生物素-链霉抗生物素蛋白裂解组合物和文库片段裂解的制作方法

生物素-链霉抗生物素蛋白裂解组合物和文库片段裂解
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年2月3日提交的美国临时申请序列号62/969,440的权益，该临时申请的内容全文以引用方式并入本文。


背景技术：

3.生物阵列是用于检测、分析和/或纯化分子(包括蛋白质、核酸等)的广泛工具之一。在一些应用中，这些阵列被工程化为包括可以捕获所关注分子的探针。在其他应用中，这些阵列被工程化为具有结合对的一个成员，并且所关注分子用结合对的另一个成员标记或加标。结合对的示例包括生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白对生物素的亲和力是最强非共价生物相互作用之一。此外，生物素标记很少干扰标记分子的功能。这些特性使生物素和抗生物素蛋白或生物素和链霉抗生物素蛋白特别适用于各种生物应用。
4.在一些生物应用中，希望以条件和受控方式拴系或连接所关注分子，其中拴系或连接在特定时间被裂解，并且被裂解的所关注分子的解离受到控制。在一些情况下，生物素和抗生物素蛋白或生物素和链霉抗生物素蛋白相互作用的强度可使条件和/或受控裂解变得困难。


技术实现要素：

5.本文公开了可用于从文库片段所附接的固体支持物裂解这些文库片段的组合物和方法。一种示例组合物能够快速且有效地裂解生物素-链霉抗生物素蛋白键。另一种示例组合物在允许空间释放文库片段的条件下被激活。一种示例方法涉及从固体支持物两步释放文库片段。两步释放的裂解机制是正交的，因此第一裂解机制是不稳定的，而第二裂解机制是稳定的。第二裂解机制允许空间释放文库片段。
6.所述组合物和方法可用于流通池上。本文所公开的示例中的每一个可以用于流通池表面上，而不会对流通池表面上的化学物质(例如，聚合水凝胶、扩增引物等)产生有害影响。
7.本文所公开的第一方面是一种生物素-链霉抗生物素蛋白裂解组合物，包含：约10体积％至约50体积％的甲酰胺试剂；以及余量的盐缓冲液。
8.本文所公开的第二方面是一种生物素-链霉抗生物素蛋白裂解组合物，由以下项组成：约10体积％至约50体积％的甲酰胺试剂，所述甲酰胺试剂包含甲酰胺和任选的缓冲液；以及余量的盐缓冲液，所述盐缓冲液包含氯化钠、柠檬酸钠和生物相容性表面活性剂。
9.本文所公开的第三方面是一种方法，包括：将文库片段引入流通池中，其中所述文库片段附接到链霉抗生物素蛋白涂覆的固体支持物；将生物素-链霉抗生物素蛋白裂解组合物引入到所述流通池中，所述生物素-链霉抗生物素蛋白裂解组合物包含约10体积％至约50体积％的甲酰胺试剂和余量的盐缓冲液；以及使所述生物素-链霉抗生物素蛋白裂解组合物在约60℃至约70℃范围内的温度下在所述流通池中温育，从而致使所述文库片段中
的至少一些文库片段从所述固体支持物释放并且接种到所述流通池的表面上的扩增引物上。
10.本文所公开的第四方面是一种试剂盒，包括：链霉抗生物素蛋白涂覆的固体支持物；接头序列，在所述接头序列的一端处附接有生物素，其中所述生物素将附接到所述链霉抗生物素蛋白涂覆的固体支持物；样品流体，所述样品流体包含将片段化并附接到所述接头序列的基因组序列；以及生物素-链霉抗生物素蛋白裂解组合物，所述组合物包含约10体积％至约50体积％的甲酰胺试剂和余量的盐缓冲液。
11.本文所公开的第五方面是一种方法，包括将脱硫生物素化文库片段引入流通池中，其中所述脱硫生物素化文库片段附接到链霉抗生物素蛋白涂覆的固体支持物；将裂解组合物引入所述流通池中，其中所述裂解组合物处于约18℃至约30℃范围内的温度下，并且其中所述裂解组合物包含游离生物素和盐缓冲液；以及将所述裂解组合物的温度增加到约60℃至约70℃，从而致使所述文库片段中的至少一些文库片段从所述固体支持物释放并且接种到所述流通池的表面上的扩增引物上。
12.本文所公开的第六方面是一种文库制备流体，包含液体载体和所述液体载体中的文库制备珠粒；每个文库制备珠粒包含固体支持物和附接到所述固体支持物的转座体复合物；所述转座体复合物包含：转座酶；双链分子，所述双链分子与所述转座酶结合，所述双链分子包含：转移链，所述转移链包含3'转座子末端序列、接头序列、裂解位点和5'连接末端序列，其中所述接头序列和所述5'连接末端序列侧接所述裂解位点；以及非转移链，所述非转移链包含3'转座子末端序列；以及夹板序列，所述夹板序列与所述接头序列的至少一部分和所述5'连接末端序列的至少一部分杂交，使得其夹固所述裂解位点。
13.本文所公开的第七方面是一种方法，包括将多个预备的文库制备珠粒引入反应容器中，所述预备的文库制备珠粒中的每一个文库制备珠粒包含固体支持物；多个桥连分子，所述多个桥连分子附接到所述固体支持物，所述桥连分子中的每一个桥连分子包含：双链dna片段；转移链，所述转移链分别附接到所述双链dna片段的每条链的5'端处，每条转移链包含3'转座子末端序列、第一接头序列、裂解位点和5'连接末端序列，其中所述第一接头序列和所述5'连接末端序列侧接所述裂解位点；以及第二接头序列，所述第二接头序列分别附接到所述双链dna片段的每条链的3'端处；以及夹板序列68，其与所述第一接头序列的至少一部分和所述5'连接末端序列的至少一部分杂交，使得其夹固所述裂解位点；将所述预备的文库制备珠粒暴露于裂解剂以去除所述裂解位点，由此所述多个桥连分子通过所述夹板保持附接到所述固体支持物；以及将所述反应容器加热至所述夹板和所述双链dna片段的解离温度。
14.应当理解，这些方面中的任一个方面的任何特征可以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第一方面和/或第二方面和/或第三方面和/或第四方面和/或第五方面和/或第六方面和/或第七方面的特征的任何组合可与本文所公开的示例中的任何示例组合，以实现如本公开所述的有益效果，包括例如改进的生物素-链霉抗生物素蛋白键裂解。
附图说明
15.通过参考以下具体实施方式和附图，本公开的示例的特征将变得显而易见，其中类似的附图标号对应于类似但可能不相同的部件。为了简洁起见，具有先前描述的功能的
附图标号或特征可结合或可不结合它们出现的其他附图来描述。
16.图1a和图1b是本文所公开的靶材料的不同示例的示意图；
17.图2a至图2c是在片段标签化之前(2a)、在片段标签化期间(2b)以及在片段标签化之后且在非转移链的连接期间(2c)文库制备珠粒的一部分的示意图；
18.图3a是流通池的示例的顶视图；
19.图3b是流动通道和非图案化测序表面的示例的沿图3a的3b-3b线截取的放大横剖视图；
20.图3c是流动通道和图案化测序表面的示例的沿图3a的3c-3c线截取的放大横剖视图；
21.图4是说明从预备的文库制备珠粒中释放测序就绪文库片段的双重机制的示意流程图；
22.图5是描绘四氯-荧光素(tet)qc引物(y轴)相对于裂解组合物中甲酰胺试剂的体积％(x轴)的荧光强度的图；
23.图6是描绘在各种洗涤步骤之后剩余的珠粒的百分比的条形图；并且
24.图7是描绘在不同温度下以及在高盐条件下暴露于游离生物素或脱硫生物素时脱硫生物素化dna释放的百分比的条形图。
具体实施方式
25.在一些测序应用中，将dna文库片段引入流通池中的固体支持物(例如，珠粒)上。可能希望使用固体支持物，因为它可以保存生成文库片段的较长遗传物质的邻近性信息。在一些情况下，使用生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用将dna文库片段附接到固体支持物。对于流通池上的文库接种和扩增，生物素化dna文库片段必然从固体支持物释放出来。本发明人已经发现，一些足够强以破坏生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用的试剂也会干扰生物素化dna文库片段与流通池表面上的引物杂交或者以其他方式对该杂交产生有害影响。作为一个示例，已经发现强变性试剂(例如，约95％甲酰胺和约10mm乙二胺四乙酸(edta))和高温温育(例如，在90℃下温育2分钟)会破坏生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用，然而，释放的生物素化dna文库片段不会与流通池表面杂交。
26.在一个示例中，本文公开了一种裂解组合物，其能够有效地破坏生物素-链霉抗生物素蛋白键，这会完全释放生物素化dna文库片段。被释放后并且在裂解组合物内，生物素化dna文库片段能够经历杂交。因此，本文所公开的裂解组合物有效地破坏生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用并确保立即杂交。裂解组合物在等于或小于70℃的温度下也是有效的。70℃低于大多数流通池的操作温度，因此，在流通池中使用裂解组合物不会对流通池表面上的化学物质(例如，聚合物水凝胶、扩增引物等)产生有害影响。
27.本文所公开的裂解组合物还可以非常快速地有效破坏生物素-链霉抗生物素蛋白键。在一些情况下，温育时间在约2分钟至约5分钟的范围内。当与其他方法(例如，涉及十二烷基硫酸钠(sds)、尿素和生物素的那些方法，这些方法可能涉及15分钟的摇动和15分钟的温育)相比时，这些时间显著减少。
28.本文所公开的裂解组合物还可用于希望破坏生物素-链霉抗生物素蛋白的结合对的其他应用中。
29.在另一个示例中，用脱硫生物素化dna文库片段替换生物素化dna文库片段。在该示例中，裂解在允许空间释放文库片段的条件下被激活。所谓“空间释放”，是指dna片段在不存在惯性流体混合的情况下被释放，因此可以可控地扩散并接种在流通池表面上释放片段的固体支持物附近。当裂解发生在流通池表面上时，裂解条件不会对流通池表面上的化学物质(例如，聚合物水凝胶、扩增引物等)产生有害影响。
30.在另一个示例中，dna文库片段利用双重释放机制附接到固体支持物。双重释放机制包括裂解位点和夹板；这两者均将文库片段保持到固体支持物上，并且每一者都涉及不同的释放过程。当需要文库片段释放时，可使用合适的裂解剂来首先去除裂解位点，然后可使用热量来去除夹板。因为裂解条件涉及两个正交过程(其中一个过程不会引发、影响或以其他方式干扰其他过程)，所以该示例允许受控释放文库片段。
31.定义
32.除非另外指明，否则本文所用的术语应理解为具有其在相关领域中的普通含义。下面列出本文所用的若干术语及其含义。
33.如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括单数和复数两者，除非上下文另有明确指示。如本文所用，术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。
34.本说明书通篇提及的“一个示例”、“另一个示例”、“示例”等意指结合该示例描述的特定要素(例如，特征、结构、组成、构型和/或特性)包括在本文所述的至少一个示例中，并且可或可不存在于其他示例中。此外，应当理解，用于任何示例的所述元素可以任何合适的方式组合在各种示例中，除非上下文另有明确说明。
35.在本公开(包括权利要求)通篇中使用的术语“基本上”和“约”用于描述和说明有小波动，诸如由于处理中的变化引起的。例如，这些术语可以指小于或等于规定值的
±
10％，诸如小于或等于规定值的
±
5％，诸如小于或等于规定值的
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2％，诸如小于或等于规定值的
±
1％，诸如小于或等于规定值的
±
0.5％，诸如小于或等于规定值的
±
0.2％，诸如小于或等于规定值的
±
0.1％，诸如小于或等于规定值的
±
0.05％。
36.此外，应当理解，本文提供的范围包括规定范围和规定范围内的任何值或子范围，如同它们被明确列举一样。例如，由约2mm至约300mm表示的范围应当解释为不仅包括明确列举的限值约2mm至约300mm，而且还包括单个值诸如约15mm、22.5mm、245mm等，以及子范围诸如约20mm至约225mm等。
37.接头：可以例如通过连接或标记与核酸分子融合的线性寡核苷酸序列。合适的接头长度可在约10个核苷酸至约100个核苷酸或约12个核苷酸至约60个核苷酸或约15个核苷酸至约50个核苷酸的范围内。接头可包括核苷酸和/或核酸的任何组合。在一些示例中，接头可以包括与引物(例如，包括通用核苷酸序列(诸如p5或p7序列)的引物)的至少一部分互补的序列。作为一个具体示例，片段的一端处的接头包括与第一流通池引物的至少一部分互补的序列，并且片段的另一端处的接头包括与第二流通池引物的至少一部分相同的序列。互补接头可与第一流通池引物杂交，并且该相同接头是用于其互补拷贝的模板，该互补拷贝可在簇生成期间与第二流通池引物杂交。在一些示例中，接头可以包括测序引物序列或测序结合位点。可将不同接头的组合掺入核酸分子(诸如dna片段)中。
