由复合材料形成的皮肤测试平台

1.本发明涉及皮肤测试平台材料和下面的复合材料本身。本发明还涉及制造和使用所述材料的方法。


背景技术：

2.在本说明书中先前公开的文献的列举或讨论不应当必要地被认为是承认该文献是现有技术的一部分或是公知常识。
3.化妆品行业的一个关键问题是护肤产品吸收到皮肤的脂质和蛋白质层中。人皮肤是测试这一因素的最佳平台，但由于伦理和其他考虑，很少可用。通常，化妆品公司的r&d部门采用常规的皮肤模型测试来获得产品的吸收率。在此吸收测试中，研究人员将护肤产品施加到皮肤模型上，并评估之后模型的状态，以确定产品是否对皮肤模型产生了一定的改善效果，诸如保湿、仿晒、美白等。
4.到目前为止，适用于构建皮肤模型以模仿皮肤特性诸如皮肤湿度条件和吸收性的材料选择有限。当前的皮肤模型使用对水/乳液表现出低吸收性的金属，或其他可用的材料诸如非常昂贵的vitroskin和transpore胶带。传统的使用pmma基底制造皮肤模型的方法远不科学，因为pmma的表面特性与真实皮肤显著不同。此外，由于制造皮肤模型需要大量的这种种类的基底，市售的像人皮肤的产品太过昂贵，增加了化妆品公司的开支。因此，目前大多数化妆品公司对高品质和像人皮肤的基底的需求面临困境。
5.因此，需要开发一种新的且合适的体外皮肤模型，其通过直接吸收小分子(例如，分子量低于或约500da的分子)但排除大分子(例如，分子量高于500da的分子)来模仿皮肤吸收行为。此外，与目前可用的产品相比，这种新的替代物必须具有竞争力的成本。


技术实现要素：

6.现在将通过参考以下编号的条款来描述本发明的方面和实施方式。
7.1.一种呈膜形式的皮肤测试平台材料，所述材料包括：
8.丝心蛋白；以及
9.在所述丝心蛋白中形成交联的交联剂，其中
10.所述皮肤测试平台材料的总干重的4.7至14wt％来自所述交联剂。
11.2.根据条款1所述的皮肤测试平台材料，其中，所述膜具有被成形为模仿人皮肤结构的表面。
12.3.根据条款1或条款2所述的皮肤测试平台材料，其中，所述膜具有多个孔，任选地其中：
13.每个孔独立地具有95至500μm，诸如99至250μm的直径；和/或
14.所述多个孔具有50至80孔cm-2
的孔密度。
15.4.根据前述条款中任一项所述的皮肤测试平台材料，其中，所述交联剂选自由以下组成的组中的一种或多种：o'o-双[2-(n-琥珀酰亚胺基琥珀酰氨基)乙基]聚乙二醇
(nhsp)、戊二醛、聚(乙二醇)二硫醇、4臂peg-硫醇、4臂peg-环氧化物、4臂peg异氰酸酯、异氰酸酯peg异氰酸酯、聚(乙二醇)二缩水甘油醚(例如聚(乙二醇)二硫醇、4臂peg-硫醇、4臂peg-环氧化物、4臂peg异氰酸酯、异氰酸酯peg异氰酸酯和聚(乙二醇)二缩水甘油醚。
[0016]
5.根据条款4所述的皮肤测试平台材料，其中，所述交联剂为聚(乙二醇)二缩水甘油醚。
[0017]
6.根据条款4或条款5所述的皮肤测试平台材料，其中，当所述交联剂为聚合物材料时，其具有的数均分子量为150至2000道尔顿、诸如150至1000道尔顿、诸如200至700道尔顿、诸如250至500道尔顿。
[0018]
7.根据前述条款中任一项所述的皮肤测试平台材料，其中：
[0019]
(az)所述膜为50至500μm、诸如60至450μm、诸如70至400μm、诸如约74μm、诸如约75μm、诸如约400μm厚；和/或
[0020]
(bz)所述皮肤测试平台材料的总干重的6.5至11wt％、诸如9至10wt％来自所述交联剂。
[0021]
8.根据前述条款中任一项所述的皮肤测试平台材料，其中，所述皮肤测试平台进一步包括添加剂材料，任选地其中所述添加剂材料为聚(乙二醇)二丙烯酸酯。
[0022]
9.根据前述条款中任一项所述的皮肤测试平台材料，其中，以下中的一个或多个适用：
[0023]
(a)所述丝心蛋白来自家蚕(bombyx mori)蚕丝；
[0024]
(b)所述皮肤测试平台材料能够经受300至550％的伸长应变而不断裂，诸如350至500％而不断裂；
[0025]
(c)所述皮肤测试平台材料具有2.5至10mpa、诸如5至8mpa、诸如约6.5mpa的杨氏模量；
[0026]
(d)当所述皮肤测试平台材料尚未成形为模仿人皮肤结构时，它在与水接触后30秒时具有的水接触角为60至70
°
；
[0027]
(e)当所述皮肤测试平台材料已经成形为模仿人皮肤结构时，它在与水接触后30秒时具有的水接触角为30至40
°
；
[0028]
(f)在与水接触后30秒时尚未成形为模仿人皮肤结构的所述皮肤测试平台材料的水接触角与已经成形为模仿人皮肤结构的同一皮肤测试平台材料的水接触角之间的差为20
°
至40
°
、诸如约30
°
；以及
[0029]
(g)当所述皮肤测试平台材料尚未成形为模仿人皮肤结构时，它在刚与水接触时具有的水接触角为80至90
°
。
[0030]
10.一种复合材料，包括：
[0031]
丝心蛋白；以及
[0032]
在所述丝心蛋白中形成交联的交联剂，其中
[0033]
所述复合材料的总干重的4.7至14wt％来自所述交联剂。
[0034]
11.根据条款10所述的复合材料，其中，所述复合材料形成为膜，任选地其中所述膜具有以下特征之一或两者：
[0035]
已经成形为模仿人皮肤结构的表面；以及
[0036]
具有多个孔的表面，进一步任选地其中当所述表面具有多个孔时：
[0037]
每个孔独立地具有95至500μm，诸如99至250μm的直径；和/或
[0038]
所述多个孔具有50至80孔cm-2
的孔密度。
[0039]
12.根据条款10或条款11所述的复合材料，其中，所述交联剂选自由以下组成的组中的一种或多种：o'o-双[2-(n-琥珀酰亚胺基琥珀酰氨基)乙基]聚乙二醇(nhsp)、戊二醛、聚(乙二醇)二硫醇、4臂peg-硫醇、4臂peg-环氧化物、4臂peg异氰酸酯、异氰酸酯peg异氰酸酯和聚(乙二醇)二缩水甘油醚(例如聚(乙二醇)二硫醇、4臂peg-硫醇、4臂peg-环氧化物、4臂peg异氰酸酯、异氰酸酯peg异氰酸酯和聚(乙二醇)二缩水甘油醚)。
[0040]
13.根据条款12所述的复合材料，其中，所述交联剂为聚(乙二醇)二缩水甘油醚。
[0041]
14.根据条款12或条款13所述的复合材料，其中：
[0042]
(aaz)当所述交联剂为聚合物材料时，其具有的数均分子量为150至2000道尔顿、诸如150至1000道尔顿、诸如200至700道尔顿、诸如250至500道尔顿；和/或
[0043]
