作为Toll样受体7(TLR7)激动剂的1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶化合物的制作方法

作为toll样受体7(tlr7)激动剂的1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶化合物
相关申请的交叉引用
[0001]
本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)要求于2020年1月27日提交的美国临时申请序列号62/966111的权益，将其公开内容通过引用并入本文。


背景技术：

[0002]
本公开文本涉及toll样受体7(“tlr7”)激动剂及其缀合物以及此类激动剂及其缀合物的制备和使用方法。
[0003]
toll样受体(“tlr”)是识别病原体相关分子模式(“pamp”)的受体，所述病原体相关分子模式是在某些种类的病原体中保守的小分子基序。tlr可以位于细胞表面或细胞内。通过结合其同源pamp而激活tlr传递了宿主内存在相关病原体(即，感染)的信号并且刺激宿主的免疫系统以抵抗感染。人具有10种tlr，称为tlr1、tlr2、tlr3等。
[0004]
通过激动剂激活tlr(其中tlr7是研究最多的)可以对疫苗和免疫治疗剂通过刺激总体免疫应答而在治疗除实际病原体感染以外的多种病症中的作用产生积极效果。因此，对tlr7激动剂在癌症免疫疗法中作为疫苗佐剂或作为增强剂的用途存在很大兴趣。参见例如，vasilakos and tomai 2013,sato-kaneko等人2017,smits等人2008和ota等人2019。
[0005]
tlr7(位于内体膜上的细胞内受体)识别与单链rna病毒相关的pamp。它的激活诱导i型干扰素(诸如ifnα和ifnβ)的分泌(lund等人2004)。tlr7具有两个结合位点，一个用于单链rna配体(等人2007年)，并且一个用于小分子，诸如鸟嘌呤(zhang等人2016)。
[0006]
tlr7可以与基于1h-咪唑并[4,5-c]喹啉骨架的鸟苷样合成激动剂(诸如咪喹莫特、瑞喹莫德和嘎德莫特(gardiquimod))结合并且被其激活。关于小分子tlr7激动剂的综述，参见cortez和va 2018。
[0007]
基于喋啶酮分子骨架的合成tlr7激动剂也是已知的，如由维沙莫德(vesatolimod)所例示的(desai等人2015)。
[0008]
已经公开了经常根据通式(a)的基于嘌呤样骨架的其他合成tlr7激动剂：
其中r、r’和r”是结构变量，其中r”典型地含有未经取代的或经取代的芳族或杂芳族环。
[0009]
具有嘌呤样支架的生物活性分子及其在治疗诸如纤维化、炎性障碍、癌症或病原体感染的病症中的用途的公开文本包括：akinbobuyi等人2015和2016；barberis等人2012；carson等人2014；ding等人2016、2017a和2017b；graupe等人2015；hashimoto等人2009；he等人2019a和2019b；holldack等人2012；isobe等人2009a和2012；poudel等人2019a和2019b；pryde 2010；以及young等人2019。
[0010]
基团r”可以是吡啶基：bonfanti等人2015a和2015b；halcomb等人2015；hirota等人2000；isobe等人2002、2004、2006、2009a、2009b、2011和2012；kasibhatla等人2007；koga-yamakawa等人2013；musmuca等人2009；nakamura 2012；ogita等人2007；以及yu等人2013。
[0011]
存在式(a)的6,5-稠合环系统(即与咪唑五元环稠合的嘧啶六元环)被修饰的相关分子的公开文本。(a)dellaria等人2007；jones等人2010和2012；以及pilatte等人2017披露了其中嘧啶环被吡啶环替代的化合物。(b)chen等人2011；coe等人2017；poudel等人2020a和2020b；以及zhang等人2018披露了其中咪唑环被吡唑环代替的化合物。(c)cortez等人2017和2018；li等人2018；以及mcgowan等人2016a、2016b和2017披露了其中咪唑环用吡咯环替代的化合物。
[0012]
bonfanti等人2015b和2016以及purandare等人2019披露了大环跨越嘌呤部分的两个环的tlr7调节剂：
[0013]
tlr7激动剂可以与配偶体分子缀合，所述配偶体分子可以是例如磷脂、聚(乙二醇)(“peg”)、抗体或另一种tlr(通常是tlr2)。示例性公开文本包括：carson等人2013、2015和2016；chan等人2009和2011；cortez等人2017；gadd等人2015；lioux等人2016；maj等人2015；vernejoul等人2014；以及zurawski等人2012。频繁的缀合位点是在式(a)的r”基团处。
[0014]
jensen等人2015披露了阳离子脂质媒介物用于递送tlr7激动剂的用途。
[0015]
一些tlr7激动剂(包括瑞喹莫德)是双重tlr7/tlr8激动剂。参见例如，beesu等人2017；embrechts等人2018；lioux等人2016；以及vernejoul等人2014。
[0016]
本说明书的结尾处列出了通过第一作者或发明人和年份对本文中引用的文献的完全引用。