38.化学捕获位点：已经用允许定位靶材料(例如，复合物、蛋白质生物标志物等)的化
学特性改性的流通池表面的一部分。在一个示例中，捕获位点可包括化学捕获剂(即，能够附接、保留或结合靶分子(例如，复合物)的材料、分子或部分)。一个示例化学捕获剂包括能够与靶材料(或与附接到靶材料的连接部分)结合的受体-配体结合对的成员(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸结合蛋白、表位、抗体等)的成员。化学捕获剂的再一个示例是能够与靶材料形成静电相互作用、氢键或共价键(例如，硫醇-二硫化物交换、点击化学、diels-alder等)的化学试剂。
39.复合物：载体(诸如固体支持物)以及附接到载体的测序就绪核酸片段。在本文所公开的一些示例中，载体还包括生物素-链霉抗生物素蛋白结合对的一个成员，其另一个成员是捕获位点的一部分。
40.沉积：任何合适的施加技术，其可为手动的或自动的，并且在一些情况下，导致表面特性的改性。一般来讲，可使用气相沉积技术、涂覆技术、接枝技术等进行沉积。一些具体示例包括化学气相沉积(cvd)、喷涂(例如，超声喷涂)、旋涂、厚涂或浸涂、刮涂刀涂覆、搅打分配、流动通过涂覆(flow through coating)、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷、喷墨印刷等。
41.凹入部：是指基底或图案化树脂中的离散凹面特征部，该离散凹面特征部具有至少部分地被基底或图案化树脂的间隙区域包围的表面开口。凹入部可在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，包括例如圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数量的顶点)等。与该表面正交截取的凹入部的横截面可为弯曲的、正方形、多边形、双曲线形、圆锥形、角形等。例如，凹入部可以是一个孔或两个互连的孔。凹入部还可具有更复杂的结构，诸如脊、台阶特征部等。
42.脱硫生物素：不含硫的生物素类似物，其与抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白的结合没有与生物素的结合那么紧密。该术语还可包括双脱硫生物素和三脱硫生物素。
43.每个：当参考项目的集合使用时，每个识别集合中的单个项目，但不一定是指集合中的每个项目。如果明确公开或上下文另有明确规定，则可能会出现例外情况。
44.流通池：具有可以在其中进行反应的室(例如，其可包括流动通道)、用于将试剂递送到室的入口以及用于从室中去除试剂的出口的容器。在一些示例中，室使得能够检测在该室中发生的反应。例如，室可包括允许对阵列、光学标记分子等进行光学检测的一个或多个透明表面。
45.流动通道：限定在两个粘结的或以其他方式附接的部件之间的区域，该区域可选择性地接纳液体样品。在一些示例中，流动通道可限定在两个图案化或非图案化的测序表面之间，并且因此可与测序表面的一个或多个部件流体连通。
46.片段：遗传物质的一部分或片(例如，dna、rna等)。邻近性保留文库片段是已被片段化的较长核酸样品的较小片，其中该较长核酸样品的邻近性信息已被保留在片段中。
47.核酸分子或样品：任何长度的核苷酸的聚合物形式，并且可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、它们的类似物或它们的混合物。该术语可指单链或双链多核苷酸。
[0048]“模板”核酸分子(或链)可指待分析的序列。
[0049]
核酸样品中的核苷酸可包括天然存在的核酸及其功能类似物。功能类似物的示例能够以序列特异性方式与核酸杂交或能够用作复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核苷酸通常具有含有磷酸二酯键的主链。类似结构可以具有替代的主链键，包括本领域已知
的多种主链键中的任一种。天然存在的核苷酸通常具有脱氧核糖(例如，存在于dna中)或核糖(例如，存在于rna中)。类似结构可以具有替代的糖部分，包括本领域已知的多种糖部分中的任一种。核苷酸可以包括天然或非天然碱基。天然dna可以包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和/或鸟嘌呤中的一种或多种，并且天然rna可以包括腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和/或鸟嘌呤中的一种或多种。可使用任何非天然碱基，诸如锁核酸(lna)和桥核酸(bna)。
[0050]
引物：可与靶序列杂交的核酸分子，诸如附接到文库片段的接头。例如，扩增引物可以用作模板扩增和簇生成的起始点。又如，合成的核酸(模板)链可包括引物(例如，测序引物)可以与之杂交的位点，以便引发与合成的核酸链互补的新链的合成。任何引物可以包括核苷酸或其类似物的任何组合。在一些示例中，引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。引物长度可以是任何数目的碱基长度并且可包括多种非天然核苷酸。在一个示例中，测序引物为短链，范围为10至60个碱基，或20至40个碱基。
[0051]
测序就绪核酸片段：遗传物质在3'端和5'端具有接头的一部分。在测序就绪核酸片段中，每个接头包括已知的通用序列(例如，其与流通池上的引物的至少一部分互补或相同)和测序引物序列。两个接头还可包括索引(条形码或标签)序列。在一个示例中，一侧(例如，包括p5'或p5序列)可含有固体支持物索引，而另一侧(包括p7或p7'序列)可含有样品索引。测序就绪核酸片段可经由插入转座子结合，其中将插入的dna分子固定到固体支持物(例如，珠粒)的表面；或通过结合对或其他可裂解连接基直接固定；或经由杂交结合，其中互补接头序列存在于固体支持物的表面上。
[0052]
测序表面：具有接枝到其上的一种或多种类型的扩增引物的聚合物水凝胶。测序表面还可包括将复合物固定在扩增引物处或附近的化学捕获剂。
[0053]
固体支持物：由刚性或半刚性材料制成的小主体，其形状的特征在于例如球形、椭圆形、微球形或其他公认的颗粒形状，无论是具有规则还是不规则的尺寸。固体支持物可以具有与其附接的测序文库。
[0054]
靶材料：包含生物素-链霉抗生物素蛋白键或脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白键的任何物质。
[0055]
转移和非转移链：术语“转移链”是指包含两个杂交的转座子末端的转移部分的序列。类似地，术语“非转移链”是指包含两个杂交的转座子末端的非转移部分的序列。转移链的3'末端在体外转座反应中结合或转移到双链片段中。表现出与转移的转座子末端序列互补的转座子末端序列的非转移链在体外转座反应中不结合或转移到双链片段中。
[0056]
转座酶：能够与含转座子末端的组合物(例如，转座子、转座子末端、转座子末端组合物)形成功能性复合物并且例如在体外转座反应中催化含转座子末端的组合物插入或转座到与其一起温育的双链dna样品中的酶。如本文所示的转座酶还可包括来自逆转录转座子和逆转录病毒的整合酶。尽管本文所述的许多示例是指tn5转座酶和/或高活性tn5转座酶，但应当理解，可以使用能够以足够的效率将转座子末端插入5'-标签并将dna样品片段化以用于其预期目的的任何转座体系。在特定示例中，转座体系能够以随机或几乎随机的方式将转座子末端插入5'-标签并将dna样品片段化。
[0057]
转座体复合物：在整合作用酶(例如，整合酶或转座酶)与包括整合作用识别位点(例如，转座酶识别位点)的核酸之间形成的复合物。例如，转座体复合物可以是在支持非共价复合物形成的条件下与双链转座子dna一起预温育的转座酶。双链转座子dna可以包括例
如tn5 dna、tn5 dna的一部分、转座子末端组合物、转座子末端组合物的混合物或能够与转座酶(诸如高活性tn5转座酶)相互作用的其他双链dna。
[0058]
转座子末端：仅表现出与在体外转座反应中起作用的转座酶或整合酶形成复合物所必需的核苷酸序列(“转座子末端序列”)的双链核酸dna。在一些示例中，转座子末端能够在转座反应中与转座酶形成功能性复合物。作为示例，转座子末端可以包括由野生型或突变tn5转座酶识别的19个碱基对(bp)外端(“oe”)转座子末端、内端(“ie”)转座子末端或“镶嵌末端”(“me”)转座子末端。转座子末端可包括适用于在体外转座反应中与转座酶或整合酶形成功能性复合物的任何核酸或核酸类似物。例如，转座子末端可以包括dna、rna、修饰碱基、非天然碱基、修饰主链，并且可以在一条链或两条链中包含切口。尽管术语“dna”可在本公开中与转座子末端的组合物结合使用，但应当理解，任何合适的核酸或核酸类似物均可以用于转座子末端。
[0059]
裂解组合物
[0060]
本文所公开的裂解组合物的第一示例适于在等于或小于70℃的温度下破坏生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用。
[0061]
裂解组合物的第一示例包含约10体积％至约50体积％的甲酰胺试剂；以及余量的盐缓冲液。
[0062]
甲酰胺试剂包含甲酰胺：其也被称为氨基甲醛。在一些示例中，甲酰胺试剂可仅包含甲酰胺(没有任何其他组分)。因此，在一些示例中，甲酰胺试剂是100％的甲酰胺。在其他示例中，甲酰胺试剂可包含甲酰胺和任选的缓冲液。
[0063]
裂解组合物的第一示例的余量是盐缓冲液。可使用任何合适的盐缓冲液。作为示例，盐缓冲液是包含氯化钠、柠檬酸钠或它们的组合的水性溶液。在一个具体示例中，盐缓冲液包含约0.75m(750mm)氯化钠和约75mm柠檬酸钠的水溶液。在一些示例中，盐缓冲液包含具有约0.5m氯化钠至约3m氯化钠和/或约50mm柠檬酸钠至约300mm柠檬酸钠的水。
[0064]
盐缓冲液还可包含生物相容性表面活性剂。合适的生物相容性表面活性剂的示例是聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯或聚山梨醇酯20(可以由sigma-aldrich出售的tween
tm
20商购获得)。在一些示例中，盐缓冲液还包含约0.25重量％至约1.5重量％的生物相容性表面活性剂(基于盐缓冲液的总重量)。
[0065]
裂解组合物的第一示例包含约10体积％至约50体积％的甲酰胺试剂和余量的盐缓冲液。因此，裂解组合物的第一示例中盐缓冲液(及其各个组分)的量取决于存在的甲酰胺试剂的量。作为示例，裂解组合物的第一示例可包含约10体积％的甲酰胺试剂和约90体积％的盐缓冲液；或约20体积％的甲酰胺试剂和约80体积％的盐缓冲液；或约30体积％的甲酰胺试剂和约70体积％的盐缓冲液；或约40体积％的甲酰胺试剂和约60体积％的盐缓冲液；或约50体积％的甲酰胺试剂和约50体积％的盐缓冲液。当包括更高量(超过50％)的甲酰胺试剂时，与扩增引物杂交的释放的文库片段可在25℃下变性，这是不希望的。
[0066]
在一些示例中，裂解组合物的第一示例由以下项组成：约10体积％至约50体积％的甲酰胺试剂，该甲酰胺试剂包含甲酰胺和任选的缓冲液；以及余量的盐缓冲液，该盐缓冲液包含氯化钠、柠檬酸钠和生物相容性表面活性剂。在该示例中，裂解组合物的第一示例不
包含任何其他组分。
[0067]
本文所公开的裂解组合物的第二示例适于在约60℃至约70℃范围内的温度下破坏脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用。
[0068]
裂解组合物的第二示例包含游离生物素和盐缓冲液。
[0069]
裂解组合物的第二示例中游离生物素的量部分地取决于将用裂解组合物破坏的脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用的量。在一个示例中，游离生物素可以比要破坏的脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用的量高约10摩尔至约100摩尔范围内的量存在。作为一个具体示例，游离生物素以约2.5μm至约10mm范围内的浓度存在于裂解组合物的第二示例中。在另一个示例中，游离生物素以约4μm至约8mm范围内的浓度存在于裂解组合物的第二示例中。
[0070]
裂解组合物的第二示例的余量是盐缓冲液。可使用任何合适的水性溶液，包括盐。在一些示例中，盐是氯化钠、柠檬酸钠或它们的组合。盐缓冲液具有相对高的盐浓度。例如，盐缓冲液包含约0.75m盐至约0.85m盐的水溶液。在一个具体示例中，盐缓冲液包含约0.75m(750mm)氯化钠和约75mm柠檬酸钠的水溶液。
[0071]