(bbz)所述复合材料的总干重的6.5至11wt％、诸如9至10wt％来自所述交联剂。
[0044]
15.根据条款10至14中任一项所述的复合材料，其中，所述复合材料进一步包括添加剂材料，任选地其中所述添加剂材料为聚(乙二醇)二丙烯酸酯。
[0045]
16.根据条款10至15中任一项所述的复合材料，其中，以下中的一个或多个适用：
[0046]
(ai)所述丝心蛋白来自家蚕蚕丝；
[0047]
(bi)当所述复合材料作为膜提供时，所述复合材料能够经受300至550％的伸长应变而不断裂，诸如350至500％而不断裂；
[0048]
(ci)当所述复合材料作为膜提供时，所述复合材料具有2.5至10mpa、诸如5至8mpa、诸如约6.5mpa的杨氏模量；
[0049]
(di)当所述复合材料作为膜提供但尚未成形为模仿人皮肤结构时，它在与水接触后30秒时具有的水接触角为60至70
°
；
[0050]
(ei)当所述复合材料作为膜提供且已经成形为模仿人皮肤结构时，它在与水接触后30秒时具有的水接触角为30至40
°
；
[0051]
(fi)在与水接触后30秒时作为尚未成形为模仿人皮肤结构的膜提供的所述复合材料的水接触角与作为已经成形为模仿人皮肤结构的膜提供的同一复合材料的水接触角之间的差为20
°
至40
°
，诸如约30
°
；
[0052]
(gi)呈膜形式的所述复合材料具有的厚度为50至500μm、诸如60至450μm、诸如70至400μm、诸如约74μm、诸如约75μm、诸如约400μm；以及
[0053]
(hi)当所述复合材料作为膜提供且尚未成形为模仿人皮肤结构时，它在刚与水接触时具有的水接触角为80至90
°
。
[0054]
17.一种形成根据条款10至16中任一项所述的复合材料的方法，包括以下步骤：
[0055]
(ia)提供包括提取的丝心蛋白和溶剂的溶液；以及
[0056]
(ib)基于所述提取的丝心蛋白的干重，将5至15wt％的交联剂添加到所述丝心蛋白溶液中，以通过与所述丝心蛋白反应形成所需的复合材料。
[0057]
18.一种形成根据条款1至9中任一项所述的呈膜形式的皮肤测试平台材料的方法，包括以下步骤：
[0058]
(a)提供包括提取的丝心蛋白和溶剂的溶液；
[0059]
(b)基于所述提取的丝心蛋白的干重，将5至15wt％的交联剂添加到所述丝心蛋白
溶液中，以通过与所述丝心蛋白反应形成呈溶液的皮肤测试平台材料；
[0060]
(c)将所述呈溶液的皮肤测试平台材料注入到模具中并蒸发所述溶剂以提供所述呈膜形式的皮肤测试平台材料。
[0061]
19.根据条款18所述的方法，其中，所述模具具有被成形为反映人皮肤结构的表面，以生产具有模仿人皮肤结构的表面的膜。
[0062]
20.根据条款17所述的方法或根据条款18或19所述的方法，其中，所述方法进一步包括向所述膜施加多个孔，任选地其中：
[0063]
每个孔独立地具有95至500μm，诸如99至250μm的直径；和/或
[0064]
所述多个孔具有50至80孔cm-2
的孔密度。
[0065]
21.根据条款17和当从属于条款17时的条款20所述的方法，或根据条款18和当从属于条款18时的条款19至20中任一项所述的方法，其中，所述交联剂选自由以下组成的组中的一种或多种：o'o-双[2-(n-琥珀酰亚胺基琥珀酰氨基)乙基]聚乙二醇(nhsp)、戊二醛、聚(乙二醇)二硫醇、4臂peg-硫醇、4臂peg-环氧化物、4臂peg异氰酸酯、异氰酸酯peg异氰酸酯和聚(乙二醇)二缩水甘油醚(例如聚(乙二醇)二硫醇、4臂peg-硫醇、4臂peg-环氧化物、4臂peg异氰酸酯、异氰酸酯peg异氰酸酯或更特别地聚(乙二醇)二缩水甘油醚)，任选地其中以下中的一个或多个适用：
[0066]
(ai)所述交联剂为聚(乙二醇)二缩水甘油醚；
[0067]
(aii)当所述交联剂为聚合物材料时，其具有的数均分子量为150至2000道尔顿、诸如150至1000道尔顿、诸如200至700道尔顿、诸如250至500道尔顿；
[0068]
(aiii)相对于所述提取的丝心蛋白的干重，将量为7至12wt％、诸如约10wt％的所述交联剂添加到包括提取的丝心蛋白和溶剂的所述溶液中。
[0069]
22.根据条款17和当从属于条款17时的条款20至21中任一项所述的方法或根据条款18和当从属于条款18时的条款19至21中任一项所述的方法，其中，所述交联剂与所述丝心蛋白的反应是使用超声处理和/或加热一段时间来实现的，任选地其中：
[0070]
当使用时，所述加热为40至80℃、诸如50至70℃、诸如约60℃；和/或
[0071]
所述一段时间为10分钟至24小时、诸如20分钟至12小时、诸如25分钟至1小时、诸如约30分钟。
[0072]
23.根据条款17和当从属于权利要求17时的条款20至22中任一项所述的方法或根据条款18和当从属于权利要求18时的条款19至22中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括将添加剂材料添加到在条款17的步骤(ib)中形成的所述复合材料或在条款18的步骤(b)中形成的所述呈溶液的皮肤测试平台材料，任选地其中所述添加剂材料为聚(乙二醇)二丙烯酸酯。
[0073]
24.一种确定测试组合物的特性的方法，所述方法包括以下步骤：
[0074]
(zi)供应条款1至9中任一项所述的皮肤测试平台；
[0075]
(zii)将测试组合物施加到所述皮肤测试平台并确定所述组合物的特性。
[0076]
25.根据条款24所述的方法，其中，所述组合物和特性选自以下之一：
[0077]
(zzi)所述组合物是抗细菌清洁组合物，并且条款24的步骤(zii)包括将所述组合物施加到所述皮肤测试平台，随后将其冲洗掉以及然后将细菌培养物施加到所述皮肤测试平台并测量在所述皮肤测试平台上的细菌培养物的生长以确定所述抗细菌清洁组合物的
抗细菌活性；
[0078]
(zzii)所述组合物是护肤产品，并且条款24的步骤(zii)包括将所述组合物施加到所述皮肤测试平台的一部分以及然后测量所述组合物在施加护肤组合物的部分上的动态摩擦力；或者
[0079]
(zziii)所述组合物是香料，并且条款24的步骤(zii)包括将所述组合物施加到所述皮肤测试平台的一部分以及然后测量所述香料随时间推移的释放曲线。
[0080]
1)通过在皮肤测试平台上施加皮肤产品和培养细菌测试手洗剂/手洁净剂/浴用凝胶的抗细菌性能。
[0081]
