一种提升作物对抗缺铁胁迫能力的微生物制剂及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物菌剂领域，具体涉及一种提升作物对抗缺铁胁迫能力的微生物制剂及其应用。


背景技术：

2.近年来，中国学者普遍对芽孢杆菌进行作物实验进行研究。芽孢杆菌的微生物的研究较多，如含枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等。同时，芽孢杆菌菌肥只在低产田或新生长区施用，效果比较显著。对细菌之间关系的研究和测试不够完善，菌剂单一，菌菌之间缺乏合作，容易互相排斥，最后菌菌之间分崩离析。也容易给环境侵害，带来作物不可逆转的伤害，带来的后果如下：过量缺乏铁元素和重碳酸盐的胁迫。导致农民收益降低，从而降低农业的生产水平。
3.市场上现有的微生物芽孢杆菌菌剂往往药效相近、缺乏对碳源的补充、对氮元素的补充少之又少、药效持续时间短、过量缺乏铁元素的胁迫，而且还有几率带来植物不可逆的伤害，导致农民失收，收益下降。现在芽孢杆菌菌剂在市场泛滥，必须做出相对应的环保菌剂，而且带来可持续发展的农业菌剂。


技术实现要素：

4.本发明旨在提供一种提升作物对抗缺铁胁迫能力的微生物制剂及其应用，能够有效改善作物铁元素缺乏胁迫的黄化现象，并促进作物种子萌发、叶绿素、氮元素合成积累，进而促进作物生长。
5.基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：
6.第一方面，本发明提供一种提升作物对抗缺铁胁迫能力的微生物制剂，微生物制剂为丛枝菌根真菌和巴西固氮螺菌混合培养形成的复合菌剂。
7.丛枝菌根真菌(glomus intraradices)在自然界中存在普遍的与植物共生现象，所谓的菌根，就是土壤中的菌根真菌菌丝与高等植物营养根系形成的一种联合体。共生真菌从植物体内获取必要的碳水化合物及其他营养物质，而植物也从真菌那里得到所需的营养及水分等，从而达到一种互利互助、互通有无的高度统一，既有利于提高植物抗御不良环境的能力，促进植物生长，也有利于菌根真菌的生存。这种关系有时会发展到双方难分难舍的程度，植物缺乏菌根无法生存下去，而菌根菌缺乏必需的植物根系共生则无法完成生活史，不能继续繁殖。它既具有一般植物根系的特征，又具有专性真菌的特性。丛枝根真菌(glomus intraradices)是一种能与植物建立互惠共生关系的根部内生真菌，既能固氮，也能促进植物生长，增加作物产量。
8.巴西固氮螺菌(azospirillum brasilense)是一种能够自主生物固氮的微生物，它不仅能与多种作物和重要的禾本科作物如水稻、玉米、小麦、甘蔗等根部联合共生，而且适应性强。它能把空气中的n2转化为对作物有效的nh
4+
、nh
3+
与土壤中的金属离子进行结合，从而植物的根系把充分的氮元素被作物吸收，也显著增加了作物面的株高、茎粗、地上部和
底下不干样质量。
9.本发明通过将丛枝菌根真菌与巴西固氮螺菌混合培养制得的复合菌剂，经作物灌溉试验发现，相对于丛枝菌根真菌、巴西固氮螺菌单一菌剂以及其它固氮螺菌与丛枝菌根真菌混合培养形成的混合菌剂，本发明提供的微生物制剂具有更优的促作物种子萌发以及促作物生长的效果，并能够有效改善作物缺铁黄化症状。
10.进一步地，微生物制剂中丛枝菌根真菌的活菌数为为2.5
×
106～1.3
×
109；巴西固氮螺菌的活菌数为为1.6
×
107～3.1
×
108。
11.进一步地，丛枝根菌真菌的保藏编号为bgc bj03，所述巴西固氮螺菌的保藏编号为cgmcc 1.10379。
12.进一步地，作物包括水稻、小麦、玉米、柑橘、大豆、高粱、芝麻、花生。
13.经试验发现，本发明提供的由丛枝菌根真菌和巴西固氮螺菌混合培养形成的复合菌剂对上述作物均表现出促种子萌发、促作物生长以及改善缺铁胁迫黄化现象。