盐缓冲液还可包含生物相容性表面活性剂。合适的生物相容性表面活性剂的示例包括聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯或聚山梨醇酯20(可以由sigma-aldrich出售的tween
tm
20商购获得)。在一些示例中，盐缓冲液还包含约0.1重量％至约1重量％的生物相容性表面活性剂。
[0072]
在一些示例中，裂解组合物的第二示例由以下项组成：游离生物素；以及余量的盐缓冲液，该盐缓冲液包含氯化钠、柠檬酸钠和生物相容性表面活性剂。在该示例中，裂解组合物的第二示例不包含任何其他组分。
[0073]
包含生物素-链霉抗生物素蛋白键或脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白键的靶材料
[0074]
在本文所公开的一些示例中，第一裂解组合物可与包含要破坏的生物素-链霉抗生物素蛋白键的任何靶材料一起使用。在本文所公开的其他示例中，第二裂解组合物可与包含要破坏的脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白键的任何靶材料一起使用。在这些示例中的任一个中，靶材料可以是复合物。
[0075]
一些示例复合物10a和10b分别在图1a和图1b中示出。在本文所公开的方法的一些示例中，复合物10a、10b包含固体支持物12以及通过生物素-链霉抗生物素蛋白键附接到固体支持物12的dna文库片段14、14'、14”。在本文所公开的方法的其他示例中，复合物10a、10b包含固体支持物12以及通过脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白键附接到固体支持物12的dna文库片段14、14'、14”。
[0076]
固体支持物12可以是但不限于玻璃(例如，可控孔度玻璃珠)；磁性响应材料；塑料，诸如丙烯酸、聚苯乙烯或苯乙烯与另一种材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯或聚四氟乙烯(得自the chemours co的)；多糖或交联多糖，诸如琼脂糖、珠(琼脂糖的交联珠状形式，可得自cytivia)或珠(葡聚糖的交联珠状形式，可得自cytivia)；尼龙；硝化纤维；树脂；二氧化硅或基于二氧化硅的材料，包括硅和改性硅；碳纤维；金属；无机玻璃；光纤束；或多种其他聚合物。
[0077]“磁响应”材料对磁场有响应。磁响应固体支持物的示例包括磁响应材料或由磁响应材料构成。磁响应材料的示例包括顺磁材料、铁磁材料、亚铁磁材料和变磁材料。合适的
顺磁材料的示例包括铁、镍和钴，以及金属氧化物，诸如fe3o4、bafe
12o19
、coo、nio、mn2o3、cr2o3和comnp。一个可商购获得的示例包括得自thermofisher scientific的dynabeads
tm
m-280链霉抗生物素蛋白(被链霉抗生物素蛋白涂覆的超顺磁珠)。在一些示例中，磁响应材料嵌入聚合物珠粒的外壳中。在其他示例中，磁响应材料呈珠粒形式并且涂覆有钝化材料，诸如氧化硅或亚硝酸硅。
[0078]
固体支持物12的任何示例可具有实心珠粒、多孔珠粒或空心珠粒的形式。
[0079]
虽然图1a或图1b中未示出，但是固体支持物12被功能化为具有生物素-链霉抗生物素蛋白结合对或脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白结合对的一个成员。“结合对”通常是指能够彼此附接的两种试剂(例如，材料、分子、部分)。在本文所公开的一些示例中，结合对包含链霉抗生物素蛋白和生物素。在本文所公开的其他示例中，结合对包含链霉抗生物素蛋白和脱硫生物素。结合对的链霉抗生物素蛋白可定位在固体支持物12的表面，并且结合对的生物素或脱硫生物素(其各自由附图标号20表示)可附接到dna文库片段14、14'、14”。
[0080]
在一些示例中，固体支持物12上的链霉抗生物素蛋白可以是多功能的，因为其可以i)与附接到dna文库片段14、14'、14”的生物素或脱硫生物素20结合，并且ii)与流通池的测序表面上的生物素或脱硫生物素捕获位点结合。在其他示例中，固体支持物12可被功能化为具有两个不同的结合对成员，例如，i)链霉抗生物素蛋白(其可以与附接到dna文库片段14、14'、14”的生物素或脱硫生物素20结合)，以及ii)另一个成员，其可以与流通池的测序表面上的捕获位点结合。
[0081]
固体支持物12的功能化可涉及单独或与另一个结合对成员组合用链霉抗生物素蛋白涂覆固体支持物12。
[0082]
dna文库片段14、14'、14”附接到固体支持物12。每个dna文库片段14、14'、14”包括在3'端和5'端具有接头(例如，18、18'、18”、22、22'、22”)的较长遗传物质片段的一部分(例如，片段16、16'、16”)。可使用任何文库制备技术来制备dna文库片段14、14'、14”，该文库制备技术将较长遗传物质片段片段化并且将所需接头掺入片段的末端。一些合适的文库制备技术参考图1a和图1b进行描述。然而，应当理解，也可使用其他文库制备技术。
[0083]
图1a描绘了包括dna文库片段14、14'的复合物10a的示例。这些dna文库片段14、14'是测序就绪的，因为它们包括片段16、16'(来自较大核酸样品)以及片段16、16'的相对末端的接头18、22或18'、22'。片段16、16'的邻近性在固体支持物12上得以保存。
[0084]
本文描述了用于制备复合物10a的一种示例方法，但应当理解，可使用其他方法，只要测序就绪核酸片段14、14'通过生物素-链霉抗生物素蛋白结合对或脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白结合对附接到固体支持物12即可。
[0085]
在形成图1a中所示的复合物10a的一种示例方法中，接头序列18、18'与生物素或脱硫生物素20结合。在一个示例中，该接头序列18、18'可包括第一测序引物序列(例如，读段1测序引物序列)和第一序列(p5')，该第一序列与流通池(如图3a、图3b和图3c中所示)上的扩增引物中的一个扩增引物(例如，p5)的至少一部分互补。接头序列18、18'还可包括索引或条形码序列。接头序列18、18'与生物素或脱硫生物素20结合，使得其继而可以与固体支持物12的表面结合，该固体支持物包含生物素-链霉抗生物素蛋白结合对或脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白结合对的链霉抗生物素蛋白。
[0086]
在该示例中，转座体复合物(未示出)也可在文库制备方法开始时与固体支持物12
结合。在将转座体复合物装载在固体支持物12上之前，可将部分y-接头与转座酶(例如，两个tn5分子)混合以形成转座体复合物。部分y-接头可包括彼此杂交的两个镶嵌末端序列(或其他转座子末端序列)。镶嵌末端序列中的一个镶嵌末端序列被称为游离的镶嵌末端序列，因为它具有两个自由端，例如能够附接到接头18、18'的一个自由端，以及能够在片段标签化期间附接到片段化dna链16、16'的另一个自由端。该镶嵌末端序列是转移链的一部分。镶嵌末端序列中的另一个镶嵌末端序列可附接到另一个接头(例如，22、22')，该接头包括第二测序引物序列(例如，读段2测序引物序列)、与流通池上的扩增引物中的另一个扩增引物(p7)的至少一部分相同的第二序列(p7)。在扩增期间，相同序列使得能够形成与流通池上的扩增引物中的另一个扩增引物(p7)的至少一部分互补的拷贝。接头序列22、22'在片段标签化期间不附接到片段化的dna链16、16'，因此是非转移链的一部分。
[0087]
将转座体复合物装载在固体支持物12上可涉及将转座体复合物与固体支持物12混合，并将该混合物暴露于用于将游离的镶嵌末端的自由端中的一个连接到接头序列18、18'的3'端的合适条件。各个转座体复合物可附接到固体支持物12上的接头序列18、18'中的每一个。
[0088]
在形成复合物10a的该示例方法中，然后可执行片段标签化过程。可将包括较长核酸样品(例如，dna)的流体(例如，片段标签化缓冲液)添加到具有与其结合的接头序列18、18'和转座体复合物的固体支持物12中。当样品接触转座体复合物时，较长核酸样品被片段标签化。将较长核酸样品片段化成片段16、16'，并且每个片段在其5'端被加标到部分y-接头上(例如，通过连接游离的镶嵌(或其他转座子)末端序列的另一个自由端)。较长核酸样品的连续片段标签化在转座体复合物之间产生多个桥连分子。桥连分子包裹在固体支持物12周围。转座体复合物作为桥连分子保持较长核酸样品的邻近性。
[0089]
然后可经由十二烷基硫酸钠(sds)处理或加热或蛋白酶k消化来去除转座酶。转座酶的去除留下附接到固体支持物12的片段16、16'。
[0090]
为了完成测序就绪dna文库片段14、14'，进行进一步延伸和连接以确保样品片段16、16'附接到序列22和22'。所得的复合物10a在图1a中示出。
[0091]
每个测序就绪dna文库片段14、14'包括具有附接在任一端的相应接头序列18和22或18'和22'的邻近性保留文库片段16、16'。接头序列18、18'是最初与固体支持物12结合的那些接头序列，并且包括第一测序引物序列以及与流通池引物中的一个互补的第一序列。接头序列18、18'附接到生物素-链霉抗生物素蛋白结合对或脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白结合对的生物素或脱硫生物素。接头序列22、22'来自部分y-接头，并且包括与另一个流通池引物相同的第二序列以及第二测序引物序列。因为每个测序就绪dna文库片段14、14'包括用于扩增(例如，桥式扩增)和测序的合适接头，所以不进行pcr扩增。因此这些片段14、14'是测序就绪的。此外，因为邻近性保留文库片段16、16'来自相同的较长核酸样品，所以原始样品的邻近性得以保留并且文库片段14、14'可适用于连锁长读段应用。
[0092]
图1b示出了另一种复合物10b，其包括固体支持物12以及使用生物素-链霉抗生物素蛋白或脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白结合对附接到固体支持物12的测序就绪dna文库片段14”。在一个示例中，在管中创建无pcr的核苷酸文库，然后将该文库与管中的固体支持物12杂交。在图1b中所示的示例中，将接头18”、22”添加到管中的文库片段16”中，使具有与其附接的生物素或脱硫生物素20的引物与管中的接头18”杂交，然后使测序就绪核酸片段
14”通过生物素-链霉抗生物素蛋白或脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白结合对与固体支持物12结合。在另一个示例中，固体支持物12可具有经由生物素-链霉抗生物素蛋白结合对(例如，支持物12上的链霉抗生物素蛋白以及附接到引物的生物素或脱硫生物素20)与其附接的引物。这些引物与附接到文库片段16、16'的接头18”杂交(并且因此引物和生物素或脱硫生物素20位于片段16、16'的一端处而非另一端处)。在另一个示例中，可使用链置换酶进行延伸。这将产生完全双链的文库(例如，没有叉或y-接头，如图1b中所示)。
[0093]
如所提及的，也可使用其他文库制备技术，只要dna文库片段14、14'、14”经由生物素-链霉抗生物素蛋白或脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白结合对附接到固体支持物12即可。
[0094]
具有双重释放机制的文库制备珠粒
[0095]
在本文所公开的一些示例中，dna文库片段16、16'、16”附接到固体支持物12，并且可利用双重释放机制从固体支持物12释放。双重释放机制包括裂解位点和夹板，其中的每一者将参考图2a至图2c进行更详细地描述。
[0096]
图2a中示出了在片段标签化之前文库制备珠粒11的示例。文库制备珠粒11包含固体支持物12以及附接到固体支持物12的转座体复合物52，转座体复合物52包含i)转座酶54；ii)与转座酶54结合的双链分子56，其中双链分子56包含iia)转移链58，其包含3'转座子末端序列62a、接头序列18、裂解位点64和5'连接末端序列66，其中接头序列18和5'连接末端序列66侧接裂解位点64，以及iib)非转移链60，其包含3'转座子末端序列62b；以及iii)夹板序列68，其与接头序列18的至少一部分和5'连接末端序列66的至少一部分杂交，使得其夹固裂解位点64。
[0097]
固体支持物12可以是本文所述的任何示例。
[0098]