2)通过施加护肤产品并测量施加区域的动态摩擦力测试产品施加后的吸收性和感官感觉。
[0082]
3)测试施加在皮肤测试平台上的香料的释放曲线。
附图说明
[0083]
本发明的方面和实施方式由以下附图说明。
[0084]
图1描绘了反应后的pegde-sf和简单混合的聚(乙二醇)二缩水甘油醚(pegde)和丝心蛋白(sf)的ftir结果。
[0085]
图2示出了a)用不同重量比的pegde处理的丝的ftir光谱示出了丝中存在醚部分(1055cm-1
)，并且丝的二级结构从结晶结构域(1511cm-1
)转变为无定形结构域(1535cm-1
)并随着pegde重量比的增加回到结晶结构域(1511cm-1
)；以及b)示出乙二醇部分植入丝心蛋白中的peg化的sf(psf)和原始sf的1h nmr。
[0086]
图3示出了a)具有角质层结构的pegde/sf基底的光学图像；b)有和没有角质层结构的pegde/sf基底(也称为皮肤结构)的接触角测试；以及c)测量没有角质层结构的pegde/sf基底的接触角)。
[0087]
图4示出了a)通过超声处理反应的(超声处理反应的)和在升高的温度下搅拌(加热和搅拌)的sf-pegde的机械性能比较；以及b)控制sf与pegde超声处理(pegde-sf)、与peg-400超声处理(sf-peg400)和与pegde简单混合(简单混合的sf+pegde)的机械测试。
[0088]
图5示出了具有不同pegde比率的角质层结构的pegde/sf对水的表面接触角分布。
[0089]
图6描绘了不同反应的丝溶液浓度的表面接触角范围。
[0090]
图7描绘了具有角质层结构的pegde/sf的表面接触角范围。
[0091]
图8描绘了(a)具有不同pegde与sf的重量比的pegde-sf的机械测试结果；以及(b)不同pegde与sf的重量比对杨氏模量的影响。
[0092]
图9示出了(a-b)根据本发明的膜的照片中可能的孔径；(c)示出可能的孔图案的照片；以及(d)示意性的孔图案。
[0093]
图10示出了有和没有孔的pegde/sf的水接触角变化的时间演变。
[0094]
图11示出了随时间推移皮肤人造表皮(即无角质层结构的pegde-sf)的化妆水(化妆水样品由p&g sg提供)吸收过程：(a)0min；(b)5min；和(c)20min。
[0095]
图12示出了随时间推移皮肤人造表皮的乳膏(乳膏样品由p&g sg提供)吸收过程：(a)0min；(b)5min；和(c)20min。
[0096]
图13描绘了(a)丝人造表皮对洗剂的吸收性；以及(b)丝人造表皮在施加洗剂后的
接触角变化。
[0097]
图14示出了a)烟酰胺渗透到不同深度的丝人造表皮中；以及b)甘油渗透到不同深度的丝人造表皮中。
[0098]
图15描述了丝人造表皮和市售人造表皮的细菌培养性能。
[0099]
图16示出了丝人造表皮和商品vitro-在0s、5s、10s、15s和20s的水的吸收。
[0100]
图17示出了(a)大型丝人造表皮的照片；以及(b)示出高透明度的大型丝人造表皮的照片。
具体实施方式
[0101]
出人意料的是，已发现由丝心蛋白和可交联丝心蛋白的交联剂形成的复合材料可用于形成皮肤测试平台，该平台具有与皮肤相似(如果不是在一些情况下相同)的特性。因此，在本发明的第一方面，提供了一种呈膜形式的皮肤测试平台材料，所述材料包括：
[0102]
丝心蛋白；以及
[0103]
在所述丝心蛋白中形成交联的交联剂，其中
[0104]
所述皮肤测试平台材料的总干重的4.7至14wt％来自所述交联剂。
[0105]
在本文的实施方式中，词语“包括”可以被解释为需要所提及的特征，但不限制其他特征的存在。替代地，词语“包括”也可以涉及其中旨在仅所列举的组分/特征存在的情况(例如，词语“包括”可以被短语“由
……
组成”或“基本上由
……
组成”替换)。明确设想了无论是广义的解释还是狭义的解释两者都可以适用于本发明的所有方面和实施方式。换句话说，词语“包括”及其同义词可被短语“由
……
组成”或短语“基本上由
……
组成”或其同义词所替换，并且反之亦然。
[0106]
短语“基本上由
……
组成”及其假名在本文中可以解释为是指可存在少量杂质的材料。例如，该材料可以大于或等于90％纯度、诸如大于95％纯度、诸如大于97％纯度、诸如大于99％纯度、诸如大于99.9％纯度、诸如大于99.99％纯度、诸如大于99.999％纯度、诸如100％纯度。
[0107]
当在本文中使用时，术语“膜”将被理解为是指呈类似于膜的形式的材料。该膜/膜(film/membrane)可以具有任何合适的厚度，但可以成形为具有类似于已知的人皮肤和/或商业皮肤替代产品的厚度。例如，膜可以是5到4000μm、诸如10至1000μm、诸如20到100μm、诸如约30μm。在本文可提及的特定实施方式中，膜可为50至500μm、诸如60至450μm、诸如70至400μm、诸如约74μm、诸如约75μm、诸如约400μm厚。
[0108]
皮肤测试平台材料可以或可以不被图案化，使得膜的至少一个表面被成形为模仿人皮肤结构。下面在实施例中详细描述了膜如何可以被图案化以模仿人皮肤结构的实例。然而，可以将用于形成膜的材料的液体形式(例如溶液)放置到模具中，该模具是通过对人皮肤的外层进行印模而形成的，其中溶液中的溶剂允许蒸发至形成图案化的膜。当在本文中使用时，术语“人皮肤结构”可以意指在角质层、表皮最外层的表面上发现的结构。例如，可以模仿的人皮肤结构包括死角质形成细胞、孔等。
[0109]
还可以处理膜(具有或不具有图案化以模仿人皮肤结构)以提供多个孔。这些孔可以部分地或完全地延伸穿过膜并且可以通过任何合适的方法制成。例如，孔可以通过激光
图案化制成。每个孔可以具有任何合适的直径并且多个孔可以具有任何合适的密度。多个孔的合适密度可以模仿人皮肤中发现的孔的密度，而每个孔的直径也可以模仿人皮肤中发现的孔的直径。例如，每个孔可以独立地具有95至500μm、诸如99到250μm的直径。多个孔可具有50至80孔cm-2
的孔密度。应当理解，孔直径和孔密度不一定是相关的，并且可以在本文所讨论的膜中存在孔的本发明的实施方式中使用的孔直径和孔密度有很大程度的可变性。
[0110]
丝心蛋白可以为任何合适的水凝胶形式。例如，大部分丝心蛋白可以以无规卷曲和转角的形式提供，但也可以存在其他形式的丝心蛋白(例如β-片层和螺旋)。例如，在本文提到的某些实施方式中，丝心蛋白可包含约54.6％的无规卷曲和约45.4％的无规转角。
[0111]