14.第二方面，本发明提供前述微生物制剂在作物对抗铁元素缺乏胁迫中的应用。
15.经试验发现，本发明菌剂对缺铁胁迫黄化后的作物进行处理后，作物中铁元素含量提升，明显改善了作物黄化现象。
16.第三方面，本发明提供前述微生物制剂在作物促生长中的应用。
17.经试验发现，经本发明菌剂灌溉处理后，有效促进叶绿素合成积累，促进作物生物学性状如株高、根长、根数、叶长、叶宽、根鲜质量、地上部鲜质量、根干质量、地上部干质量的增加，促进作物生长。
18.第四方面，本发明提供前述微生物制剂在耐低铁作物育种中的应用。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
20.本发明首次将丛枝菌根真菌与巴西固氮螺菌复配制得微生物制剂，制剂中丛枝菌根真菌与巴西固氮螺菌相互合作，通过提高光合速率、增强作物对铁元素质营养的吸收与利用和诱导生长素的分泌，促进作物地上部的生长，本发明混合菌剂自主生物固氮为水稻等作物提供氮源，增强作物对氮源的吸收，诱导生长素的的分泌，促进作物生长。
21.相对于丛枝菌根真菌、巴西固氮螺菌单一菌剂以及其它固氮螺菌与丛枝菌根真菌混合培养形成的混合菌剂，本发明提供的微生物制剂具有更优的促作物种子萌发以及促作物生长的效果，并能够有效改善作物缺铁黄化症状。
附图说明
22.图1为不同处理对应水稻叶绿素含量变化曲线图；
23.图2为不同处理对应小麦叶绿素含量变化曲线图；
24.图3为不同处理对应玉米叶绿素含量变化曲线图；
25.图4为不同处理对应柑橘叶绿素含量变化曲线图；
26.图5为不同处理对应大豆叶绿素含量变化曲线图；
27.图6为不同处理对应高粱叶绿素含量变化曲线图；
28.图7为不同处理对应芝麻叶绿素含量变化曲线图；
29.图8为不同处理对应花生叶绿素含量变化曲线图。
具体实施方式
30.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
31.实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
32.实施例1
33.本实施例提供一种微生物制剂，微生物制剂为丛枝菌根真菌和巴西固氮螺菌混合培养形成的复合菌剂，其中，丛枝菌根真菌(glomus intraradices)菌株购自北京市农林科学院植物营养与资源研究中心、中国丛枝菌根真菌菌种质资库(bgc)，保藏编号为bj03；巴西固氮螺菌(azospirillum brasilense)菌株购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc1.10379。
34.将丛枝菌根真菌(glomus intraradices)和巴西固氮螺菌(azospirillum brasilense)接种于2l lb液体培养基，于避光的恒温振荡器内在30℃、180r/min条件下，混合培养7d，制得本发明微生物制剂，即混合菌剂，混合菌剂中丛枝菌根真菌的活菌数为3.2
×
108；巴西固氮螺菌的活菌数为2.7
×
107。
35.如下将以单一丛枝菌根真菌菌剂、巴西固氮螺菌菌剂以及无菌水作为参照，分析本发明混合菌剂对作物育种、作物促生长的效果。具体试验方法如下：
36.1、供试菌剂或空白对照
37.(1)混合菌剂，混合菌剂的获得参照前述记载的方法。
38.(2)丛枝菌根真菌菌剂
39.将丛枝菌根真菌(glomus intraradices)接种于经灭菌的lb液体培养基上、于黑暗的恒温振荡器内，在30℃、180r/min的条件下培养7d，作为单一丛枝菌根真菌菌液备用，菌液中丛枝菌根真菌的活菌数为1.3
×
109。
40.(3)巴西固氮螺菌菌剂
41.将巴西固氮螺菌(azospirillum brasilense)接种于经灭菌的lb液体培养基上、于黑暗的恒温振荡器内，在30℃、180r/min的条件下培养7d，作为单一巴西固氮螺菌菌液备用，菌液中巴西固氮螺菌的活菌数为3.1