如所提及的，转座体复合物52包含转座酶54。转座酶54可以是本文所述的任何示例。在图2a中所示的示例中，转座体54包含二聚体(例如，tn5的二聚体)，每个单体a、b结合双链分子56。因此，转座体复合物52的该示例包含转座酶54以及分别与转座酶54的单体a、b结合的两个双链分子56。每个双链分子56包含杂交的3'转座子末端序列62a、62b。3'转座子末端序列62a和3'转座子末端序列62b彼此互补，并且仅包含与转座酶54形成复合物所必需的核苷酸序列。因此，单体a、b分别通过其杂交的3'转座子末端序列62a、62b与双链分子56结合。
[0099]
双链分子56的3'转座子末端序列62a构成转移链58的一部分。除了3'转座子末端序列62a之外，转移链58还包含连接到3'转座子末端序列62a的接头序列18、连接到接头序列18的裂解位点64以及连接到裂解位点64的5'连接末端序列66。因此，接头序列18和5'连接末端序列66侧接裂解位点64。
[0100]
接头序列18可以是本文所公开的任何示例。当要在流通池的表面上进行扩增时，接头序列18可包括第一测序引物序列(例如，读段1测序引物序列)、第一序列(p5')(该第一序列与流通池上的扩增引物中的一个扩增引物(例如，p5)的至少一部分互补)以及/或者索引或条形码序列。
[0101]
裂解位点64选自化学可裂解的裂解位点、酶可裂解的裂解位点和可光裂解的裂解位点。
[0102]
在一些示例中，裂解位点64选自化学可裂解的裂解位点和酶可裂解的裂解位点。化学可裂解的裂解位点可包括化学可裂解的核碱基、化学可裂解的修饰核碱基或化学可裂
解的连接基(例如，核碱基之间)。化学可裂解的核碱基、修饰的核碱基或连接基的示例包括邻二醇(例如，可通过高碘酸盐裂解的1,2-二醇)、二硫化物、硅烷、偶氮苯、可光裂解的基团、烯丙基t(具有烯丙基官能团的胸腺嘧啶核苷酸类似物)、烯丙基醚或叠氮基官能醚。酶可裂解的裂解位点可以是酶可裂解的核碱基。酶可裂解的核碱基可易于通过与糖基化酶和核酸内切酶或与核酸外切酶反应而裂解。酶可裂解的核碱基的一个具体示例是脱氧尿嘧啶(du)，其可以被user酶(dna糖基化酶(udg)和dna糖基化酶-裂解酶核酸内切酶viii的混合物)靶向。也可用其他无碱基位点。酶可裂解的核碱基的另一个具体示例是rna，其可以被rna酶靶向。
[0103]
在其他示例中，裂解位点64可以是可光裂解的位点。可光裂解的位点可易于通过暴露于特定波长的光而裂解。可光裂解的位点的示例是具有以下结构的硝基苄基连接基：
[0104][0105]
其在用365nm光照射时裂解。
[0106]
5'连接末端序列66可以是可以附接到固体支持物12的表面的核苷酸序列或结合对成员。在一些示例中，固体支持物12可在表面具有反应性基团，以共价偶联到5'连接末端序列66。此类反应性基团的示例包括羧酸、脂肪伯胺、芳香胺、芳香氯甲基(例如，乙烯基苄基氯)、酰胺、酰肼、醛、羟基、硫醇和环氧基。这些反应性基团可固有地存在于固体支持物12的表面，或者可通过任何合适的官能化技术(例如，化学反应、用含反应性基团的聚合物涂覆固体支持物12等)掺入固体支持物12的表面上。在其他示例中，固体支持物12可被结合对的一个成员涂覆，并且5'连接末端序列66可附接到结合对的另一个成员。
[0107]
夹板序列68是具有与接头序列18的至少一部分互补的部分和与5'连接末端序列66的至少一部分互补的部分的核苷酸序列。夹板序列68的相应部分与接头序列18和5'连接末端序列66的相应部分杂交，使得夹板序列68桥连裂解位点64。夹板序列68的夹固或桥连裂解位点64的部分不附接到裂解位点64。虽然图2a至图2c中未示出，但是夹板68的一些示例可包括与整个5'连接末端序列66互补的部分。在该示例中，夹板68的3'端可通过结合对或共价键附接到固体支持物12。
[0108]
双链分子56的3'转座子末端序列62b构成整个非转移链60。
[0109]
图2b示意性地示出了涉及文库制备珠粒11的片段标签化过程。可将dna样品70与文库制备珠粒11混合。dna样品70可以是dna，或者可以是衍生自rna样品的互补dna(cdna)。
将rna样品转化为cdna样品可使用逆转录来完成，所述逆转录利用逆转录酶。在一些示例中，使用用于逆转录和第二链合成的试剂盒。在这些示例中，可使用得自thermofisher scientific的高容量cdna逆转录试剂盒。在其他示例中，使用用于逆转录和模板转换(用于第二链)的试剂盒。在这些示例中，可使用得自new england biolabs的模板转换rt酶混合物。
[0110]
可将dna样品70掺入载体液体(例如，片段标签化缓冲液)中以产生文库制备流体。可将该文库制备流体与文库制备珠粒11混合。转座体复合物52结合样品dna 70并在dna主链中产生两个切口，这两个切口由图2b中的闪电呈现。这样就产生片段16、16'。在图2b中所示的示例中，切口在任一条链上相隔9个碱基。应当理解，转座体复合物52可以在切口之间产生7、8、9、10、11或12bp的缺口。每个转座体复合物52的两条链中的一条(例如，转移链58)在每个切口位置处连接到每个片段16、16'的5'端。图2c中描绘了转移链58与每个片段16、16'的附接。
[0111]
然后可经由十二烷基硫酸钠(sds)处理或加热或蛋白酶k消化来去除转座酶54(单体a和b两者)。转座酶54的去除留下通过转移链58附接到固体支持物12的片段16、16'。
[0112]
为了完成测序就绪片段14、14'(其在两端包括类似于图1a中所示的示例的接头18、22)的形成，进行进一步延伸和连接以确保样品片段16、16'附接到非转移链60和/或附加接头序列22。在一些情况下，去除非转移链60(例如，经由热量或酶消化)，然后将接头序列22添加(例如，经由延伸连接)到片段16、16'的3'端。在其他情况下，将非转移链60连接到片段16、16'的3'端，然后将接头22添加到现在连接的非转移链60中。
[0113]
当希望从固体支持物12释放测序就绪片段14、14'时，可如本文参考图4进一步所述使用双重释放机制。
[0114]
流通池
[0115]
在一些示例中，将复合物10a、10b或预备的文库制备珠粒11'(图4中所示)引入流通池中以进行扩增和测序。流通池24的示例的顶视图在图3a中示出。如将参考图3b和图3c所讨论的，流通池24的一些示例包括两个测序相对的测序表面。非图案化测序表面30、30'的示例在图3b中示出，而图案化测序表面32、32'的示例在图3c中示出。每个测序表面30、30'或32、32'由基底(在图3a中通常示为26)支持，并且流动通道(在图3a中通常示为28)限定在测序表面30、30'或32、32'之间。在其他示例中，流通池24包括由基底支持的一个测序表面以及附接到基底的盖。在这些示例中，流动通道28限定在测序表面30或32与盖之间。
[0116]
在任何示例中，基底26可以是单层/单种材料。单层基底的示例在图3b中以附图标号26a和26a'示出。合适的单层基底26a、26a'的示例包括：环氧硅氧烷、玻璃、改性的或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(诸如得自chemours的)、环烯烃/环烯烃聚合物(cop)(诸如得自zeon的)、聚酰亚胺等)、尼龙(聚酰胺)、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅、熔融的二氧化硅或基于二氧化硅的材料、硅酸铝、硅和改性的硅(例如，硼掺杂的p+硅)、氮化硅(si3n4)、氧化硅(sio2)、五氧化二钽(ta2o5)或其他氧化钽(tao
x
)、氧化铪(hfo2)、碳、金属、无机玻璃等。
[0117]
基底26也可为多层结构。多层基底的示例在图3c中以附图标号26b和26b'示出。多层结构26b、26b'的一些示例包括玻璃或硅，在表面处具有氧化钽或另一种陶瓷氧化物的涂
层。具体参考图3c，多层结构26b、26b'的其他示例包括其上具有图案化树脂36、36'的基础支持物34、34'。多层基底26b、26b'的其他示例可包括绝缘体上硅(soi)基底。
[0118]
在一个示例中，基底26(无论是单层还是多层)可具有在约2mm至约300mm范围内的直径，或者为最大尺寸高达约10英尺(约3米)的矩形片材或面板。在一个示例中，基底26是直径在约200mm至约300mm范围内的晶片。在另一个示例中，基底24是宽度在约0.1mm至约10mm范围内的管芯。虽然已经提供了示例尺寸，但应当理解，可使用具有任何合适尺寸的基底26。又如，可使用作为矩形支持物的面板，该面板具有比300mm圆形晶片更大的表面积。
[0119]
在图3a中所示的示例中，流通池24包括流动通道28。虽然示出了若干流动通道28，但应当理解，流通池24中可包括任何数量的通道28(例如，单个通道28、四个通道28等)。在本文所公开的一些示例中，每个流动通道28是由两个附接的基底(例如，26a和26a'或26b和26b')限定在两个测序表面(例如，30和30'或32和32')之间的区域。在本文所公开的其他示例中，每个流动通道28是限定在一个测序表面(例如，30或32)与盖之间的区域。可以将本文所述的流体引入流动通道28中和从该流动通道中去除。每个流动通道28可与流通池24中的每个其他流动通道28分离，使得引入任何特定流动通道28中的流体不流到任何相邻的流动通道28中。
[0120]
可使用部分地取决于基底26的材料的任何合适的技术将流动通道28的一部分限定在基底26中。在一个示例中，将流动通道28的一部分蚀刻到玻璃基底26中。在另一个示例中，可使用光刻、纳米压印光刻等将流动通道28的一部分图案化成多层基底28b、28b'的树脂36、36'。在又一个示例中，可将单独材料(例如，图3b和图3c中的材料50)施加到基底26，使得单独材料限定流动通道28的壁的至少一部分。
[0121]
在一个示例中，流动通道28具有直线构型。流动通道28的长度和宽度可分别小于基底26的长度和宽度，使得基底表面的围绕流动通道28的部分可用于附接到另一基底26。在一些情况下，每个流动通道28的宽度可以为至少约1mm、至少约2.5mm、至少约5mm、至少约7mm、至少约10mm或更大。在一些情况下，每个流动通道28的长度可以为至少约10mm、至少约25mm、至少约50mm、至少约100mm或更大。每个流动通道28的宽度和/或长度可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。在另一个示例中，流动通道28是正方形(例如，10mm
×
10mm)。
[0122]
例如，当使用微接触、气溶胶或喷墨印刷来沉积限定流动通道壁的单独材料时，每个流动通道28的深度可以小至几个单层厚。对于其他示例，每个流动通道28的深度可以为约1μm、约10μm、约50μm、约100μm或更大。在一个示例中，深度可在约10μm至约100μm的范围内。在另一个示例中，深度为约5μm或更小。应当理解，每个流动通道28的深度大于、小于上文指定的值或介于它们之间。例如，当使用图案化的测序表面32、32'时，流动通道28的深度也可沿着流通池24的长度和宽度变化。
[0123]
图3b示出了包括非图案化的相对测序表面30、30'的流通池24的横剖视图。在一个示例中，这些表面30、30'中的每个表面可在基底26a、26a'上制备，然后基底26a、26a'可彼此附接以形成流通池24的示例。可使用任何合适的粘结材料50诸如粘合剂、有助于粘结的辐射吸收材料等将基底26a、26b粘结在一起。
[0124]
在图3b中所示的示例中，流动通道28的一部分限定在单层基底26a、26a'中的每一个中。例如，每个基底26a、26a'可具有限定于其中的凹面区域38、38'，可在其中引入测序表
面30、30'的部件。应当理解，凹面区域38、38'内未被测序表面30、30'的部件占据的任何空间可被认为是流动通道28的一部分。
[0125]
测序表面30、30'包括聚合物水凝胶40、40'、附接到聚合物水凝胶40、40'的扩增引物42、42'和化学捕获位点44、44'。
[0126]
聚合物水凝胶40、40'的示例包括丙烯酰胺共聚物，诸如聚(n-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(pazam)。pazam和丙烯酰胺共聚物的一些其他形式由以下结构(i)表示：
[0127][0128]
其中：
[0129]
ra选自叠氮基、任选地取代的氨基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔烃、卤素、任选地取代的腙、任选地取代的肼、羧基、羟基、任选地取代的四唑、任选地取代的四嗪、腈氧化物、硝酮、硫酸盐和硫醇；
[0130]
rb为h或任选地取代的烷基；
[0131]
rc、rd和re各自独立地选自h和任选地取代的烷基；
[0132]-(ch2)
p-中的每一者可任选地被取代；
[0133]
p为在1至50范围内的整数；
[0134]
n为在1至50,000范围内的整数；以及