在皮肤测试平台材料中，交联剂以维持在不同的丝心蛋白蛋白链之间或可能地在同一链的不同部分之间的交联的形式提供。交联剂可以任何合适的形式提供。例如，交联剂可以潜在地以能够形成离子交联的离子材料的形式提供。在本文可提及的特定实施方式中，交联剂可以是能够与丝心蛋白中的氨基酸残基形成共价键的材料。例如，交联剂可能够与丝心蛋白的氨基酸残基中的氨基基团或酚基团形成共价键。例如，可存在于带有氨基基团的丝心蛋白中的氨基酸包括asn、lys和pro，而可存在于带有酚基团的丝心蛋白中的氨基酸包括tyr。丝心蛋白中的氨基基团和酚基团之一或两者可用于与适合形成共价键的交联剂形成共价键。
[0112]
可交联官能团的任何合适的交联度都可以在本文中使用。例如，丝心蛋白中氨基酸侧链中氨基(nh2)基团的交联度可以为1％至100％、诸如10％至99％、诸如20％至98％或更特别地33％至97.7％。丝心蛋白中酚基团的交联度可以为1％至100％、诸如10％至99％、诸如15％至90％或更特别地33％至88％(诸如15％至83％)。这些范围可适用于本文所述的本发明的任何方面和实施方式。
[0113]
为了避免疑问，明确地设想了在本文中引用了与同一特征相关的多个数值范围的情况下，旨在以任何顺序组合每个范围的端点以提供进一步设想的(并含蓄地公开的)范围。例如，交联度可以选自以下中的任一种：
[0114]
1至10％、诸如1至15％、诸如1至20％、诸如1至33％、诸如1至83％、诸如1至88％、诸如1至90％、诸如1至97.7％、诸如1至99％、诸如1至100％；
[0115]
诸如10至15％、诸如10至20％、诸如10至33％、诸如10至83％、诸如10至88％、诸如10至90％、诸如10至97.7％、诸如10至99％、诸如10至100％；
[0116]
15至20％、诸如15至33％、诸如15至83％、诸如15至88％、诸如15至90％、诸如15至97.7％、诸如15至99％、诸如15至100％；
[0117]
20至33％、诸如20至83％、诸如20至88％、诸如20至90％、诸如20至97.7％、诸如20至99％、诸如20至100％；
[0118]
33至83％、诸如33至88％、诸如33至90％、诸如33至97.7％、诸如33至99％、诸如33至100％；
[0119]
83至88％、诸如83至90％、诸如83至97.7％、诸如83至99％、诸如83至100％；
[0120]
88至90％、诸如88至97.7％、诸如88至99％、诸如88至100％；
[0121]
90至97.7％、诸如90至99％、诸如90至100％；
[0122]
97.7至99％、诸如97.7至100％；以及
[0123]
99至100％。
[0124]
本文可提及的交联剂包括但不限于o'o-双[2-(n-琥珀酰亚胺基琥珀酰氨基)乙基]聚乙二醇(nhsp)、戊二醛、聚(乙二醇)二硫醇、4臂peg-硫醇、4臂peg-环氧化物、4臂peg异氰酸酯、异氰酸酯peg异氰酸酯或更特别地聚(乙二醇)二缩水甘油醚。例如，交联剂可以是聚(乙二醇)二硫醇、4臂peg-硫醇、4臂peg-环氧化物、4臂peg异氰酸酯、异氰酸酯peg异氰酸酯或更特别地聚(乙二醇)二缩水甘油醚。例如，交联剂可以是聚(乙二醇)二缩水甘油醚。
[0125]
在本发明的实施方式中，添加剂材料可以包括在皮肤测试平台材料中。例如，添加剂材料可以是聚(乙二醇)二丙烯酸酯。在其中聚(乙二醇)二丙烯酸酯作为添加剂存在的本发明的实施方式中，它可以作为表面润湿性修饰剂提供。
[0126]
当交联剂是聚合物材料时，它可以具有任何合适的数均分子量。例如，当交联剂为聚合物材料时，其具有的数均分子量为150至2000道尔顿、诸如150至1000道尔顿、诸如200至700道尔顿、诸如250至500道尔顿。
[0127]
如上所述，皮肤测试平台材料的总干重的4.7至14wt％来自交联剂。当在本文中使用时，“总干重”是指皮肤测试平台材料(或本文中还提到的复合材料)的干重。关于制造方法，将相对于丝心蛋白的重量的5至15wt％的交联剂添加到所述丝心蛋白中以形成所需产品。这意指交联剂可以形成所得产品干重的4.7至14wt％。在本文可提及的本发明的实施方式中，皮肤测试平台材料(或本文可提及的其他形式的材料，诸如复合材料)的总干重的6.5至11wt％、诸如9至10wt％可以来自交联剂，其可以相应地解释为上述定义。
[0128]
用于皮肤测试平台的丝心蛋白可以从任何合适的来源获得。例如，丝心蛋白可以从家蚕(bombyx mori)的幼虫和其他蛾属诸如柞蚕属(antheraea)、小字大蚕蛾属(cricula)、樗蚕蛾属(samia)和枯叶蛾属(gonometa)中获得。丝心蛋白也可以从蜘蛛丝中获得。例如，丝心蛋白可以来自家蚕蚕丝。
[0129]
皮肤测试平台材料可能够承受施加在其上的机械应变。例如，皮肤测试平台材料可经受300至550％的伸长应变而不断裂、诸如350至500％而不断裂。皮肤测试平台材料还可以或另外显示2.5至10mpa、诸如5至8mpa、诸如约6.5mpa的杨氏模量。
[0130]
当皮肤测试平台材料尚未成形为模仿人皮肤结构时，它在与水接触后30秒时可具有的水接触角为60至70
°
。另外地或替代地，当皮肤测试平台材料尚未成形为模仿人皮肤结构时，它在刚与水接触时可具有的水接触角为80至90
°
。出人意料地已经发现，尚未成形为模仿人皮肤结构的皮肤测试平台材料可以更准确地匹配面部皮肤的轮廓。
[0131]
替代地，当皮肤测试平台材料已经成形为模仿人皮肤结构时，它在与水接触后30秒时可具有的水接触角为30至40
°
。
[0132]
例如，在与水接触后30秒时尚未成形为模仿人皮肤结构的皮肤测试平台材料的水接触角与已经成形为模仿人皮肤结构的同一皮肤测试平台材料的水接触角之间的差可以为20
°
至40
°
，诸如约30
°
。
[0133]
上述皮肤测试平台使用由交联的丝心蛋白形成的材料。因此，在本发明的另外方面，还公开了一种复合材料，包括：
[0134]
丝心蛋白；以及
[0135]
在所述丝心蛋白中形成交联的交联剂，其中
[0136]
所述复合材料的总干重的4.7至14wt％来自所述交联剂。
[0137]
如将理解的，复合材料可以形成为膜(例如，以便形成皮肤测试平台)。在其中复合
材料呈膜形式呈现的实施方式中，它可以在功能上与上述皮肤测试平台相同。因此，以上与皮肤测试平台材料相关的所有实施方式也可以在这里应用(当复合材料呈膜的形式时)，并且因此为了简洁起见在此将不重复，但将被理解为形成本发明的一部分。