×
108。
42.(4)无菌水
43.2、供试种子及其处理
44.供试种子选择水稻(谷顿18号)、小麦(周麦16)、玉米(朕单958)、柑橘(爱媛38号)、大豆(中黄37)、高梁(佳矮60)、芝麻(航天黑巨芝)、花生(金冠308)。各选取健康饱满的20粒种子，置于70％乙醇溶液中8min，无菌水冲洗3次，置于0.5％次氯酸钠溶液中10min，无菌水冲洗数次后，各将种子铺在湿润滤纸上，在黑暗的环境下恒温培养箱28～30℃催芽，每隔2d浇一次200ml无菌水，14天后各选取长势一致的苗备用。
45.3、试验方法及试验结果
46.(1)对作物缺铁胁迫的改善效果试验
47.14d后各选取长势一致的苗，各定苗10盆，共80盆，置于(不添加蔗糖)的ms培养基平板上置于28℃、16h光照/8h黑暗的光暗交替培养箱中培养。培养一个月后，每盆施浇
intraradices)菌液、巴西固氮螺菌(azospirillum brasilense)菌液、混合菌液的试验组中各苗明显长得茂盛，结果由表2～9所示。由表2～9结果可知，相对于单一菌剂处理，混合菌剂处理后，对作物的促生效果更优。
56.表2不同处理后水稻的生物学性状
57.水稻(谷顿18号)对照丛枝菌根真菌巴西固氮螺菌混合菌剂株高/cm16.1218.8117.2119.34根长/cm10.2312.3211.512.37根数10.2013.3211.5613.46最大叶长/cm10.2312.5611.6313.46最大叶宽/cm0.210.310.260.35根鲜质量/g0.03100.03760.02790.0389地上部鲜质量/g0.07530.08050.07560.0885根干质量/g0.00340.00400.00120.0044地上部干质量/g0.00600.00900.00870.0098
58.表3不同处理后小麦的生物学性状
59.小麦(周麦16)对照丛枝菌根真菌巴西固氮螺菌混合菌剂株高/cm16.4518.6117.1218.39根长/cm10.7912.2311.2313.56根数10.513.4511.1513.45最大叶长/cm9.8712.6511.4512.39最大叶宽/cm0.230.300.230.35根鲜质量/g0.0320.03560.02750.0382地上部鲜质量/g0.07620.08150.07460.0885根干质量/g0.00350.00410.00150.0041地上部干质量/g0.00810.00900.00770.1108
60.表4不同处理后玉米的生物学性状
61.玉米(朕单958)对照丛枝菌根真菌巴西固氮螺菌混合菌剂株高/cm20.1218.5617.1325.49根长/cm15.7912.1211.5618.56根数16.513.4511.1220.45最大叶长/cm10.8712.1511.1215.39最大叶宽/cm2.30.320.260.35根鲜质量/g0.12100.14650.097515.20地上部鲜质量/g0.07620.08150.07450.0895根干质量/g0.012350.01350.01250.0141地上部干质量/g0.01810.02910.01710.0308
62.表5不同处理后柑橘的生物学性状
63.柑橘(爱媛38号)对照丛枝菌根真菌巴西固氮螺菌混合菌剂
株高/cm10.2312.5611.1313.15根长/cm4.795.124.965.56根数3.55.4511.125.5最大叶长/cm3.874.153.124.39最大叶宽/cm2.233.222.263.35根鲜质量/g0.03220.04650.03750.0381地上部鲜质量/g0.07610.08150.07450.0881根干质量/g0.00310.00400.00250.0041地上部干质量/g0.10810.12910.11710.1307