[0135]
m为在1至100,000范围内的整数。
[0136]
本领域的普通技术人员将认识到，结构(i)中反复出现的“n”和“m”特征的布置是代表性的，并且单体亚单元可以任何顺序存在于聚合物结构中(例如，无规、嵌段、图案化或它们的组合)。
[0137]
pazam和丙烯酰胺共聚物的其他形式的分子量可在约5kda至约1500kda或者约10kda至约1000kda的范围内，或者在一个具体示例中可为约312kda。
[0138]
在一些示例中，pazam和丙烯酰胺共聚物的其他形式为直链聚合物。在一些其他示例中，pazam和丙烯酰胺共聚物的其他形式为轻度交联聚合物。
[0139]
在其他示例中，聚合物水凝胶40、40'可为结构(i)的变型。在一个示例中，丙烯酰
胺单元可用n,n-二甲基丙烯酰胺替换。在该示例中，结构(i)中的丙烯酰胺单元可用替换，其中rd、re和rf各自为h或c1-c6烷基，并且rg和rh各自为c1-c6烷基(而不是h，如丙烯酰胺的情况)。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。在另一个示例中，除了丙烯酰胺单元之外，还可使用n,n-二甲基丙烯酰胺。在该示例中，除了反复出现的“n”和“m”特征之外，结构(i)还可包括其中rd、re和rf各自为h或c1-c6烷基，并且rg和rh各自为c1-c6烷基。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。
[0140]
作为聚合物水凝胶40、40'的另一个示例，结构(i)中重复出现的“n”特征可用包括具有结构(ii)的杂环叠氮基基团的单体替换：
[0141]
[0142]
其中r1为h或c1-c6烷基；r2为h或c1-c6烷基；l为包括直链的连接基，其具有2至20个选自碳、氧和氮的原子以及链中的碳和任何氮原子上的10个任选取代基；e为直链，其包括1至4个选自碳、氧和氮的原子以及链中的碳和任何氮原子上的任选取代基；a为具有附接到n的h或c1-c4烷基的n取代的酰胺；并且z为含氮杂环。z的示例包括作为单个环状结构或稠合结构存在的5至10个环成员。z的一些具体示例包括吡咯烷基、吡啶基或嘧啶基。
[0143]
又如，聚合物水凝胶40、40'可包括结构(iii)和(iv)中的每一者的重复出现的单元：
[0144][0145]
其中r
1a
、r
2a
、r
1b
和r
2b
中的每一者独立地选自氢、任选地取代的烷基或任选地取代的苯基；r
3a
和r
3b
中的每一者独立地选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的苯基或任选地取代的c7-c14芳烷基；并且每个l1和l2独立地选自任选地取代的亚烷基连接基或任选地取代的杂亚烷基连接基。
[0146]
应当理解，其他分子可用于形成聚合物水凝胶40、40'，只要它们被官能化以将寡核苷酸引物42、42'与其接枝即可。合适的聚合物层的其他示例包括具有胶态结构的那些，诸如琼脂糖；或具有聚合物网状结构的那些，诸如明胶；或具有交联聚合物结构的那些，诸如聚丙烯酰胺聚合物和共聚物、不含硅烷的丙烯酰胺(sfa)或sfa的叠氮化版本。合适的聚丙烯酰胺聚合物的示例可由丙烯酰胺和丙烯酸或含有乙烯基基团的丙烯酸合成，或由形成[2+2]光环加成反应的单体合成。合适的聚合物水凝胶42的另外其他示例包括丙烯酰胺和丙烯酸酯的混合共聚物。含有丙烯酸类单体(例如，丙烯酰胺、丙烯酸酯等)的多种聚合物架构可用于本文所公开的示例中，诸如支链聚合物，包括星型聚合物、星形或星型嵌段聚合物、树枝状体等。例如，单体(例如，丙烯酰胺等)可以无规或嵌段方式掺入到星形聚合物的支链(臂)中。
[0147]
为了将聚合物水凝胶40、40'引入到凹面区域38、38'中，可生成聚合物水凝胶40、40'的混合物，然后将其施加到相应的基底26a、26a'(具有限定于其中的凹面区域38、38')。在一个示例中，聚合物水凝胶40、40'可存在于混合物(例如，与水的混合物或与乙醇和水的混合物)中。然后可使用旋涂、浸渍或浸涂、正压或负压下的材料流或另一种合适的技术将混合物施加到相应的基底表面(包括在凹面区域38、38'中)。这些类型的技术将聚合物水凝胶40、40'毯覆式地沉积在相应的基底26a、26a'上(例如，在凹面区域38、38'中和在与其相邻的间隙区域46、46'上)。可使用其他选择性沉积技术(例如，涉及掩模、受控印刷技术等)
来将聚合物水凝胶特定地沉积在凹面区域38、38'中而不是沉积在间隙区域46、46'上。
[0148]
在一些示例中，可活化基底表面(包括凹面区域38、38')，然后可向其施加混合物(包括聚合物水凝胶40、40')。在一个示例中，可使用气相沉积、旋涂或其他沉积方法将硅烷或硅烷衍生物(例如，降冰片烯硅烷)沉积在基底表面上。在另一个示例中，可将基底表面暴露于等离子体灰化，以产生可以附着到聚合物水凝胶40、40'的表面活化剂(例如，-oh基团)。
[0149]
取决于聚合物水凝胶40、40'的化学性质，所施加的混合物可暴露于固化过程。在一个示例中，固化可在室温(例如，约18℃至约25℃)至约95℃范围内的温度下进行约1毫秒至约几天范围内的时间。
[0150]
然后可进行抛光，以便从凹面区域38、38'的周界处的间隙区域46、46'去除聚合物水凝胶40、40'，同时使在表面上的聚合物水凝胶40、40'在凹面区域38、38'中至少基本上完整。
[0151]
测序表面30、30'还包括附接到聚合物水凝胶40、40'的扩增引物42、42'。
[0152]
可执行接枝过程，以将扩增引物42、42'接枝到凹面区域38、38'中的聚合物水凝胶40、40'。在一个示例中，可以通过引物42、42'的5'端处或附近的单点共价附接将扩增引物42、42'固定到聚合物水凝胶40、40'。该附接使i)引物42、42'的接头特异性部分自由地退火至其同源测序就绪核酸片段，并且ii)3'羟基基团自由用于引物延伸。任何合适的共价附接均可用于此目的。可使用的封端引物的示例包括炔烃封端引物(例如，其可附接到聚合物水凝胶40、40'的叠氮化物表面部分)或叠氮化物封端引物(例如，其可附接到聚合物水凝胶40、40'的炔烃表面部分)。
[0153]
合适的引物42、42'的具体示例包括在illumina inc.销售的商业流通池的表面上使用的p5和p7引物，以在hiseq
tm
、hiseqx
tm
、miseq
tm
、miseqdx
tm
、miniseq
tm
、nextseq
tm
、nextseqdx
tm
、novaseq
tm
、genome analyzer
tm
、iseq
tm
和其他仪器平台上进行测序。p5引物和p7引物均可接枝到聚合物水凝胶40、40'中的每个聚合物水凝胶。
[0154]
在一个示例中，接枝可涉及流动通过沉积(例如，使用暂时性结合的盖)、泡涂、喷涂、搅打分配或通过将引物42、42'附接到聚合物水凝胶40、40'的另一种合适方法。这些示例技术中的每一种可利用引物溶液或混合物，该引物溶液或混合物可包含引物42、42'、水、缓冲液和催化剂。采用接枝方法中的任一种方法，引物42、42'与凹面区域38、38'中的聚合物水凝胶40、40'的反应性基团反应，并且对周围基底26a、26a'不具有亲和力。因此，引物42、42'选择性地接枝到聚合物水凝胶40、40'。
[0155]
在图3b中所示的示例中，化学捕获位点44、44'包括附接到或施加到聚合物水凝胶40、40'的至少一部分上的化学捕获剂。可使用本文所公开的化学捕获剂的任何示例。在一些示例中，化学捕获剂可以是生物素，其可以有助于将链霉抗生物素蛋白涂覆的复合物10a、10b附接到流通池测序表面30、30'或32、32'。在其他示例中，化学捕获剂可以是除生物素-链霉抗生物素蛋白结合对之外的结合对的另一个成员。在这些其他示例中，复合物10a、10b包含两个不同的结合对成员，例如，i)链霉抗生物素蛋白(其可以与附接到dna文库片段14、14'、14”的生物素20结合)，以及ii)另一个成员，其可以与流通池的测序表面上的捕获位点44、44'的化学捕获剂结合。在这些其他示例中，化学捕获剂可以是结合对的非生物素成员，其中结合对的另一个成员除了附接到链霉抗生物素蛋白外还附接到固体支持物12。
[0156]
在一些示例中，聚合物水凝胶40、40'的游离官能团(例如，未附接到引物42、42'的那些)可用化学捕获剂官能化，使得在聚合物水凝胶40、40'的整个表面上形成若干化学捕获位点44、44'。在一个示例中，可使用点击化学将炔烃-peg-生物素连接基或不含炔烃-生物素的叠氮化物基团共价附接到聚合物水凝胶40、40'上的游离叠氮化物。在另一个示例中，与扩增引物42、42'互补的引物可具有与其附接的化学捕获剂(例如，结合对的生物素或另一个成员)。这些互补引物可与扩增引物42、42'中的一些扩增引物杂交以形成化学捕获位点44、44'。
[0157]
在另一个示例中，可使用微接触印刷、气溶胶印刷等将化学捕获剂沉积在所需位置中，以形成化学捕获位点44、44'。在又一个示例中，掩模(例如，光致抗蚀剂)可用于限定将沉积化学捕获剂的空间/位置，并因此限定将形成化学捕获位点44、44'的空间/位置。然后可沉积化学捕获剂，并且去除掩模(例如，通过剥离、溶解或另一种合适的技术)。在该示例中，化学捕获位点44、44'可包括单层或薄层化学捕获剂。
[0158]
图3c示出了包括图案化的相对测序表面32、32'的流通池24的横剖视图。在一个示例中，这些表面32、32'中的每个表面可在基底26b、26b'上制备，然后基底26b、26b'可彼此附接(例如，经由材料50)以形成流通池24的示例。
[0159]
在图3c中所示的示例中，流通池24包括多层基底26b、26b'，其中的每一个包含支持物34、34'以及定位在支持物34、34'上的图案化材料36、36'。图案化材料36、36'限定由间隙区域46、46'间隔的凹入部48、48'。
[0160]
在图3c中所示的示例中，图案化材料36、36'分别定位在支持物34、34'上。应当理解，可选择性地沉积或者可沉积并图案化以形成凹入部48、48'和间隙区域46、46'的任何材料可用于图案化材料36、36'。
[0161]
例如，可经由气相沉积、气溶胶印刷或喷墨印刷将无机氧化物选择性地施加到支持物34、34'。合适的无机氧化物的示例包括氧化钽(例如ta2o5)、氧化铝(例如al2o3)、氧化硅(例如sio2)、氧化铪(例如hfo2)等。
[0162]
又如，可将树脂施加到支持物34、34'，然后图案化。合适的沉积技术包括化学气相沉积、浸涂、泡涂、旋涂、喷涂、搅打分配、超声喷涂、刮涂刀涂覆、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷等。合适的图案化技术包括光刻法、纳米压印光刻(nil)、压印技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术、印刷技术等。合适的树脂的一些示例包括基于多面体低聚倍半硅氧烷树脂的树脂、非多面体低聚倍半硅氧烷环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂(例如，开环环氧化物)、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂、无定形含氟聚合物树脂(例如，得自bellex的)以及它们的组合。
[0163]
如本文所用，术语“多面体低聚倍半硅氧烷”(以商品名从hybrid plastics商购获得)是指作为二氧化硅(sio2)与有机硅(r2sio)之间的杂交中间体(例如，rsio
1.5
)的化学组合物。多面体低聚倍半硅氧烷的示例可以是如kehagias等人在microelectronic engineering 86(2009)第776-778页中所述的多面体低聚倍半硅氧烷，该文献全文以引用方式并入。在一个示例中，组合物为具有化学式[rsio
3/2
]n的有机硅化合物，其中r基团可以是相同或不同的。多面体低聚倍半硅氧烷的示例r基团包括环氧基、叠氮化物/叠氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四嗪、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯，或另外例如烷基、芳基、烷氧基和/或卤代烷基基团。本文所公开的树脂组合物可包括一个或多个不
同的笼或芯结构作为单体单元。平均笼含量可在合成期间加以调节，并且/或者通过纯化方法控制，并且单体单元的笼尺寸分布可用于本文所公开的示例中。
[0164]