[0138]
复合材料也可以由本文所述的用于皮肤测试平台材料的相同材料形成。因此，上文在皮肤测试平台材料的实施方式中描述的所有材料、量和材料特性(例如，交联剂、丝心蛋白源、丝心蛋白和交联剂的量)如上文所述。此外，复合材料的物理特性可以与上文描述的用于皮肤测试平台材料的物理特性相同或相似(例如，当呈膜的形式提供时)。鉴于此，为了简洁起见，这里将不描述这些实施方式，但将被理解为形成本发明的一部分。
[0139]
如将理解的，复合材料和皮肤测试平台材料可以使用相似的(或甚至相同的)加工步骤形成。因此，本发明的另外方面涉及：
[0140]
(zi)一种形成如本文所述的复合材料的方法，包括以下步骤：
[0141]
(ia)提供包括提取的丝心蛋白和溶剂的溶液；以及
[0142]
(ib)基于所述提取的丝心蛋白的干重，将5至15wt％的交联剂添加到所述丝心蛋白溶液中，以通过与所述丝心蛋白反应形成所需的复合材料；以及
[0143]
(zii)一种形成如本文所述的呈膜形式的皮肤测试平台材料的方法，包括以下步骤：
[0144]
(a)提供包括提取的丝心蛋白和溶剂的溶液；
[0145]
(b)基于所述提取的丝心蛋白的干重，将5至15wt％的交联剂添加到所述丝心蛋白溶液中，以通过与所述丝心蛋白反应形成呈溶液的皮肤测试平台材料；
[0146]
(c)将所述呈溶液的皮肤测试平台材料注入到模具中并蒸发所述溶剂以提供所述呈膜形式的皮肤测试平台材料。
[0147]
为了避免疑问，当复合材料呈膜的形式形成时，它可以使用上述用于形成皮肤测试平台的方法来形成。用于形成皮肤测试平台和复合材料的材料在上文已经详细讨论，并且因此为了简洁起见在此将不再讨论。
[0148]
在其中呈膜形式的皮肤测试平台或复合材料模仿人皮肤结构的本发明的实施方式中，在上述步骤(c)中使用的模具可以是具有被成形为反映人皮肤结构的表面的模具，以生产具有模仿人皮肤结构的表面的膜。
[0149]
在以上公开的方法的实施方式中，交联剂与丝心蛋白的反应可以使用超声处理和/或加热一段时间来实现。当在本文中使用时，“加热”将被理解为是指对反应混合物施加热量以在反应混合物中产生相对于环境条件升高的温度。例如，加热可在反应混合物中产生40至80℃、诸如50至70℃、诸如约60℃的温度。加热和/或超声处理的合适时间段可以是允许反应进行至完成和/或在所形成的材料中产生所需特性的任何时间段。例如，时间段可以为10分钟至24小时、诸如20分钟至12小时、诸如25分钟至1小时、诸如约30分钟。
[0150]
如将理解的，如果添加剂材料要形成最终产品的一部分，则可以将其添加到上述方法的步骤(ib)中的复合材料和/或步骤(b)中的呈溶液的皮肤测试平台材料中。本文可提及的合适添加剂包括但不限于聚(乙二醇)二丙烯酸酯(pegda)。例如，在上述步骤(ib)中形成复合材料(或步骤(b)中形成呈溶液的皮肤测试平台材料)后，可以将添加剂作为添加剂材料以任何合适的量添加到在所述步骤中获得的溶液中(例如，1至10wt％的没有添加剂材料的复合材料)。可以对包含添加剂后的溶液进行超声处理一段时间(例如2至60分钟、诸如
5至15分钟、诸如约10分钟)之后，然后用于形成膜。
[0151]
可以在本文中提及的本发明的另外方面和实施方式包括下面列出的那些。
[0152]
在另外方面，公开了一种用于皮肤测试平台的修饰的丝心蛋白膜，包括：
[0153]
a)用聚(乙二醇)(peg)衍生物修饰的丝心蛋白膜(其中peg衍生物的实例是聚(乙二醇)二缩水甘油醚(pegde))；
[0154]
b)其中丝心蛋白可以从家蚕蚕丝中获得；
[0155]
c)修饰的丝心蛋白膜可模仿皮肤吸收行为；
[0156]
e)优选地，修饰的丝心蛋白膜可以具有人皮肤结构。
[0157]
在又另外方面，公开了一种形成用于皮肤测试平台的修饰的丝心蛋白膜的方法，包括：
[0158]
f)提供提取的丝心蛋白的溶液；
[0159]
g)使10wt％(基于提取的丝心蛋白的重量)的聚(
[0160]
乙二醇)(peg)衍生物与提取的丝心蛋白的溶液反应一段时间以形成修饰的丝心蛋白的溶液；
[0161]
h)将修饰的丝心蛋白的溶液注入模具中；
[0162]
i)使修饰的丝心蛋白的溶液的溶剂蒸发以形成修饰的丝心蛋白膜；
[0163]
j)其中反应可以包括在升高的温度(最高达60℃)下搅拌或超声处理30-45分钟；
[0164]
k)优选地，其中模具是允许形成皮肤结构的皮肤模具；
[0165]
1)其中peg衍生物具有可与氨基基团反应的官能团；
[0166]
m)优选地，peg衍生物具有小于1000da、优选地约500da的分子量；以及
[0167]
n)优选地，peg衍生物可以是聚乙二醇)二缩水甘油醚(pegde)。
[0168]
如将理解的，本文所公开的皮肤测试平台可用于替代人或动物皮肤以测试制剂的适用性或作为其更有效的模型。因此，本文公开的皮肤测试平台可适用于在多种测试中用作用于测试要施加到皮肤的制剂的模型系统。因此，在本发明的另外方面，公开了一种确定测试组合物的特性的方法，所述方法包括以下步骤：
[0169]
(zi)供应如上文所述的皮肤测试平台；
[0170]
(zii)将测试组合物施加到所述皮肤测试平台并确定所述组合物的特性。
[0171]
可以确定任何合适的制剂和特性。这些方法和特性的实例包括但不限于以下。
[0172]
该方法可以帮助确定特定的清洁组合物(例如手洗剂、手洁净剂或浴用凝胶)是否具有足够的抗细菌性能。因此，该方法可以包括将抗细菌清洁组合物施加到皮肤测试平台，随后将其冲洗掉以及然后将细菌培养物施加到皮肤测试平台并测量在皮肤测试平台上的细菌培养物的生长(或其缺乏)以确定抗细菌清洁组合物的抗细菌活性。
[0173]
该方法可以涉及确定产品在其施加到皮肤后的吸收性和感官感觉。因此，组合物可以是施加到皮肤测试平台的一部分的护肤产品，其中然后测量施加护肤产品的区域的动态摩擦力。
[0174]
该方法可替代地涉及测量香料的释放曲线。因此，可以将香料施加到皮肤测试平台的一部分，以及然后可以测量香料随时间推移的释放曲线。
[0175]
现将通过参考以下非限制性实施例来描述本发明的另外方面和实施方式。
[0176]
实施例
[0177]
材料
[0178]
vitro-购自美国ims。聚(乙二醇)二缩水甘油醚(pegde)、聚(乙二醇)二丙烯酸酯(pegda)、溴化锂(acs试剂，≥99％)、氯化锂(acs试剂，≥99％)、茚三酮(acs试剂)、盐酸胍溶液(8m，ph 8.5，缓冲水性溶液)、乙醇(95％)和碳酸钠(粉末，≥99.5％，acs试剂)购自sigma-aldrich。
