一种微流控芯片及其装置的制作方法

1.本实用新型涉及医疗检测领域，尤其涉及一种微流控芯片及其装置。


背景技术：

2.细菌感染是最常见的社区获得性感染和医院获得性感染。不恰当的经验性治疗会导致耐药和多耐药病原体的增加，对全球医疗保健构成巨大威胁。这些因素推动了对感染进行快速诊断的需求，其中，实现病原菌的快速鉴定和药敏试验是目前面临的主要挑战。
3.临床微生物实验室对细菌感染的常规筛查试验包括：试纸试验、显微镜下分析和革兰氏染色，但是这些试验的特异性和灵敏度较差。此外，这些试验无法提供病原体的精准鉴定信息。基于基因型的鉴定方法，如荧光原位杂交和聚合酶链式扩增，具有快速、准确的特点，但这些方法需要所有可能的感染病原体的先验信息，限制了它们的广泛应用。maldi-tof ms是进行高通量细菌鉴定的有力工具，它在没有细菌的先验信息的情况下表现优异，其操作对非专业人士友好。但用于maldi-tof ms鉴定的样品需要事先进行培养，以获得足够量的细菌，培养过程通常需要6～48h，甚至更长的时间。细菌培养的周转时间是基于maldi-tof ms进行细菌鉴定的限速步骤。
4.而微流控技术提供了缩短周转时间的解决方案。微流控技术支持基于机械的分离富集，以及基于识别单元的富集。微流控集成识别单元能够实现有效的混合，通过在低雷诺数的层流中诱导微小涡旋来增加目标细菌和识别单元之间相互作用的数量。与有外部能量来源的主动混合相比，特定微结构诱导的被动混合具有节能、对样品热损伤小等优势，因此经常采用被动混合器来提高混合效率。对于感染诊断而言，与多种病原作用的识别单元对后续分析具有重要意义。特异性识别可能会提供较高的灵敏度，但同样需要所有可能的感染病原体的先验信息，在应用中的灵活性较低。
5.因此，亟需一种微流控芯片及其装置。