如图3c中所示，图案化材料36、36'包括分别限定于其中的凹入部48、48'以及将相邻凹入部48、48'分开的间隙区域46、46'。可设想凹入部48、48'的许多不同布局，包括规则的、重复的和非规则的图案。在一个示例中，凹入部48、48'设置在六边形网格中，以便紧密堆积和改善密度。其他布局可包括例如直线(矩形)布局、三角形布局等。在一些示例中，布局或图案可以为呈行和列形式的凹入部48、48'的x-y格式。在一些其他示例中，布局或图案可以为凹入部48、48'和/或间隙区域46、46'的重复布置。在另外的其他示例中，布局或图案可以是凹入部48、48'和/或间隙区域46、46'的随机布置。图案可包括条、漩涡、线、三角形、矩形、圆形、弧形、格纹、格子、对角线、箭头、正方形和/或交叉影线。
[0165]
凹入部48、48'的布局或图案可相对于限定区域中的凹入部48、48'的密度(例如，凹入部48、48'的数量)来表征。例如，凹入部48、48'可以大约2百万个/mm2的密度存在。可将密度调整为不同的密度，包括例如约100个/mm2、约1,000个/mm2、约0.1百万个/mm2、约1百万个/mm2、约2百万个/mm2、约5百万个/mm2、约1千万个/mm2、约5千万个/mm2或更大或更小的密度。还应当理解，图案化材料36、36'中的凹入部48、48'的密度可以介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间。例如，高密度阵列可被表征为具有间隔小于约100nm的凹入部48、48'，中密度阵列可被表征为具有间隔约400nm至约1μm的凹入部48、48'，并且低密度阵列可被表征为具有间隔大于约1μm的凹入部48、48'。虽然已提供示例密度，但应当理解，可使用任何合适的密度。凹入部48、48'的密度可部分地取决于凹入部48、48'的深度。在一些情况下，可能期望凹入部48、48'之间的间距甚至大于本文所列的示例。
[0166]
凹入部48、48'的布局或图案也可根据或另选地根据从凹入部48、48'的中心到相邻凹入部48、48'的中心的平均节距或间距(中心到中心间距)或从一个凹入部48、48'的边缘到相邻凹入部48、48'的边缘的平均节距或间距(边缘到边缘间距)来表征。图案可以是规则的，使得围绕平均节距的变异系数较小，或者图案可以是非规则的，在这种情况下变异系数可以相对较大。在任一种情况下，平均节距可为例如约50nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或更大或更小。凹入部48、48'的特定图案的平均节距可以介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间。在一个示例中，凹入部48、48'具有约1.5μm的节距(中心到中心间距)。虽然已经提供了示例平均节距值，但应当理解，可使用其他平均节距值。
[0167]
每个凹入部48、48'的尺寸可通过其体积、开口面积、深度和/或直径来表征。
[0168]
每个凹入部48、48'可具有能够限制引入流通池24中的至少一些流体的任何体积。可以选择最小或最大体积，例如以适应流通池24下游使用所期望的通量(例如复用度)、分辨率、核苷酸或分析物反应性。例如，体积可为至少约1
×
10-3
μm3、至少约1
×
10-2
μm3、至少约0.1μm3、至少约1μm3、至少约10μm3、至少约100μm3或更大。另选地或除此之外，体积可为至多约1
×
104μm3、至多约1
×
103μm3、至多约100μm3、至多约10μm3、至多约1μm3、至多约0.1μm3或更小。
[0169]
每个凹入部开口所占据的面积可基于与上文针对体积所述的标准类似的标准来选择。例如，每个凹入部开口的面积可为至少约1
×
10-3
μm2、至少约1
×
10-2
μm2、至少约0.1μm2、至少约1μm2、至少约10μm2、至少约100μm2或更大。另选地或除此之外，面积可为至多约1
×
103μm2、至多约100μm2、至多约10μm2、至多约1μm2、至多约0.1μm2、至多约1
×
10-2
μm2或更小。每个凹入部开口所占据的面积可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。
[0170]
每个凹入部48、48'的深度可大到足以容纳一部分聚合物水凝胶40、40'。在一个示例中，深度可以为至少约0.1μm、至少约0.5μm、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。另选地或除此之外，深度可以为至多约1
×
103μm、至多约100μm、至多约10μm或更小。在一些示例中，深度为约0.4μm。每个凹入部48、48'的深度可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。
[0171]
在一些情况下，每个凹入部48、48'的直径或长度和宽度可以为至少约50nm、至少约0.1μm、至少约0.5μm、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。另选地或除此之外，直径或长度和宽度可以为至多约1
×
103μm、至多约100μm、至多约10μm、至多约1μm、至多约0.5μm、至多约0.1μm或更小(例如，约50nm)。在一些示例中，直径或长度和宽度为约0.4μm。每个凹入部48、48'的直径或长度和宽度可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。
[0172]
在该示例中，可将测序表面32、32'的至少一些部件引入凹入部48、48'中。应当理解，凹入部48、48'内未被测序表面32、32'的部件占据的任何空间可被认为是流动通道28的一部分。
[0173]
在图3c中所示的示例中，聚合物水凝胶40、40'定位在凹入部48、48'中的每一个内。聚合物水凝胶40、40'可如参考图3b所述那样施加，使得聚合物水凝胶40、40'存在于凹入部48、48'中而不存在于周围的间隙区域46、46'上。
[0174]
在图3c中所示的示例中，可将引物42、42'接枝到凹入部48、48'中的每一个内的聚合物水凝胶40、40'。引物42、42'可参考图3b所述那样施加，因此将接枝到聚合物水凝胶40、40'而不接枝到周围的间隙区域46、46'。
[0175]
在图3c中所示的示例中，化学捕获位点44、44'是施加到间隙区域46、46'中的至少一些上的化学捕获剂。例如，可使用微接触印刷、气溶胶印刷等将化学捕获剂沉积在间隙区域46、46'的至少一些间隙区域上，以形成化学捕获位点44、44'。在又一个示例中，掩模(例如，光致抗蚀剂)可用于限定将沉积化学捕获剂的空间/位置，并因此限定将形成化学捕获位点44、44'的空间/位置。然后可沉积化学捕获剂，并且去除掩模(例如，通过剥离、溶解或另一种合适的技术)。
[0176]
在其他示例中，化学捕获位点44、44'是附接到聚合物水凝胶40、40'的游离官能团(例如，未附接到引物42、42'的那些官能团)的化学捕获剂。在其他示例中，化学捕获位点44、44'是附接到与扩增引物42、42'中的一些杂交的引物的化学捕获剂。在这些示例中，化学捕获位点44、44'将存在于凹入部48、48'中而不在间隙区域46、46'上。
[0177]
本文所公开的化学捕获剂的任何示例可用于图3c中所示的示例中。化学捕获剂可以是结合对的生物素或另一个成员，这部分地取决于固体支持物12被官能化的方式。
[0178]
如图3b和图3c中所示，基底26a和26a'或26b和26b'彼此附接，使得测序表面30和30'或32和32'面向彼此，流动通道28限定在它们之间。
[0179]
基底26a和26a'或26b和26b'可在一些或所有间隙区域46、46'处彼此粘结。在基底26a和26a'或26b和26b'之间形成的粘结可以是化学粘结或机械粘结(例如，使用紧固件等)。
[0180]
可使用任何合适的技术诸如激光粘结、扩散粘结、阳极粘结、共晶粘结、等离子体
活化粘结、玻璃料粘结或本领域已知的其他方法将基底26a和26a'或26b和26b'粘结在一起。在一个示例中，间隔层(例如，材料50)可用于粘结基底26a和26a'或26b和26b'。间隔层可以是将基底26a和26a'或26b和26b'中的至少一些部分密封在一起的任何材料50。在一些示例中，间隔层可以是有助于粘结的辐射吸收材料。
[0181]
虽然未示出，但应当理解，盖子可结合到基底26a'或26b'中的一个，使得流通池具有一个测序表面。
[0182]
涉及具有生物素-链霉抗生物素蛋白键的靶材料的方法和试剂盒
[0183]
利用裂解组合物的第一示例的方法的示例通常包括将文库片段14、14'、14”引入流通池24中，其中文库片段14、14'、14”附接到链霉抗生物素蛋白涂覆的固体支持物12；将生物素-链霉抗生物素蛋白裂解组合物引入到流通池中24，该生物素-链霉抗生物素蛋白裂解组合物包含约10体积％至约50体积％的甲酰胺试剂和余量的盐缓冲液；以及使生物素-链霉抗生物素蛋白裂解组合物在约60℃至约70℃范围内的温度下在流通池中温育，从而致使文库片段14、14'、14”中的至少一些文库片段从固体支持物12释放并且接种到流通池24的表面上的扩增引物42、42'上。
[0184]
在执行该方法之前，可制备文库片段14、14'、14”并将其附接到固体支持物12。在一个示例中，可使用核酸样品和其中包括多个固体支持物12的文库制备流体来制备复合物10a或10b。
[0185]
在一些示例中，文库制备流体中的固体支持物12中的每一个可具有例如与其附接的接头(诸如接头18)，如参考图1a所述。可如图1a中所定义进行片段标签化和文库制备以形成复合物10a。核酸样品70、固体支持物12、部分y接头和转座酶可包含在单独的流体中，直到希望形成复合物10a。
[0186]
在其他示例中，文库制备流体中的固体支持物12中的每一个可具有例如与其附接的寡核苷酸。在一些示例中，无pcr的核苷酸文库制备可与固体支持物12分开进行，然后制备的文库片段可以与经由生物素20附接在固体支持物12的表面处的寡核苷酸(引物)杂交，其中的一个示例如参考图1b所述。可使用文库制备的其他示例(例如，包括pcr)，只要片段在经由生物素20结合在固体支持物12上的寡核苷酸杂交之前变性为单链片段即可。
[0187]
可将附接到固体支持物12的文库片段14、14'、14”(在该示例中，为复合物10a、10b)添加到流体中。流体可以是任何水性缓冲溶液(例如，弱酸及其盐(共轭碱)中的一种或弱碱及其盐(共轭酸)中的一种)。可调整水性缓冲溶液中的盐浓度，使得复合物10a、10b可以流到期望的测序表面。固体支持物12与流体之间的密度差异越大，复合物10a、10b的沉降时间越快。例如，流体可以是tris-hcl缓冲液或0.5x盐水柠檬酸钠(ssc)缓冲液。
[0188]
然后可将含有复合物10a、10b的流体引入流通池24中。一旦引入到流通池24中，复合物10a、10b就可以附接到捕获位点44、44'，因为复合物10a、10b和捕获位点44、44'各自包括结合对的成员。在一些示例中，结合对是生物素-链霉抗生物素蛋白。捕获位点44和/或44'固定复合物10a、10b中的至少一些。
[0189]
应当理解，流体中的一些复合物10a、10b可能不会被捕获，并且这些复合物10a、10b将在进一步处理之前从流通池24中去除。在从流通池24中去除流体和任何未固定的复合物10a、10b之前，可允许经过预先确定的时间。在一个示例中，预先确定的时间可在约5分钟至约30分钟的范围内，以便获得期望数量的固定的复合物10a、10b。也可使用更长的温育
时间。
[0190]
该示例方法然后包括从流通池24中洗去流体和未捕获的复合物10a、10b。洗涤可涉及将洗涤流体引入流通池24中。该流动可将尚未沉降并固定在测序表面30、30'或32、32'处的任何复合物10a、10b(或其他靶材料)通过流通池24的出口推出。复合物10a、10b(或其他靶材料)与测序表面30、30'或32、32'的捕获位点44、44'之间的固定机制(例如，结合对、杂交、共价键合等)可防止任何沉降和固定的复合物10a、10b(或其他靶材料)成为出口流的一部分。
[0191]
该方法涉及将裂解组合物的第一示例引入流通池24中。可使用本文所公开的裂解组合物的第一示例的任何示例。
[0192]
使裂解组合物的第一示例在约60℃至约70℃范围内的温度下在流通池24中温育。在一个示例中，温度为约65℃。在一个示例中，使裂解组合物的第一示例在流通池24中温育约2分钟至约5分钟范围内的时间。在一个示例中，时间为约5分钟。
[0193]