[0179]
分析技术
[0180]
所有傅里叶变换红外(ftir)光谱均使用ftir光谱仪(perkinelmer frontier
tm ir)和衰减全反射(atr)附件获得，波数为4000cm-1
至800cm-1
。在ftir测试之前，将所有样品切成1cm2的正方形，并在60℃的真空烘箱中处理过夜，以去除蛋白质内部的水。
[0181]
labram soleil
tm
拉曼光谱用于测量化合物到丝膜中的渗透。
[0182]
所有的核磁共振(nmr)光谱均通过在60℃下将丝样品溶解在1m licl/二甲基亚砜-d溶液中获得。加热30min后，样品完全溶解，并使用brukeraviii 400mhz nmr进行1h nmr分析。
[0183]
使用接触角(移动表面分析仪)通过以下进行接触角测量：在样品上滴～5μl的水滴，当水滴沉积在样品表面时捕获实时图像，并使用设备中的分析软件测量水接触角。
[0184]
茚三酮测定方案描述如下。将不同pegde重量比(0％/5％/10％/20％/30％)的每个膜(30mg)在以0.35％w/v于乙醇中的3ml茚三酮溶液中在90℃下在搅拌下温育1h。空白对照通过在相同条件下温育3ml相同的茚三酮溶液来制备。
[0185]
样品中游离氨基基团的量可以通过使用uv-vis-nir lambda 950在570nm处的吸光度来反映。nh
没有
和nh
具有
分别是原始sf和peg化的sf中的游离氨基基团的量。游离氨基基团的交联率可以用以下方程计算。甘氨酸标准溶液用于建立具有已知游离氨基基团浓度的校准曲线。
[0186][0187]
盐酸胍测定描述如下。将不同pegde比例(0％/5％/10％/20％/30％)的每个膜(10mg)在5ml的8m盐酸胍溶液(ph＝8)中在60℃下在温和搅拌下温育过夜。取1ml溶液，并与另外2ml的8m盐酸胍溶液(ph＝8)混合均匀以使蛋白质浓度达到0.67mg/ml。取所得溶液用于uv-vis实验。发色团酪氨酸的量可以通过uv-vis-nir lambda 950在270nm处的吸光度来反映。tyr
没有
和tyr
具有
分别是原始sf和peg化的sf中的酪氨酸残基的量。酪氨酸残基的交联度可以用以下方程计算。
[0188][0189]
皮肤仿制模具的制备方法
[0190]
通过在橡胶皮肤模具的表面上涂覆聚二甲基硅氧烷(pdms)来制备皮肤仿制模具。所用的pdms前体和交联剂来自购自dow的sylgard
tm 184硅酮弹性体试剂盒。pdms首先通过以10:1比率混合pdms前体和交联剂，接着进行彻底的混合过程来制备。将制备的pdms前体和交联剂的混合物倒在橡胶皮肤模具上，以及然后在60℃下固化2h。在pdms完全固化后，将
其从橡胶皮肤模具上剥离，获得皮肤仿制模具。
[0191]
实施例1
[0192]
该实施例中复合材料的制造完全是水基的。通过在2l的5％na2co3水性溶液中煮沸20g丝纤维(也称为丝茧)从家蚕丝茧中提取粗丝纤维。在di水中反复洗去残留丝胶蛋白后，获得脱胶的sf纤维。为了制备sf水性溶液，然后将脱胶的丝纤维溶解在9.3m libr溶液中并且获得澄清的深黄色溶液。为了去除过量的锂离子和溴离子，溶液在di水中进行透析过程，并在1h、4h、8h、16h、24h内更换水。沉淀蛋白质聚集体，以及然后进行离心过程(10000rpm，30min)以去除蛋白质聚集体，蛋白质溶液的浓度通过称重溶液的干重来确定并且为约5％(w/v)。将5wt％、10wt％、20wt％、25wt％或30wt％的pegde(平均mw：500da)直接添加到丝溶液中，接着是动态搅拌以及在60℃下加热30min以获得pegde/sf(本文使用时指加热产生的复合材料)或通过超声处理过程30min以获得pegde-sf(本文使用时指超声处理产生的复合材料)。在通过加热或超声处理来处理后，将反应溶液倒在皮肤仿制模具上并进行环境蒸发过程以获得具有角质层结构的sf/pegde基底。为获得没有角质层结构的sf/pegde基底，可以将反应溶液倒入任何平容器(诸如培养皿)中，并且根据添加的丝溶液的量可以调整厚度。
[0193]
下面的表1示出了允许与sf交联的可能的peg衍生物的列表。
[0194]
表1.允许交联的可能的peg衍生物的列表。
[0195]
聚乙二醇(peg)衍生物聚(乙二醇)二硫醇4臂peg-硫醇4臂peg-环氧化物4臂peg异氰酸酯异氰酸酯peg异氰酸酯
[0196]
如上所述制备对比膜pegde+sf，除了sf和pegde在环境温度下简单混合30min。另一种对比膜sf-peg400是通过使peg(平均mw：400da)和sf通过上述超声处理过程反应来制备。
[0197]
另一种膜pegda-sf是通过交联5wt％pegde(平均mw：500da)与sf通过如上所述的超声处理过程来制备。然后，将5wt.％pegda(500g/mol，0.10g)添加到pegde-sf溶液中，并将反应混合物超声处理10min，然后将其倒入模具或任何用于膜形成的平容器中。
[0198]
使用丝心蛋白(sf)和聚(乙二醇)二缩水甘油醚(pegde)制备的复合材料的缩写列表：
[0199]
pegde/sf
–
加热产生的复合材料；
[0200]
pegde-sf
–
超声处理产生的复合材料；
[0201]
pegde+sf
–
简单混合的pegde和sf；以及
[0202]
丝人造表皮
–
没有角质层结构的pegde-sf
[0203]
为了避免疑问，以下实施例中使用的上述术语与上面提供的缩写词一致。
[0204]
表征
[0205]
ftir用于获得膜的特征化学结构。原始丝的特征峰将呈现为具有一些螺旋结构(-1657cm-1
)的无定形的(-1545cm-1
)，丝ii结晶结构(-1627cm-1
和-1522cm-1
)，并且它们的相对
变化可以通过ftir光谱中的相对峰强度变化来示出。虽然无规卷曲的分布有助于sf的拉伸性，但结晶结构域决定了强度。如图1所示，与简单混合的pegde+sf相比，超声处理的pegde-sf中的无规卷曲结构域(1639cm-1
，1549cm-1
)被发现增加。与原始sf相比，pegde-sf的ftir光谱中存在1055cm-1
峰表明丝中包含来自pegde的醚部分(图2a)。在原始sf和5％pegde-sf之间，存在从β-片层(1511cm-1
)至无规卷曲(1535cm-1