64.表6不同处理后大豆的生物学性状
65.大豆(中黄37)对照丛枝菌根真菌巴西固氮螺菌混合菌剂株高/cm20.4524.5619.1325.39根长/cm9.7912.1210.9613.56根数11.513.4511.1214.45最大叶长/cm5.876.155.127.39最大叶宽/cm3.233.562.264.35根鲜质量/g0.0420.04650.03750.0482地上部鲜质量/g0.08620.08150.07450.0985根干质量/g0.00250.00400.00250.0031地上部干质量/g0.10310.12910.11710.1308
66.表7不同处理后高粱的生物学性状
[0067][0068][0069]
表8不同处理后芝麻的生物学性状
[0070]
芝麻(航天黑巨芝)对照丛枝菌根真菌巴西固氮螺菌混合菌剂株高/cm15.4518.5617.1323.39根长/cm8.7912.129.9613.56根数9.55.4511.1212.45最大叶长/cm3.875.154.156.39最大叶宽/cm1.893.223.264.03
根鲜质量/g0.04200.05650.04950.0582地上部鲜质量/g0.08620.08250.07450.0985根干质量/g0.00450.00660.00560.0072地上部干质量/g0.10820.12910.11710.1345
[0071]
表9不同处理后花生的生物学性状
[0072]
花生(金冠308)对照丛枝菌根真菌巴西固氮螺菌混合菌剂株高/cm17.4518.5717.1320.39根长/cm9.7911.129.9612.56根数12.515.4513.1216.45最大叶长/cm3.875.154.156.39最大叶宽/cm2.233.223.264.35根鲜质量/g0.03200.05650.04950.0682地上部鲜质量/g0.08620.10250.09450.1085根干质量/g0.00450.00660.00560.0071地上部干质量/g0.10810.12910.11710.1308
[0073]
在利用上述菌剂处理后第7天、14天、21天、28天、35天分别取样，用丙酮与醇等体积混合液浸提各试样苗叶片的叶绿素，以浸提液为空白对照，在波长645nm和663nm下测定吸光度，按丙酮法计算总叶绿素含量，结果如图1～8所示。可以看出，相对于对照组及单一菌剂处理，混合菌剂处理后的作物苗中叶绿素的含量明显较高。进一步表明，混合菌剂较单一菌剂对作物具有更优的促长效果。
[0074]
(3)混合菌剂固氮活性测定
[0075]
固氮活性的测定方法参考williams等(1987)和wilson等(2012)。将乙炔还原器进行密封，先抽出5％的空气，然后注射等体积的乙炔，使反应器中的乙炔浓度为5％。乙炔气体由自制的乙炔反应器经过电石与纯水反应生成储气袋中。反应器在25℃静置反应8h后，采集反应器中的气体注入采气瓶中，利用气相色谱仪分析乙烯产量。
[0076]
采用气相色谱仪(上海仪电分析)测定乙炔的生成量。色谱柱为gdx-50260/80mesh 3mm直径填充柱。乙炔标准气体浓度100mg/l。分别将28.8℃～29.8℃培养48h的恒温振荡器里单菌株培养的丛枝菌根真菌(glomus intraradices)、单菌株培养的巴西固氮螺菌(azospirillum brasilense)、丛枝菌根真菌与巴西固氮螺菌混合菌剂、空白对照(蒸馏水)分别取样1ml来测定乙炔还原活性，将新鲜的根瘤样品洗净，出去多余的水分，放入带塞的血清瓶，注射一定量的乙炔气体，于28℃震荡半小时以上测定产生的乙烯量。测定后将根瘤放入80摄氏度烘箱，烘16h称取干瘤重。
[0077]
根据公式固氮酶活性(nmol/mg
·
h)＝c2h4nmol/[菌体蛋白量(mg)
×