技术实现要素：

6.本实用新型的目的是为了克服病原体鉴定所需周转时间长的不足，提供一种微流控芯片及其装置，进一步提高了细菌的捕获效率和捕获纯度，能实现对多种细菌的富集以及鉴定，其操作简单、高效、成本低，所需耗材容易获得；该芯片还可以灵活地与其他检测方法，例如拉曼光谱、荧光检测和电化学检测等检测方法联用；也可以广泛应用于食品种污染菌和其他生物流体中细菌的鉴定。
7.为实现上述目的，本实用新型采取的技术方案是：
8.本实用新型的第一方面是提供一种微流控芯片，包括：由两层聚二甲基硅烷层组成的芯片主体；下层所述聚二甲基硅烷层的上表面设有蛇形通道，所述蛇形通道中设有若干人字形微结构；
9.其中，所述人字形微结构包括：短臂以及与所述短臂呈90
°
夹角的长臂；所述短臂的一端与所述蛇形通道一侧的内壁连接，所述短臂的另一端与所述长臂的一端连接，所述
长臂的另一端与所述蛇形通道另一侧的内壁连接。
10.优选地，所述蛇形通道包括：进样口、出样口以及若干依次交替设于所述进样口与所述出样口间的水平段和连接段；
11.其中，所述进样口以及所述出样口分设于所述芯片主体的对角，所述水平段平行于所述芯片主体的长度方向。
12.优选地，所述蛇形通道的总长度为65cm-260cm，所述蛇形通道的宽度为1mm-4mm，所述蛇形通道的深度为0.1mm-0.4mm，所述蛇形通道中各所述水平段于所述芯片主体宽度方向上的间距为2mm-8mm。
13.优选地，以十个相邻的所述人字形微结构为一组，两组相邻的所述人字形微结构沿所述蛇形通道的轴向方向呈轴对称。
14.优选地，所述短臂的长度为0.45mm-1.8mm，所述长臂的长度为0.92mm-3.68mm，所述短臂以及所述长臂的宽度为0.018mm-0.09mm，所述短臂以及所述长臂的高度为0.05mm-0.2mm，各所述人字形微结构于所述蛇形通道轴向方向上的间距为0.1mm-0.4mm。
15.本发明的第二方面是提供一种包括如上所述微流控芯片的装置，还包括：分散于所述芯片主体中的万古霉素修饰磁珠、设于所述微流控芯片下方的磁铁以及用于固定所述微流控芯片与所述磁铁的3d打印套件。
16.优选地，所述万古霉素修饰磁珠由edc-nhs法在氨基磁珠上修饰万古霉素制得。
17.优选地，所述氨基磁珠的粒径为20nm-2μm。
18.本实用新型采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
19.本实用新型使用的微流控芯片能够对病原菌进行有效富集、鉴定，其中人字形微结构可以诱导混沌混合，加强磁珠和细菌间的作用，进一步增强了磁珠对细菌的富集效率，富集后的磁珠-细菌混合物可以直接用于maldi-tof ms分析，以实现对所富集细菌的精准鉴定。
附图说明
20.图1为本实用新型中微流控芯片装置的结构示意图；
21.图2为图1中框选处的局部放大图；
22.图3为本实用新型中蛇形通道及人字形微结构的结构示意图；
23.图4为图3的局部放大图；
24.图5为本实用新型中蛇形通道的结构示意图；
25.图6为本实用新型中人字形微结构的结构示意图；
26.图7为四种不同细菌经富集后质谱图和标准菌株质谱图的对比；
27.其中，附图标记包括：芯片主体1；万古霉素修饰磁珠2；蛇形通道3；进样口31；水平段32；连接段33；出样口34；人字形微结构4；短臂41；长臂42；磁铁5；3d打印套件6。
具体实施方式
28.下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提
下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。
29.需要说明的是，在不冲突的情况下，本实用新型中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
30.下面结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步说明，但不作为本实用新型的限定。
31.实施例1
32.如图1所示，本实施例提供一种微流控芯片装置，包括微流控芯片(尺寸为82.0mm
×
57.2mm)、分散于所述芯片主体1中的万古霉素修饰磁珠2、设于所述微流控芯片下方的磁铁5以及用于固定所述微流控芯片与所述磁铁5的3d打印套件6；
33.如图2-4所示，所述微流控芯片包括：由两层聚二甲基硅烷层组成的芯片主体1；下层所述聚二甲基硅烷层的上表面设有蛇形通道3，所述蛇形通道3中设有若干人字形微结构4；
34.如图5所示，所述蛇形通道3包括：进样口31、出样口34以及若干依次交替设于所述进样口31与所述出样口34间的水平段32和连接段33；
35.其中，所述进样口31以及所述出样口34分设于所述芯片主体1的对角，所述水平段32平行于所述芯片主体1的长度方向；所述蛇形通道3的总长度为650mm，所述蛇形通道3的宽度为1mm，所述蛇形通道3的深度为0.1mm，所述蛇形通道3中各所述水平段32于所述芯片主体1宽度方向上的间距为2mm；
36.如图6所示，所述人字形微结构4包括：短臂41以及与所述短臂41呈90
°
夹角的长臂42；
37.其中，所述短臂41的一端与所述蛇形通道3一侧的内壁连接，所述短臂41的另一端与所述长臂42的一端连接，所述长臂42的另一端与所述蛇形通道3另一侧的内壁连接；以十个相邻的所述人字形微结构4为一组，两组相邻的所述人字形微结构4沿所述蛇形通道3的轴向方向呈轴对称；所述短臂41的长度为0.45mm，所述长臂42的长度为0.92mm，所述短臂41以及所述长臂42的宽度为0.018mm，所述短臂41以及所述长臂42的高度为0.05mm，各所述人字形微结构4于所述蛇形通道3轴向方向上的间距为0.1mm。
38.作为一个优选的实施方式，所述万古霉素修饰磁珠2由edc-nhs法在粒径为200nm的氨基磁珠上修饰万古霉素制得，步骤包括：取100μl粒径为200nm的氨基磁珠，采用2-(n-吗啉)乙磺酸吐温(mest)溶液(30mmol/l，mes，0.05％tween-20溶于去离子水中，ph＝6.0)洗涤3次，然后将磁珠重悬于200μl含有10mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、10mg n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和20mg万古霉素的mest中，超声反应1h；反应结束后，使用磁力架将修饰好万古霉素的磁珠回收，除去上清液，并用200μl mest溶液将修饰好的磁珠洗涤4次，以除去过量未反应的万古霉素；最后将万古霉素磁珠重悬于200μlmest溶液中，并储存于4℃以备使用。
39.实施例2
40.本实施例中分别吸取金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、鹑鸡肠球菌、表皮葡萄球菌，由紫外分光光度计确认其浓度，加标到10ml尿液中，细菌的终浓度为1
×
105～1
×
106cfu/ml。
41.过滤：使用5μm孔径的针式过滤器将加标的尿液过滤。
42.离心重悬：将过滤后的尿液，在12,000g离心力下，离心2分钟，弃上清；重悬于250μl的pbst中。
43.微流控操作：首先将芯片倒置，然后将万古霉素磁珠注入芯片，除去液体并正置芯片，放置磁铁；将250μl菌液以250μl/h的速度注入芯片，进行捕获；捕获后，撤去磁铁；将收集到离心管中的磁珠-细菌复合物进行洗涤，重悬于1μl去离子水中。
44.基质溶液的配制：称取10mg的α-氰基-4-羟基肉桂酸加入到1ml 50％的乙腈，2.5％三氟乙酸和47.5％去离子水(v/v)的混合溶液中。
45.点样：将重悬的磁珠-细菌复合物点于靶板，空气中晾干，覆盖上基质。
46.maldi-tof ms质谱检测：仪器条件为线性正离子模式，离子加速电压20kv，离子延迟提取时间112ns，激光强度52％。
47.maldi-tof ms鉴定：从加标尿样中富集细菌后的磁珠-细菌复合物(磁珠@细菌)质谱图与相应标准菌株的质谱图的对比见图7，表1为加标尿样中细菌富集效率及鉴定结果。
48.表1
[0049][0050][0051]
对于质谱结果的解读：图7中4株不同的菌富集后的磁珠-细菌复合物的质谱指纹图谱都和对应的标准菌株的谱图一致，说明捕获到的细菌能够被maldi-tof ms有效表征。
[0052]
对于富集效率和鉴定结果的解读：结合人字形微结构和万古霉素修饰磁珠的微流控芯片对于加标尿样中的4种细菌实现了高效捕获，且均被maldi-tof ms正确鉴定，鉴定的置信度较高。
[0053]
综上所述，该微流控芯片通过人字形微结构在微通道中诱导的混沌现象对芯片中的细菌与磁珠进行被动混合，以增强细菌和磁珠的相互作用。使用该芯片对尿液样品中的细菌进行富集，富集后的磁珠-细菌复合物直接用于基质辅助激光解吸飞行时间质谱(maldi-tof ms)分析，实现对样品中细菌的鉴定；该方法能在1.5小时内对尿液中的病原菌进行富集、鉴定，具有较强的可操作性和实用性；且该方法适用于不同种细菌，是一种较为通用、快速的细菌富集、鉴定方法。
[0054]
以上所述仅为本实用新型较佳的实施例，并非因此限制本实用新型的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本实用新型说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本实用新型的保护范围内。