)的明显转移。这种转移持续到10％pegde-sf，但pegde持续增加到20％以及甚至30％导致峰转移回到β-片层。这些结果证实了pegde的添加，并示出丝的peg化影响其二级结构，这可增加丝的拉伸性和柔软度。
[0206]
为了表征pegde和丝之间交联后的分子变化，如上所述，将5wt％至30wt％的pegde(mw～500g/mol)添加到丝中并在60℃下加热30min。1h nmr验证了乙二醇基团被植入sf中，在pegde-sf上存在3.4ppm(-ch
2-)、5.1ppm(-ch-)(图2b)。
[0207]
除了ftir和1h nmr，还进行了pegde/sf的接触角测量以进行表面表征。根据接触角测试，pegde/sf对水表现出缓慢的吸收行为，其中增加的亲水性超过吸收(图3)。
[0208]
pegde与丝中的酪氨酸残基或游离氨基基团之间的交联度通过蛋白质测定来确定，并且结果示出于表2和3中。
[0209]
表2.pegde和丝中的-nh2之间的交联度。
[0210]
pegde wt％-nh2交联度(％)533.91076.32097.73097.7
[0211]
表3.pegde和丝中的-tyr之间的交联度。
[0212]
pegde wt％-tyr交联度(％)515.01047.52082.63087.4
[0213]
实施例2
[0214]
为了确定实施例1中制备的膜的机械强度，如下所述进行机械性能测试。
[0215]
pegde-sf的应力-应变曲线是通过带有环境室(bionix environbath，mts systems corporation)的机械测试仪(c42，mts systems corporation)获得的。循环水系统与37℃下水浴的环境室相连。以2mm/min的拉伸速度进行拉伸测试超过3次。使用第一0.5％应变计算杨氏模量。
[0216]
结果和讨论
[0217]
根据图4a所示的机械测试结果，对于相同比率的pegde(10％wt)，通过超声处理或升高的温度下的搅拌(加热和搅拌)使sf与pegde反应，产生相似的机械性能。另一方面，不具有活性环氧基团的sf-peg-400和通过简单混合制备的pegde+sf两者均表现出有限的拉伸性。这可以通过这2种对比膜中的sf分子链内缺乏交联来解释。
[0218]
比较杨氏模量，pegde+sf产生的杨氏模量小于pegde-sf(图4b)，这可以通过pegde和sf之间的交联强化效应来解释。因此，pegde只有在通过超声处理或升高的温度下的搅拌
与sf反应后，才能发生交联反应。尽管如此，sf-peg-400示出甚至更好的强度增强(图4b)，这可能是由于其过量的羟基基团，根据之前的出版物，该出版物提到羟基基团的存在可以增加sf的结晶度(x.wang et al.,acta biomater.2015,12,51-61)。
[0219]
实施例3
[0220]
具有角质层结构的pegde/sf(在实施例1中制备)的表面疏水性通过改变peg衍生物比率、反应的丝溶液浓度和所用peg衍生物的类型来调节。该反应由如表4中所呈现的化学输入量诱导。制备的样品的表面疏水性通过水接触角测量来确定。
[0221]
表4.三种修饰丝人造表皮的疏水性的方法的化学输入。
[0222][0223]
结果和讨论
[0224]
pegde重量比对疏水性的影响示出于图5中。不同pegde比率的水接触角示出，pegde-sf膜首先在5％至10％的pegde添加下变得更加疏水，然后在超过20％的pegde添加下变得更加亲水。通常，从5％至30％，获得了70
°‑
85
°
的接触角范围。
[0225]
由不同丝浓度(3％、6％和10％)制造的具有角质层结构的pegde/sf的水接触角也示出，随着丝溶液浓度的增加，接触角逐渐减小(图6)。这可归因于膜形成过程期间的蛋白质链的不同聚集体。通过调节反应的丝溶液的浓度，实现75
°‑
105
°
的接触角范围。
[0226]
还研究了pegda-sf的表面润湿性。发现，具有角质层结构的pegda-sf表现出更亲水的特性以及较低的接触角，为74.07
±
7.26
°
(图7)。
[0227]
实施例4
[0228]
为了确定pegde与sf的比率对实施例1中制备的pegde-sf膜的拉伸性的影响，进行如实施例2中所述的机械测试，并且以下提供了结果。
[0229]
结果和讨论
[0230]
图8a示出了具有pegde比sf的不同重量比的pegde-sf的机械测试的结果。随着pegde量的增加，所得pegde-sf膜的杨氏模量增加(图8b)。添加≤10％的pegde的所得pegde-sf膜具有与人皮肤相似的杨氏模量值。因此，在实施例1中制备的所有pegde-sf膜都类似于人皮肤，因为理论上人皮肤可以被拉伸至最高达100％应变。选择10wt％的pegde-sf进行另外研究，因为在这个比率下，拉伸性几乎达到了500％。因此，所有以下实施例均使用10％wt的pegde比sf或者10％wt的peg400比sf。
[0231]
实施例5
[0232]
除了调节表面疏水性外，皮肤孔对于评估皮肤与个人护理产品的相互作用也是重要的。通常，皮肤孔的范围可以为100至500μm，密度为50-80孔cm-2
。可以使用标准电子切割
机在皮肤测试平台上生成和打印模仿皮肤孔的密度和尺寸的微孔，如图9a-d所示。因此，具有和没有角质层结构的pegde/sf(在实施例1中制备的)被用于水接触角测量。
[0233]
结果和讨论
[0234]
发现具有孔的pegde/sf的接触角高于没有孔的pegde/sf(图10)。然而，具有孔的pegde/sf比没有孔的pegde/sf更亲水并且吸水更快。
[0235]
实施例6
[0236]
将实施例1中制备的丝人造表皮用于化妆水和乳膏的吸收研究。由于烟酰胺和甘油是大多数护肤产品中存在的两种护肤成分，因此评估了烟酰胺和甘油到丝人造表皮中的渗透。下面提供了实验方案和结果。
[0237]
首先将丝人造表皮浸入水中10min。然后，将丝人造表皮取出并用擦拭物擦拭以去除表面水。接下来，将烟酰胺或甘油施加在丝人造表皮的表面上并静置30min或4h。最后，将所得样品用于截面拉曼光谱以确定化学物到丝人造表皮的渗透。
[0238]
结果和讨论
[0239]
丝人造表皮对洗剂的吸收行为与人真皮层非常相似(图11a-d)。首先被吸收的将是具有非常快吸收速率的小分子，如水。接下来，相对较大的油基分子会以比水更慢的速率被吸收。最后，化妆水中的剩余内容物将被完全吸收。除化妆水外，还研究了丝人造表皮对乳膏的吸收行为。随着时间的推移，丝人造表皮示出对化妆水和乳膏两者的缓慢吸收(图12a-d)。在化妆水和乳膏两者完全吸收后，丝人造表皮表面没有观察到残留物。