技术实现要素：

[0017]
本说明书涉及具有1h-吡唑并[4,3d]嘧啶芳族系统的化合物，其具有作为tlr7激动剂的活性。
[0018]
在一方面，提供了一种具有根据式(i)的结构的化合物其中w是h、卤代、c
1-c3烷基、cn、(c
1-c4烷二基)oh、烷二基)oh、每个x独立地是n或cr2；r1是(c
1-c5alkyl),(c
2-c5烯基)、(c
1-c8烷二基)
0-1
(c
3-c6环烷基)、(c
1-c8烷二基)
0-1
(c
5-c
10
螺烷基)、(c
2-c8烷二基)oh、(c
2-c8烷二基)o(c
1-c3烷基)、(c
1-c4烷二基)
0-1
(5-6元杂芳基)、(c
1-c4烷二基)
0-1
苯基、(c
1-c4烷二基)cf3、(c
2-c8烷二基)n[c(＝o)](c
1-c3烷基)、(c
2-c8烷二基)
0-1
(c
3-c6环烷二基)(c
3-c6环烷基)、或(c
2-c8烷二基)nr
xry
；每个r2独立地是h、o(c
1-c3烷基)、s(c
1-c3烷基)、so2(c
1-c3烷基)、c
1-c3烷基、o(c
3-c4环烷基)、s(c
3-c4环烷基)、so2(c
3-c4环烷基)、c
3-c4环烷基、cl、f、cn或[c(＝o)]
0-1
nr
xry
；r3是h、卤代、oh、cn、nh2、nh[c(＝o)]
0-1
(c
1-c5烷基)、n(c
1-c5烷基)2、nh[c(＝o)]
0-1
(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
3-c8环烷基)、nh[c(＝o)]
0-1
(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
4-c
10
双环烷基)、nh[c(＝o)]
0-1
(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
5-c
10
螺烷基)、
n(c
3-c6环烷基)2、o(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
3-c8环烷基)、o(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
4-c8双环烷基)、o(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
5-c
10
螺烷基)、o(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
1-c6烷基)、n[c
1-c3烷基]c(＝o)(c
1-c6烷基)、nh(so2)(c
1-c5烷基)、nh(so2)(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
3-c8环烷基)、nh(so2)(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
4-c
10
双环烷基)、nh(so2)(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
5-c
10
螺烷基)、6元芳族或杂芳族部分、5元杂芳族部分、或具有以下结构的部分：r4是nh2、nh(c
1-c5烷基)、n(c
1-c5烷基)2、nh(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
3-c8环烷基)、nh(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
4-c
10
双环烷基)、nh(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
5-c
10
螺烷基)、n(c
3-c6环烷基)2、或具有以下结构的部分：r5是h、c
1-c5烷基、c
2-c5烯基、c
3-c6环烷基、卤代、o(c
1-c5烷基)、(c
1-c4烷二基)oh、(c
1-c4烷二基)o(c
1-c3烷基)、苯基、nh(c
1-c5烷基)、5或6元杂芳基、r6是nh2,(nh)
0-1
(c
1-c5烷基)、n(c
1-c5烷基)2、(nh)
0-1
(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
3-c8环烷基)、(nh)
0-1
(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
4-c
10
双环烷基)、(nh)
0-1
(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
5-c
10
螺烷基)、n(c
3-c6环烷基)2、或
具有以下结构的部分：r
x
和ry独立地是h或c
1-c3烷基或者r
x
和ry与它们所键合的氮组合以形成3至7元杂环；n是1、2或3；并且p是0、1、2或3；其中在r1、r2、r3、r4、r5和r6中烷基、烯基、环烷基、烷二基、双环烷基、螺烷基、环胺、6元芳族或杂芳族部分、5元杂芳族部分、或下式的部分任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：oh、卤代、cn、(c
1-c3烷基)、o(c
1-c3烷基)、c(＝o)(c
1-c3烷基)、so2(c
1-c3烷基)、nr
xry
、(c
1-c4烷二基)oh、(c
1-c4烷二基)o(c
1-c3烷基)；并且烷基、烯基、烷二基、环烷基、双环烷基、螺烷基、或下式的部分任选地能够具有被以下替代的ch2基团：o、so2、cf2、c(＝o)、nh、n[c(＝o)]