在温育期间，裂解组合物的第一示例有效地破坏将文库片段14、14'、14”保持到固体支持物12上的生物素-链霉抗生物素蛋白键。因此，裂解组合物的第一示例致使文库片段14、14'、14”中的至少一些文库片段从固体支持物12释放。在温育温度下，释放的文库片段14、14'、14”也能够接种到流通池24的测序表面30、30'或32、32'上的扩增引物42、42'上。因此，文库片段14、14'、14”释放和接种可在单种试剂中完成。
[0194]
流通池24的相应测序表面30、30'或32、32'的引物42、42'可以接种释放的片段14、14'或14”。通过片段14、14'或14”的接头18或22的第一序列或第二序列与相应测序表面30、30'或32、32'的引物42、42'中的互补引物之间的杂交来完成接种。可在裂解组合物温育温度下进行接种。
[0195]
14、14'或14”接种在流通池24内的位置部分地取决于引物42、42'的附接方式。在具有非图案化测序表面30、30'的流通池24的示例中，释放的测序就绪核酸片段14、14'或14”将接种在凹面区域38、38'中的聚合物水凝胶40、40'上。在具有图案化测序表面32、32'的流通池24的示例中，释放的测序就绪核酸片段14、14'或14”将接种在凹入部48、48'中的每一个内的聚合物水凝胶40、40'上。
[0196]
当还使用生物素-链霉抗生物素蛋白结合对将复合物10a、10b捕获到捕获位点44、44'时，裂解组合物的第一示例还可以从捕获位点44、44'释放固体支持物12。
[0197]
因此，在该方法的一些示例中，链霉抗生物素蛋白涂覆的固体支持物12中的至少一些与流通池24的表面上的生物素捕获位点44、44'结合；并且使生物素-链霉抗生物素蛋白裂解组合物(裂解组合物的第一示例)在流通池24中温育还致使所结合的链霉抗生物素蛋白涂覆的固体支持物12中的至少一些从生物素捕获位点44、44'释放。在接种片段14、14'、14”之后去除固体支持物12是下游聚类和测序的清洁表面所希望的。
[0198]
当使用不同的结合对将复合物10a、10b捕获到捕获位点44、44'时，可将单独的释放组合物引入流通池24中以从捕获位点44、44'去除固体支持物12。
[0199]
该示例方法然后可包括在温育后从流通池24中冲洗生物素-链霉抗生物素蛋白裂解组合物(裂解组合物的第一示例)，从而去除链霉抗生物素蛋白涂覆的固体支持物12和任何未接种的文库片段14、14'、14”。该流动可将任何释放的固体支持物12和任何未接种的文库片段14、14'、14”通过流通池24的出口推出。片段14、14'、14”与测序表面30、30'或32、32'
的扩增引物42、42'之间的固定机制(例如，杂交)可防止任何片段14、14'、14”称为出口流的一部分。
[0200]
用于执行本文所述的方法的该示例的试剂盒可包括链霉抗生物素蛋白涂覆的固体支持物；接头序列，在所述接头序列的一端处附接有生物素，其中所述生物素将附接到所述链霉抗生物素蛋白涂覆的固体支持物；样品流体，所述样品流体包含将片段化并附接到所述接头序列的基因组序列；以及生物素-链霉抗生物素蛋白裂解组合物(裂解组合物的第一示例)，其包含约10体积％至约50体积％的甲酰胺试剂和余量的盐缓冲液。试剂盒还可包括其他文库制备组分，诸如部分y接头、转座酶等；这些组分中的每一者可包含在单独的流体中，直到希望形成任何示例复合物10a、10b等。试剂盒的一些示例还可包括流通池24。
[0201]
涉及具有脱硫生物素化-链霉抗生物素蛋白键的靶材料的方法和试剂盒
[0202]
利用裂解组合物的第二示例的方法的示例通常包括将脱硫生物素化文库片段引入流通池24中，其中脱硫生物素化文库片段附接到链霉抗生物素蛋白涂覆的固体支持物12；将裂解组合物引入流通池24中，其中该裂解组合物处于约18℃至约30℃范围内的温度下，并且其中该裂解组合物包含游离生物素和盐缓冲液；以及将裂解组合物的温度增加到约60℃至约70℃，从而致使文库片段14、14'、14”中的至少一些文库片段从固体支持物12释放并且接种到流通池24的表面上的扩增引物42、42'上。
[0203]
在执行该示例方法之前，可制备文库片段14、14'、14”并且如本文参考图1a或图1b所述将其附接到固体支持物12。
[0204]
可将附接到固体支持物12的文库片段14、14'、14”(即，该示例中的复合物10a、10b)添加到流体中。流体可以是任何水性缓冲溶液(例如，弱酸及其盐(共轭碱)中的一种或弱碱及其盐(共轭酸)中的一种)。
[0205]
可将含有复合物10a、10b的流体引入流通池24中。一旦引入到流通池24中，复合物10a、10b就可以附接到捕获位点44、44'，因为复合物10a、10b和捕获位点44、44'各自包括结合对的成员。在一些示例中，结合对是脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白。捕获位点44和/或44'固定复合物10a、10b中的至少一些。
[0206]
应当理解，流体中的一些复合物10a、10b可能不会被捕获，并且这些复合物10a、10b将在进一步处理之前从流通池24中去除。在从流通池24中去除流体和任何未固定的复合物10a、10b之前，可允许经过预先确定的时间。在一个示例中，预先确定的时间可在约5分钟至约30分钟的范围内，以便获得期望数量的固定的复合物10a、10b。也可使用更长的温育时间。
[0207]
该示例方法然后包括从流通池24中洗去流体和未捕获的复合物10a、10b。洗涤可涉及将洗涤流体引入流通池24中。该流动可将尚未沉降并固定在测序表面30、30'或32、32'处的任何复合物10a、10b通过流通池24的出口推出。复合物10a、10b(或其他靶材料)与测序表面30、30'或32、32'的捕获位点44、44'之间的固定机制可防止任何沉降和固定的复合物10a、10b成为出口流的一部分。
[0208]
该方法涉及将裂解组合物的第二示例引入流通池24中。可使用本文所公开的裂解组合物的第二示例的任何示例。
[0209]
在约18℃至约30℃范围内的温度下引入裂解组合物的第二示例。在该温度下并且在裂解组合物的第二示例中存在盐的情况下，脱硫生物素被稳定并且其从固体支持物12的
解离被减少或阻止，即使还存在游离生物素也是如此。使引入的裂解组合物沉降，使得流体流动和/或混合至少基本上停止。
[0210]
然后将裂解组合物的温度增加到约60℃至约70℃范围内的温度。在一个示例中，将裂解组合物的温度升高到约65℃。在该温度下并且在存在游离生物素的情况下，脱硫生物素失去稳定并且从固体支持物12解离。这样就释放文库片段14、14'、14”。在这些温度下，释放的文库片段14、14'、14”也能够接种到流通池24的测序表面30、30'或32、32'上的扩增引物42、42'上。因为当释放文库片段14、14'、14”时，流体流动和/或混合不会发生，所以释放的文库片段14、14'、14”能够扩散并接种在流通池表面上释放固体支持物12处或附近。因此，文库片段14、14'、14”释放和扩散依赖性空间接种可在单种试剂中完成。
[0211]
当还使用脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白结合对将复合物10a、10b捕获到捕获位点44、44'时，裂解组合物的第二示例还可以从捕获位点44、44'释放固体支持物12。
[0212]
因此，在该方法的一些示例中，链霉抗生物素蛋白涂覆的固体支持物12中的至少一些与流通池24的表面上的脱硫生物素捕获位点44、44'结合；并且升高已经引入的脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白裂解组合物的温度(裂解组合物的第二示例)致使所结合的链霉抗生物素蛋白涂覆的固体支持物12中的至少一些从脱硫生物素捕获位点44、44'释放。在接种片段14、14'、14”之后去除固体支持物12是下游聚类和测序的清洁表面所希望的。
[0213]
当使用不同的结合对将复合物10a、10b捕获到捕获位点44、44'时，可将单独的释放组合物引入流通池24中以从捕获位点44、44'去除固体支持物12。
[0214]
该示例方法然后可包括在接种后从流通池24中冲洗脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白裂解组合物(裂解组合物的第二示例)，从而去除链霉抗生物素蛋白涂覆的固体支持物12和任何未接种的文库片段14、14'、14”。该流动可将任何释放的固体支持物12和任何未接种的文库片段14、14'、14”通过流通池24的出口推出。片段14、14'、14”与测序表面30、30'或32、32'的扩增引物42、42'之间的固定机制(例如，杂交)可防止任何片段14、14'、14”称为出口流的一部分。
[0215]
用于执行本文所述的方法的该示例的试剂盒可包括链霉抗生物素蛋白涂覆的固体支持物12；具有附接在一端处的脱硫生物素的接头序列，其中所述脱硫生物素将附接到所述链霉抗生物素蛋白涂覆的固体支持物；样品流体，所述样品流体包含将片段化并附接到所述接头序列的基因组序列；以及脱硫生物素-链霉抗生物素蛋白裂解组合物(裂解组合物的第二示例)，其包含游离生物素和盐缓冲液。试剂盒还可包括其他文库制备组分，诸如部分y接头、转座酶等；这些组分中的每一者可包含在单独的流体中，直到希望形成任何示例复合物10a、10b等。试剂盒的一些示例还可包括流通池24。
[0216]
涉及两步释放的方法和试剂盒
[0217]
如所提及的，本文所公开的一些示例利用双重释放机制来从文库制备珠粒11释放测序就绪文库片段14、14'。双重释放机制利用裂解位点64和夹板68。如将参考图4更详细地描述的，可使用合适的裂解剂去除裂解位点64，并且可使用热量来去除夹板68。因为裂解条件涉及两个正交过程(其中一个过程不会引发、影响或以其他方式干扰其他过程)，所以该示例允许受控释放文库片段14、14'。
[0218]
双重机制释放可在流通池24的测序表面30、30'或32、32'上进行，或者可在另一个反应容器(诸如测试管)中进行。
[0219]
该示例方法在图4中示意性地示出，并且通常包括将多个预备的文库制备珠粒11'引入反应容器(未示出)中，每个预备的文库制备珠粒11'包含固体支持物12；附接到固体支持物12的多个桥连分子72、72'，桥连分子72、72'中的每一个包含：双链dna片段16和16'；转移链58、58'，所述转移链58、58'分别附接到双链dna片段的每条链16、16'的5'端处，每条转移链58、58'包含3'转座子末端序列62a、62a'、第一接头序列18、18'、裂解位点64、64'和5'连接末端序列66、66'，其中第一接头序列18、18'和5'连接末端序列66、66'侧接裂解位点64、64'；以及第二接头22、22'，所述第二接头22、22'分别附接到双链dna片段的每条链16、16'的3'端处；以及夹板序列68、68'，其与第一接头序列18、18'的至少一部分和5'连接末端序列66、66'的至少一部分杂交，使得其夹固裂解位点64、64'；将预备的文库制备珠粒11'暴露于裂解剂74以去除裂解位点64、64'，由此多个桥连分子72、72'通过夹板68、68'保持附接到固体支持物12；以及将反应容器加热至夹板68、68'和双链dna片段16、16'的解离温度。
[0220]
图4的左侧示出了预备的文库制备珠粒11'。可使用参考图2a至图2c所述的方法制备预备的文库制备珠粒11'。因此，桥连分子72、72'中的每一个包含测序就绪核酸片段14、14'(其包括片段16、16'、5'端附近的3'转座子末端序列62a、62a'以及相对端处的相应接头18、22或18'、22”)以及裂解位点64、64'、5'连接末端序列66、66'和夹板68、68'。
[0221]
虽然图4中的固体支持物12上示出了单组桥连分子72、72'，但应当理解，单个固体支持物12可包含若干组桥连分子72、72'。
[0222]
为了引发测序就绪核酸片段14、14'从桥连分子72、72'和固体支持物12的释放，该方法首先涉及将预备的文库制备珠粒11'暴露于裂解剂74。所使用的裂解剂74将取决于转移链58、58'的裂解位点64、64'。当裂解位点64、64'是化学裂解位点时，将预备的文库制备珠粒11'暴露于裂解剂74涉及将化学裂解剂引入反应容器中。作为一个示例，可使用高碘酸盐来裂解1,2-二醇化学裂解位点。当裂解位点64、64'是酶裂解位点时，将预备的文库制备珠粒11'暴露于裂解剂涉及将酶裂解剂引入反应容器中。作为示例，可使用user酶来裂解脱氧尿嘧啶核苷酸，并且可使用rna酶来裂解核糖核苷酸。当裂解位点64、64'是可光裂解的裂解位点时，将预备的文库制备珠粒11'暴露于裂解剂74涉及用激活裂解的波长的光照射反应容器。作为示例，可将硝基苄基连接基暴露于365nm紫外光。
[0223]