[0240]
由丝人造表皮对洗剂的吸收性示出于图13a中。在前臂上的洗剂或乳膏残留物与丝人造表皮的接触角之间建立了相关性(图13b)。这种关系可以为研究丝人造表皮的吸收行为提供进一步的定量关系。
[0241]
护肤产品的渗透深度与其保湿性性能密切相关。发现烟酰胺和甘油两者在不同的持续时间(30min和4h)内渗透到丝人造表皮的一半深度，表明持续吸收行为类似于真实皮肤(图14)。
[0242]
实施例7
[0243]
为确定实施例1中制备的丝人造表皮的抗细菌特性，如下所述进行细菌培养测试。
[0244]
将金黄色葡萄球菌(atcc 13368)和大肠杆菌o157:h7(atcc 700728)从-80℃储存中复活，接着是在37℃下温育18h。将5ml细菌悬浮液接种到测试膜的表面上。温育24h后，通过sem观察表面，并使用image j软件对细菌进行定量。
[0245]
结果和讨论
[0246]
丝人造表皮上的细菌培养测试示出丝人造表皮易受细菌生长的影响(图15)。这与人皮肤相似，其中细菌生长会给人体带来一些疾病。因此，这里的潜在应用是供公司在此皮肤测试平台上测试抗细菌皮肤产品，诸如沐浴露、手洗剂等。
[0247]
实施例8
[0248]
为了进一步了解pegde和丝在分子水平上的相互作用，如下所述对单个psf分子链的代表性模型进行模拟。
[0249]
基于先前的报道(zhou,c.-z.et al.,proteins 2001,44,119-122)建立了44个残基的丝肽模型，其中peg化被指定为1个酪氨酸(tyr)和1个天冬酰胺(asn)残基，因为两个氨基酸侧链分别在丝中保持最高mol％的酚和游离胺基团(murphy,a.r.et al.,
j.mater.chem.2009,19,6443-6450)。分子动力学模拟在水性环境中进行。
[0250]
在残基序列中，n端、c端和接头中的残基被归类为无定形的，与结晶结构域相反。根据zhou等人(zhou,c.-z.et al.,proteins 2001,44,119-122)发表的接头6:(gagagagagagtgssgfgpyvanggysgyeyawssesdfgtgs)，基于单个sf序列，丝分子模型建立在无定形结构域的初始结构上。使用软件包sybyl 8.0(tripos associates,inc.)构建肽链，并使用gaussian 09使用6-31g*基组构建和优化pegde模型。tyr在具有酚基团的残基中保持最高的mol％。asn在具有游离胺的残基中还占较高的mol％。因此，为了创建简单的模型来说明peg化对sf分子链的影响，在44个残基肽模型中，将peg化分别指定为1个tyr和1个asn残基。优化后，pegde侧链分别在asn23和tyr29中接枝到丝肽链上。该过程在gaussview中完成，并且残基23和29的残基拓扑参数(rtp)根据peg化后的结构进行变化。在构建peg化的肽模型后，对模型进行能量最小化以优化结构。以下分子动力学模拟在水中进行，其中系统首先在尺寸为95.43x127.8x70.33nm3的水箱中进行溶剂化。对于水采用扩展的简单点电荷模型(spc/e)。然后，添加三个na离子以替换一些水分子以中和系统。最后，在温度为300k的100ns的正则系综(nvt)和温度为300k和压力为1巴的100ns的等温-等压(npt)系综下在水中进行分子动力学模拟至预平衡的系统。
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使用stride算法分析蛋白质的二级结构，该算法是vmd分子图形查看器(molecular graphics viewer)中的内置模块。所有模拟均由软件包gromacs使用amber 03力场进行。还使用gromacs分析了溶剂可及表面积(sasa)、每残留面积和能量(per-residue-area and energy)。蛋白质构型的所有代表性快照均使用vmd分子图形查看器生成。
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结果和讨论
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模拟结果示出，peg化的丝链以可扩展的二级结构(无规卷曲和转角)为主。处于平衡的水中的定量二级结构分布示出，原始sf和psf中无规卷曲的百分比分别为43.2％和54.6％，而转角百分比均约为45.4％(表5)。psf和原始sf之间的二级结构的这种转变与实施例2和3中呈现的ftir光谱和机械拉伸测试中示出的psf拉伸性的增加一致。
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表5.原始sf和psf的水中二级结构的定量分布。
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对比实施例1
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将丝人造表皮(实施例1中制备的)和商业产品vitro-的吸水能力进行比较。实验中两个膜的厚度均为30μm。
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结果和讨论
[0259]
在暴露于水的20s内，丝人造表皮示出从5s开始立即吸收，而对于vitro-吸收非常有限(图16)。这里没有将接触角用作定量数据，因为在吸收时，膜
表面形成褶皱，这给接触角的标准测量带来偏差。
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实施例9
[0261]
在前面实施例中的有希望的结果之后，制备了更大规模的丝人造表皮用于贴剂研究。贴剂如实施例1所述制备，并且膜的厚度分布和尺寸如下：边缘：74.8
±
14.08μm；中心：74.3
±
13.20μm；以及尺寸：35cm*20cm。
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结果和讨论
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获得的大面积丝人造表皮膜(图17a)示出高透明度(图17b)。