高一些缺磷土壤的生产力具有积极意义。
25.因此，本发明还提供任一所述快速表达大豆快速碱化因子gmralf1蛋白的基因工程菌或微生物肥料在提高植物对磷养分吸收或在制备有机肥、土壤改良剂方面的应用。
26.本发明还提供一种提高植物对磷养分吸收的方法，是将上述任一所述快速表达大豆快速碱化因子gmralf1蛋白的基因工程菌先在培养液中进行培养，得到种子液，再将种子
液接种至植物生长的根际土壤中或将上述微生物肥料直接施用在植物生长的根际土壤中。
27.优选地，所述植物为大豆或拟南芥。
28.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
29.本发明提供了大豆快速碱化因子gmralf1蛋白或其编码基因gmralf1在促进植物对磷元素吸收中的应用；本发明通过将大豆快速碱化因子gmralf1基因作为目的基因构建基因工程表达菌，在缺磷土壤中接种该菌，可以有效改善植物的缺磷症状，促进植物的根系生长，进一步提高植物对磷养分的吸收和对干物质的积累；相比于之前发明的表达拟南芥快速碱化因子ralf23蛋白，大豆快速碱化因子gmralf1蛋白能更好的改善植物生长发育，提高植物磷吸收。
附图说明
30.图1为低磷条件下大豆(yc03-3)快速碱化因子gmralf1基因的定量pcr结果，hp表示正常磷营养，500μm kh2po4；lp表示低磷营养，25μm kh2po4；root表示从大豆的根提取的rna，leaf表示从大豆的叶提取的rna；数据是3个生物学重复的平均值和标准误，星号代表2个磷水平间差异(student’s t-test)，*表示差异显著(p《0.05)，**表示差异极显著(p《0.01)，下同。
31.图2为重组质粒pbes/gmralf1的构建流程。
32.图3为pbes/gmralf1双酶切验证图谱，用eco52i和xbai双酶切电泳验证。
33.图4为重组菌b.subtilis/pbes/gmralf1表达的蛋白质杂交(western blot)鉴定结果。
34.图5为重组菌b.subtilis/pbes/gmralf1接种高磷和低磷(hp&lp)土壤基质生长30天拟南芥(哥伦比亚野生型)生长状态。pbes表示土壤基质中接种pbes空载的重组枯草芽孢杆菌；pbes/gmralf1表示土壤基质接种了表达gmralf1蛋白的枯草芽孢杆菌，下同(图中标尺为2cm)。
35.图6为重组菌b.subtilis/pbes/gmralf1，b.subtilis/pbes/atralf23和空载菌b.subtilis/pbes接种高磷和低磷(hp&lp)土壤基质生长30天大豆(yc03-3)生长状态(图中标尺为10cm)。
36.图7为重组菌b.subtilis/pbes/gmralf1，b.subtilis/pbes/atralf23和空载菌b.subtilis/pbes接种高磷(hp)和低磷(lp)土壤基质不同天数大豆(yc03-3)的株高变化，图中不同字母表示不同处理间差异达显著水平(p《0.05)。
37.图8为重组菌b.subtilis/pbes/gmralf1，b.subtilis/pbes/atralf23和空载菌b.subtilis/pbes接种高磷(hp)和低磷(lp)土壤基质生长30天大豆(yc03-3)鲜干物质积累量。图中数据是4个生物学重复的平均值和标准误(student’s t-test)，图中不同字母表示不同处理间差异达显著水平(p《0.05)。
38.图9为重组菌b.subtilis/pbes/gmralf1接种高磷和低磷(hp&lp)土壤基质生长30天大豆(yc03-3)可溶性磷总量。图中数据是4个生物学重复的平均值和标准误(student’s t-test)，图中不同字母表示不同处理间差异达显著水平(p《0.05)。
具体实施方式
39.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
40.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
41.快速碱化因子ralf基因是由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并构建的重组质粒载体pbes/gmralf1。湖南大学于峰教授馈赠b.subtilis/pbes/atralf23菌株。各实施例中所用trelief 5α菌株，由华南农业大学根系研究中心保存。
42.下述实施例中所涉及的试剂为：购自上海翌圣生物科技蛋白质分子量标记(marker)、his标签(tag)、兔抗his标签多克隆抗体、碱性磷酸酶标记山羊抗兔抗体igg(h+l)和dna分子量标记(marker)；购自天根生化科技(北京)有限公司的dna凝胶回收试剂盒和pcr产物回收试剂盒。
43.下述实施例中所涉及的培养基及缓冲液为：
44.lb培养基(g/l)：酵母粉5克，蛋白胨10克，氯化钠5克，加入2％的琼脂即为lb固体培养基。
45.抗生素溶液：先将抗生素配置成浓度为100mg/ml的母液，然后用0.22μm的滤膜过滤除菌，用1.5ml离心管分装，置于﹣20℃保存。
46.磷酸钾缓冲液(pb，50mmol/l，ph为7.0)：取86ml的0.1mol/l的k2hpo4，加入14ml的0.1mol/l的kh2po4，再加入100ml的水，调节ph至7.0。
47.下述实施例中所涉及的培养方法为：
48.种子液的制备：从卡纳抗性的固体培养基上，挑取重组菌(b.subtilis rik1285.)单菌落，接种到lb液体培养基，37℃，200rpm摇床培养8h。
49.摇瓶发酵培养：以体积分数4％转接种子液于发酵培养基中，30℃，220rpm，培养48h。
50.western-blot分析：采用10％的浓缩胶与15％的分离胶，转尼龙膜后孵育抗体，观测结果，并拍照。