化学或酶裂解剂或者光暴露的温育可进行足以裂解裂解位点64、64'的时间。温育时间可部分地取决于化学或酶裂解剂的反应性，并且光暴露时间可取决于光源(例如，其强度)。在一个示例中，温育时间在30分钟至约3小时的范围内。在另一个示例中，光暴露可在约30秒至约2分钟的范围内。然后可从反应容器中去除化学或酶裂解剂，或者可停止光照射。然后可洗涤预备的文库制备珠粒11'(例如，用水、缓冲液等)以去除裂解的裂解位点64、64'，并且在一些情况下去除化学或酶裂解剂。
[0224]
如图4的中心所示，在裂解裂解位点64、64'之后，测序就绪片段14、14'保持附接到固体支持物12。夹板68、68'不易受裂解剂74的影响，因此测序就绪片段14、14'保持桥连并附接到固体支持物12。
[0225]
为了完成测序就绪核酸片段14、14'从桥连分子72、72'和固体支持物12的释放，该方法然后涉及将预备的文库制备珠粒11'暴露于热量。所选的温度能够从接头18、18'和5'连接末端序列66、66'解离夹板68、68'，以及解离测序就绪片段14、14'的任何双链部分。在一个示例中，加热温度在约60℃至约70℃的范围内。
[0226]
当测序就绪文库片段14、14'从预备的文库制备珠粒11'的双重机制释放发生在流通池24上时，多个预备的文库制备珠粒11'中的至少一些固定在流通池24的表面上(例如，当引入流通池24中时经由捕获位点44、44')；并且该方法还包括在将预备的文库制备珠粒11'暴露于裂解剂74之前从流通池中去除未固定的文库制备珠粒11'。
[0227]
另外，当测序就绪文库片段14、14'从预备的文库制备珠粒11'的双重机制释放发生在流通池24上时，实现片段14、14'的空间释放。因为最终释放机制是热量，所以流体流动和/或惯性混合不存在或以最低限度存在，因此释放的片段14、14'可以接种到释放片段14、14'的固体支持物12附近的引物42、42'上。
[0228]
测序
[0229]
当片段14、14'、14”释放在流通池24上进行时，片段14、14'、14”可接种到流通池测序表面30、30'或32、32'上的引物42、42'上。当片段14、14'、14”释放在另一个反应容器中进行时，释放的片段14、14'、14”可与固体支持物12分离(具有与其附接的5'连接末端序列66，如图4右侧所示)，并且可将文库片段14、14'、14”引入流通池24中以接种到引物42、42'上。
[0230]
在片段14、14'、14”释放和接种的情况下，流通池24准备好用于下游分析。
[0231]
可以使用簇生成来扩增接种的文库片段14、14'或14”。
[0232]
在簇生成的一个示例中，使用高保真dna聚合酶通过3'延伸从杂交引物42、42'复制片段14、14'或14”。使原始片段14、14'或14”变性，留下固定到测序表面30、30'或32、32'的拷贝。等温桥扩增或一些其他形式的扩增可用于扩增固定的拷贝。例如，复制的模板环回以与相邻的互补引物42、42'杂交，并且聚合酶复制所复制的模板以形成双链桥，使这些双链桥变性以形成两条单链。这两条链环回并与相邻的互补引物42、42'杂交，并且再次延伸以形成两个新的双链环。通过等温变性和扩增循环对每个模板拷贝重复该过程，以产生密集的克隆簇。使双链桥的每个簇变性。在一个示例中，通过特异性碱基裂解去除反义链，留下正向模板多核苷酸链。成簇使得沿测序表面30、30'或32、32'形成若干模板多核苷酸链。成簇的该示例是桥扩增，并且是可执行的扩增的一个示例。应当理解，可使用其他扩增技术，诸如排除扩增(examp)工作流程(illumina inc.)。
[0233]
可引入与模板多核苷酸链上的互补序列杂交的测序引物。该测序引物使得模板多核苷酸链准备好用于测序。可阻断模板和任何流通池结合的引物20(未附接到拷贝)的3'端，以防止干扰测序反应，并且具体地，防止不期望的引发。
[0234]
为了引发测序，可将掺入混合物添加到流通池24中。在一个示例中，掺入混合物包含液体载体、聚合酶和荧光标记的核苷酸。荧光标记的核苷酸可包含3'oh封端基团。当将掺入混合物引入流通池24中时，流体进入流动通道28，并且在一些示例中，进入凹入部48、48'(其中存在模板多核苷酸链)。
[0235]
以模板依赖性方式将荧光标记的核苷酸添加到测序引物(从而使测序物延伸)，使得对添加到测序引物中的核苷酸的顺序和类型的检测可用于确定模板的序列。更具体地，通过相应的聚合酶将核苷酸之一掺入延伸测序引物并与模板多核苷酸链互补的新生链中。换句话讲，在流通池24上的至少一些模板多核苷酸链中，相应的聚合酶通过掺入混合物中的核苷酸之一延伸杂交的测序引物。
[0236]
核苷酸的掺入可以通过成像事件来检测。在成像事件期间，照明系统(未示出)可向相应测序表面30、30'或32、32'提供激发光。
[0237]
在一些示例中，核苷酸可以进一步包括可逆终止属性(例如，3'oh封端基团)，一旦将核苷酸添加到测序引物中，该属性就会终止进一步的引物延伸。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加到测序引物，使得随后的延伸直到递送解封闭剂以去除该部分才发生。因此，对于使用可逆终止的示例，可以在检测发生之后将解封闭剂递送到流通池24。
[0238]
洗涤可在各种流体递送步骤之间发生。然后可以重复sbs循环n次以将测序引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。
[0239]
在一些示例中，可以对正向链进行测序和去除，然后如本文所述对反向链进行构建和测序。
[0240]
虽然已经详细描述了sbs，但应当理解，本文所述的流通池24可与其他测序方案一起用于基因分型，或用于其他化学和/或生物应用中。在一些情况下，流通池24的引物42、42'可被选择成允许同时进行双端测序，其中正向链和反向链均存在于聚合物水凝胶40、40'上，从而允许同时进行每个读段的碱基检出。顺序和同时双端测序有助于检测基因组重排和重复序列元件，以及基因融合和新转录本。在另一个示例中，本文所公开的流通池24可用于池上文库生成。
[0241]
为了进一步说明本公开，本文给出了实施例。应当理解，提供这些实施例是出于说明目的，而不应理解为限制本公开的范围。
[0242]
非限制性工作示例
[0243]
实施例1
[0244]
制备平均直径为3μm的类似于图1a中所示那些复合物的复合物。复合物的固体支持物是来自thermofisher scientific的dynabeads
tm
m-280链霉抗生物素蛋白珠粒。特定珠粒上的片段来自相同的长dna分子(来自人类基因组)。经由生物素寡核苷酸将文库片段附接到固体支持物。文库片段包括p5'序列和p7序列，以及索引序列和读段1序列和读段2序列。
[0245]
将复合物掺入具有十二烷基硫酸钠的盐水柠檬酸钠缓冲液中，并且将该流体装载到包括非图案化测序表面(包括p5和p7引物)和盖的流通池中。非图案化测序表面还包括生物素捕获位点。
[0246]
然后用洗涤溶液洗涤流通池。
[0247]
制备本文所公开的裂解组合物的第一示例，其包含约40体积％的甲酰胺试剂，该甲酰胺试剂包含甲酰胺和柠檬酸三钠；以及约60体积％的盐缓冲液，该盐缓冲液包含氯化钠、柠檬酸钠和生物相容性表面活性剂。将裂解溶液引入流通池中并使其在80℃下温育约20秒。然后将流通池冷却至20℃并在该温度下保持约3分钟。
[0248]
然后用洗涤溶液洗涤流通池以去除固体支持物和任何未接种的释放文库片段。
[0249]
利用循环扩增使释放和接种的文库片段生长成簇。然后用sytox绿对簇进行染色。所得图像(本文未再现)表明接种的文库片段在复合物附近扩增。
[0250]
然后对流通池进行测序。测序结果显示长dna分子覆盖率接近40％。这表明本文所公开的裂解组合物的第一示例使得文库片段从固体支持物有效释放。
[0251]
实施例2
[0252]
制备根据本文所公开的第一示例的若干种不同的裂解组合物，其包含甲酰胺试剂
(包含甲酰胺和柠檬酸三钠)和盐缓冲液(包含氯化钠、柠檬酸钠和生物相容性表面活性剂)。每种裂解组合物中试剂和缓冲液的百分比在表1中示出。
[0253]
表1
[0254][0255]
流通池表面p5和p7引物与tet qc引物(例如，用荧光染料标记的互补p5和p7(cp5和cp7)引物)杂交。在该示例中，荧光标记用作变性事件的报告物。如果试剂致使变性，则荧光标记的引物离开表面并导致较低的荧光强度。tet强度(荧光)与裂解组合物中使用的甲酰胺试剂的百分比在图5中示出。如所描绘的，当将甲酰胺试剂增加到60体积％时，荧光信号降低。这表明接种的文库片段正在变性。当将甲酰胺试剂增加到70体积％时，可以裂解生物素-链霉抗生物素蛋白键，但是发现表面p5/p7引物的杂交即使在室温下也不稳定。因此，示例中甲酰胺试剂:盐缓冲液的体积比在1:9至约1:1的范围内以确保键裂解和期望的接种条件。
[0256]
实施例3
[0257]
将来自thermofisher scientific的dynabeads
tm
m-280链霉抗生物素蛋白珠粒掺入具有十二烷基硫酸钠的盐水柠檬酸钠缓冲液中，并且将该流体装载到包括非图案化测序表面(包括p5和p7引物)和盖的流通池中。非图案化测序表面还包括生物素捕获位点。因此，m-280珠粒经由生物素-链霉抗生物素蛋白结合固定在表面上。
[0258]
对非图案化测序表面进行成像，并且使用显微镜图像对表面上的固定珠粒进行计数。
[0259]
然后用比较裂解剂(包含甲酰胺和柠檬酸三钠的甲酰胺试剂)洗涤流通池。使比较裂解剂在65℃下温育2分钟。对非图案化测序表面进行成像，并且使用显微镜图像对表面上的固定珠粒进行计数。
[0260]
然后用本文所公开的裂解组合物的第一示例(称为示例裂解剂)洗涤流通池，其包含约50体积％的甲酰胺试剂，该甲酰胺试剂包含甲酰胺和柠檬酸三钠；以及约50体积％的
盐缓冲液，该盐缓冲液包含氯化钠、柠檬酸钠和生物相容性表面活性剂。使示例裂解剂在65℃下温育2分钟。对非图案化测序表面进行成像，并且使用显微镜图像对表面上的固定珠粒进行计数。
[0261]
再次用示例裂解剂洗涤流通池，并对其进行成像。再次使示例裂解剂在65℃下温育2分钟。在用示例裂解剂第二次洗涤之后，使用显微镜图像对表面上的固定珠粒进行计数。
[0262]
在洗涤之前、在用比较裂解剂洗涤之后、在用示例裂解剂第一次洗涤之后以及在用示例裂解剂第二次洗涤之后在流通池表面上计数的珠粒的数量在图6中示出。
[0263]
洗涤之前，溶液中100％的珠粒固定在流通池表面上。在用比较裂解剂洗涤后，去除少于15％的珠粒。在用示例裂解剂第一次洗涤之后，去除约85％的珠粒。在用示例裂解剂第二次洗涤之后，去除约90％的珠粒。这些结果表明，本文所公开的示例裂解混合物在破坏链霉抗生物素蛋白-生物素键时是有效的。
[0264]
实施例4
[0265]
使用脱硫生物素将dna片段附接到来自thermofisher scientific的dynabeads
tm
m-280链霉抗生物素蛋白珠粒。在不同的温度和不同的条件下(例如，在存在游离生物素或游离脱硫生物素的情况下)测试脱硫生物素化dna的热释放。
[0266]
在825mm钠盐水性溶液中制备游离生物素和游离脱硫生物素的混合物。第一混合物含有100μm脱硫生物素，第二混合物含有2.5μm生物素，并且第三混合物含有10μm生物素。
[0267]
在没有任何混合物的情况下将对照样品暴露于25℃或60℃。在存在第一混合物(100μm脱硫生物素)、第二混合物(2.5μm生物素)或第三混合物(10μm生物素)的情况下将示例样品暴露于25℃或60℃。通过定量pcr确定相应处理之后从珠粒释放的dna的百分比。结果在图7中示出。
[0268]
如图7中所描绘的，在25℃或60℃下，在不存在游离生物素或游离脱硫生物素的情况下(对照)，几乎没有脱硫生物素化dna片段从珠粒释放。类似地，在25℃下，在存在游离脱硫生物素或游离生物素(无论浓度如何)的情况下，几乎没有脱硫生物素化dna片段从珠粒释放。在25℃下暴露于第三混合物(10μm游离生物素)的珠粒表现出最低的dna片段释放，只有约1.5％的脱硫生物素化dna片段被释放。相比之下，在60℃下，在存在游离脱硫生物素(混合物1)的情况下，约90％的脱硫生物素化dna片段从珠粒释放，并且在60℃下，在存在游离生物素(无论浓度如何，参见混合物2和3的结果)的情况下，超过95％的脱硫生物素化dna片段从珠粒释放。与在25℃下在存在游离生物素的情况下相比，在60℃下在存在浓度低得多的游离生物素的情况下观察到更高的dna片段释放。
[0269]
附加说明
[0270]
应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。还应当理解，本文明确采用的也可出现在以引用方式并入的任何公开中的术语应被赋予与本文所公开的特定概念最一致的含义。
[0271]
虽然已经详细描述了若干示例，但是应当理解，可以对所公开的示例进行修改。因此，上述说明应被认为是非限制性的。