反应时间(h)]，其中c2h4nmol＝1000
×
c2h4体积(μl)
×
273
×
p/[22.4
×
(273+t℃)
×
760]，其中p为气压(mm汞柱)，t为反应温度。
[0078]
根据乙烯浓度与色谱峰面积对应关系标准曲线以及乙炔还原法色谱图计算公式计算得出，各组测试结果如表10所示，由表10可知，相对于单一菌剂，由巴西固氮螺菌和丛枝菌根菌混合培养形成的混合菌剂的固氮性能明显更优。
[0079]
表10不同菌剂的固氮性能
[0080]
试验菌种固氮酶活性(nmol c2h4*g-1
*h-1
)巴西固氮螺菌41.56丛枝菌根菌45.45混合菌剂81.45空白对照0
[0081]
实施例2
[0082]
本实施例拟探究不同固氮菌与丛枝菌根菌混合培养形成的混合菌剂对作物的促长效果。
[0083]
试验菌剂分别为：1、巴西固氮螺菌与丛枝菌根菌混合培养形成的混合菌剂；2、蜜糖草固氮螺菌与丛枝菌根菌混合培养形成的混合菌剂；3、伊拉克固氮螺菌与丛枝菌根菌混合培养形成的混合菌剂；4、盐居固氮螺菌与丛枝菌根菌混合培养形成的混合菌剂；5、圆褐固氮螺菌与丛枝菌根菌混合培养形成的混合菌剂；6、亚马逊固氮螺菌与丛枝菌根菌混合培养形成的混合菌剂。
[0084]
参照如下方法获得上述混合菌剂：
[0085]
将丛枝菌根真菌(glomus intraradices)和巴西固氮螺菌(azospirillum brasilense)接种于2l lb液体培养基，于避光的恒温振荡器内在30℃、180r/min条件下，混合培养7d，制得混合菌剂。
[0086]
混合菌剂浇灌方法如下：
[0087]
选择水稻(谷顿18号)、小麦(周麦16)、玉米(朕单958)、柑橘(爱媛38号)、大豆(中黄37)、高梁(佳矮60)、芝麻(航天黑巨芝)、花生(金冠308)。各选取健康饱满的20粒种子，置于70％乙醇溶液中8min，无菌水冲洗3次，置于0.5％次氯酸钠溶液中10min，无菌水冲洗数次后，各将种子铺在湿润滤纸上，在黑暗的环境下恒温培养箱28～30℃催芽，每隔2d浇一次200ml无菌水，统计发芽率。
[0088]
14天后各选取长势一致的苗备用，分别取经50倍无菌水稀释后的上述混合菌剂菌液，每隔7d利用上述稀释菌液对试验苗进行浇灌，同时以浇灌等量的无菌水作为清水对照，待浇灌处理第40天，测量各试验组中苗的地上部分干物增量、地下部分总量增量和总干物质增量，结果如表11所示。
[0089]
表11不同混合菌剂对作物的促长效果
[0090]
[0091][0092]
由表11结果可知，相对于其它固氮螺菌与丛枝菌根菌形成的复合菌剂，由巴西固氮螺菌与丛枝菌根真菌混合培养形成的混合菌剂处理后，作物种子的发芽率提升较为明显。并且，由巴西固氮螺菌与丛枝菌根真菌混合培养形成的混合菌剂处理后，作物的地上部分干物增量、地下部分总量增量和总干物质增量均高于其它混合菌剂处理效果。
[0093]
综上所述，相对于丛枝菌根真菌(glomus intraradices)、巴西固氮螺菌(azospirillum brasilense)单一菌剂，由二者混合培养形成的混合菌剂具有对作物更优的促长效果，以及种子萌发率。相对于其它固氮螺菌与丛枝菌根真菌混合培养形成的混合菌剂，由巴西固氮螺菌(azospirillum brasilense)与丛枝菌根真菌(glomus intraradices)混合培养形成的混合菌剂具有更优的促种子萌发以及促作物生长的效果。本发明混合菌剂促进作物地上部的生长与叶绿素含量有关，本发明混合菌剂通过提高光合速率、增强作物对铁元素质营养的吸收与利用和诱导生长素的分泌，促进作物地上部的生长，本发明混合菌剂自主生物固氮为水稻等作物提供氮源，增强作物对氮源的吸收，诱导生长素的的分泌，促进作物生长。
[0094]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。