51.实施例1 gmralf1在不同磷水平的表达模式
52.1、方法
53.(1)大豆材料的种植和缺磷处理
54.a.种子消毒
55.将成熟、饱满的大豆种子单层排列在培养皿中，放入干燥器中，并将培养皿打开，盖子紧挨着培养皿。将100ml的次氯酸钠加至干燥器中的250ml烧杯中，然后沿着杯壁缓缓加入4.2ml浓盐酸，立即密闭干燥器，静置10小时。从干燥器中拿出后去除过多的氯气。
56.b.催芽
57.将消毒后的种子点入湿润的石英砂中催芽萌发。
58.c.移苗
59.一周后两叶一心状态时选择长势正常、一致的幼苗移栽至水培系统，于温室中用1/2大豆营养液培养。
60.d.处理
61.一周左右待第一片三出复叶完全展开后进行处理：低磷(lp：25μm)、高磷(hp：500μm)，每个处理5个生物学重复。每周换一次营养液，每3天调一次ph。
62.e.采样
63.对处理后14天的根、叶采样，液氮冷冻，-80℃保存。
64.(2)总rna的提取
65.参照trizo1一步法分离总rna。取0.2g样品放入预冷的研钵中磨成粉末状，转至1.5ml离心管，加入1ml trizo1提取液，剧烈震荡混匀，室温静置5分钟；加入0.2ml氯仿，剧烈晃动，室温静置2～5分钟，4℃下12000rpm离心15分钟；取上清液转入新管，加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟，4℃下12000rpm离心5分钟，倒掉乙醇，风干沉淀，加入depc水溶液；最后测量od值，来确定rna的纯度和浓度。
66.(3)实时荧光定量pcr引物设计
67.从phytozome网站下载大豆(glycine max wm82)快速碱化因子gmralf1基因(glyma.18g002500)家族的基因序列(seq id no.1)、转录本序列(seq id no.1)和cds序列(seq id no.2)并设计其特异的定量扩增引物，见表1。
68.表1定量pcr引物
[0069][0070]
(4)实时荧光定量pcr样品的制备及分析
[0071]
用dnasei处理总rna以移除基因组dna的污染，按逆转录酶说明书将rna反转成第一条链。将所得第一链稀释100倍后作为定量pcr反应模板。将适量cdna原液按梯度稀释后作为标准曲线的模板。反应体系及反应条件分别见表2和表3
[0072]
表2定量pcr反应体系(总体积20μl)：
[0073][0074]
表3定量pcr反应条件
[0075][0076]
用rotor-gene的real-time analysis software 6.0计算每个样品的表达量。
[0077]
低磷条件下大豆，快速碱化因子gmralf1基因的定量pcr结果如图1所示，结果表明大豆叶部和根部的快速碱化因子gmralf1(glyma.18g002500)显著受低磷上调表达。
[0078]
实施例2：重组质粒的构建
[0079]
在phytozome网站下载(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/#)大豆(glycine max wm82)gmralf1蛋白序列，其氨基酸序列如seq id no.3所示；保留gmralf1蛋白有效序列seq id no.4，将蛋白序列翻译成枯草芽孢杆菌可识别的脱氧核糖核苷酸序列seq id no.5并构建重组质粒pbes/gmralf1(构建过程如图2，pbes质粒序列如seq id no.6所示，重组质粒pbes/gmralf1的序列如seq id no.7所示)。将得到的重组质粒分别转化trelief 5α，经过氨苄抗性平板筛选，从阳性转化子中提取质粒，分别利用eco52i和xbai双酶切电泳验证(验证结果如图3)，凝胶电泳条带与目的基因大小一致，将验证正确的基因测序，与目的序列比对，结果表明构建成功。
[0080]
实施例3重组菌的构建
[0081]
将实施例2得到的重组质粒pbes/gmralf1转入b.subtilis感受态rik1285，从含有卡纳抗性的平板上挑选阳性克隆，获得重组菌株rik1285/pbes/gmralf1。将获得的重组菌，摇瓶发酵(温度：28℃，转速：150-180rpm)培养24h，得到发酵液，离心得上清，上清即蛋白液。取30μl由rik1285/pbes/gmralf1所得的蛋白液，加入10μl 4
×
的上样缓冲液，煮沸10min，进行western-blot检测，结果见图4，比对结果显示与目的条带匹配度最高的gmralf1蛋白序列，分子量10.5kda，进一步表明gmralf1蛋白序列中表达成功。
[0082]
实施例4植物根系土壤接种重组菌(rik1285rik1285/pbes/gmralf1)实验
[0083]
将成功表达gmralf1蛋白的枯草芽孢杆菌rik1285/pbes/gmralf1以1:500的比例接种在含卡纳抗性的lb培养液中，在28℃的摇床中培养16小时，转速为150-180rpm。离心收集菌体并用清水以1:1000稀释为菌液。在低磷土壤生长7天的大豆和拟南芥的根部接种10ml和1ml稀释菌液。相同的方式接种表达atralf23蛋白的枯草芽孢杆菌(rik1285/pbes/atralf23)和空载的枯草芽孢杆菌(rik1285/pbes)以及接种二级水为对照。
[0084]
结果表明：在缺磷的土壤基质中，在植物根系土壤接种枯草芽孢杆菌(rik1285/pbes/gmralf1)可以有效改善大豆和拟南芥的生长发育状况，显著增加鲜重、干物质以及磷积累(结果如图5～图8)同时证明了表达快速碱化因子gmralf1的枯草芽孢杆菌相较于atralf23在改善植物生长发育，提高植物磷养分吸收方面的效果更好(图9)。另外在高磷条件接种枯草芽孢杆菌(rik1285/pbes/gmralf1)对改善大豆生长发育，提高干物质和磷营养吸收也有着较好的效果。