0-1
(c
1-c5烷基)、n[c(＝o)]
0-1
(c
1-c4烷二基)cf3、n[c(＝o)]
0-1
(c
2-c4烷二基)oh、n(so2)(c
1-c3烷基)、n(c
1-c3烷二基)
0-1
[c(＝o)]nr
xry
、或n[c(＝o)]
0-1
(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
3-c5环烷基)；条件是至少一个或r1和w包含螺烷基或螺烷二基部分并且所述式(i)的化合物不是
[0019]
本文公开的化合物具有作为tlr7激动剂的活性，并且一些化合物可以与抗体缀合，用于靶向递送至预期作用的靶组织或器官。还可以将其聚乙二醇化，以调节其药物特性。
[0020]
本文公开的化合物或其缀合物或其聚乙二醇化衍生物可以用于通过向患有顺从通过激活免疫系统进行治疗的病症的受试者施用治疗有效量的这样的化合物或其缀合物或其聚乙二醇化衍生物(尤其是与疫苗或癌症免疫治疗剂组合)治疗这样的受试者。
具体实施方式
化合物
[0021]
在一方面，本公开文本的化合物是根据式(ia)，其中r1、r2、r5和w是如关于式(i)所定义的：其中r2优选是ome。
[0022]
在另一方面，本公开文本的化合物是根据式(ib)，其中r1、r2、r3和r5是如关于式(i)所定义的：其中r2优选是ome。
[0023]
在另一方面，本公开文本的化合物是根据式(ic)，其中r1、r2、r4和r5是如关于式(i)所定义的：
其中r2优选是ome。
[0024]
在一方面，本公开文本提供了具有根据式(id)的结构的化合物其中r1是并且w是
[0025]
在另一方面，本公开文本提供了具有根据式(ie)的结构的化合物其中w’是
并且r9是h、c
1-c5烷基、(ch2)
1-2
(c
3-c5环烷基)或
[0026]
w’的具体例子包括
[0027]
基团r1的合适例子包括：
[0028]
优选地，r1选自：
[0029]
r2优选是ome或ochf2，更优选ome。
[0030]
r5优选是h、ch2oh或me，更优选h。
[0031]
其中w是并且n等于1的例子包括：
[0032]
优选地，选自：
[0033]
其中w是的例子包括：
[0034]
优选地，选自：
[0035]
在一方面，w是
[0036]
在一方面，w是
[0037]
在另一方面，r3是h、卤代、oh、cn、nh2、nh[c(＝o)]
0-1
(c
1-c5烷基)、n(c
1-c5烷基)2、nh[c(＝o)]
0-1
(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
3-c8环烷基)、nh[c(＝o)]
0-1
(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
4-c
10
双环烷基)、nh[c(＝o)]
0-1
(c
1-c4烷二基)
0-1
(c
5-c
10
螺烷基)、n(c
3-c6环烷基)2、n[c
1-c3烷基]c(＝o)(c
1-c6烷基)、6元芳族或杂芳族部分、5元杂芳族部分、或
具有以下结构的部分：
[0038]
在一方面，r1和w各自包含螺烷基或螺烷二基部分。
[0039]
在一方面，r1包含螺烷基部分并且w包含双环烷基或双环烷二基部分。
[0040]
在一方面，r1包含螺烷基部分并且w不包含螺烷基或螺烷二基部分。
[0041]
在一方面，w包含螺烷基或螺烷二基部分并且r1不包含螺烷基部分。
[0042]
通过举例而非限制的方式，下式的部分：包括
[0043]
通过举例而非限制的方式，螺烷基包括
[0044]
通过举例而非限制的方式，下式的部分：包括
[0045]
通过举例而非限制的方式，双环烷基包括
[0046]
通过举例而非限制的方式，下式的部分：包括
[0047]
以上示例性螺烷基和双环烷基以及下式的部分中的一些具有任选的取代基和/或任选地具有被o、so2等替代的一个或多个ch2基团，如在以上发明内容中所描述的。
[0048]
本文公开的化合物的具体例子示出于下表a中。所述表还提供了按下文提供的程序确定的与以下生物活性有关的数据：人tlr7报告物测定和/或在人全血中cd69基因的诱导。最右列包含分析数据(质谱，lc/ms保留时间和nmr)。在一个实施方案中，本公开文本的化合物具有(a)小于1,000nm的人tlr7(htlr7)报告物测定ec
50
值以及(b)小于1,000nm的人全血(hwb)cd69诱导ec
50
值。(在测定进行多次的情况下，所报告的值是平均值。)
药物组合物和施用
[0049]
另一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含与药学上可接受的载体或赋形剂一起配制的如本文公开的化合物或其缀合物。它可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，诸如生物制剂或小分子药物。所述药物组合物可以在组合疗法中与另一种治疗剂(尤其是抗癌剂)一起施用。
[0050]
所述药物组合物可以包含一种或多种赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。gennaro编辑,remington:the science and practice of pharmacy,第20版(lippincott williams&wilkins 2003)中教导了合适的赋形剂的选择和使用。
[0051]
优选地，药物组合物适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，可以将活性化合物包被在材料中以保护所述化合物免受可能使其失活的酸和其他天然条件的作用。短语“肠胃外施用”意指除了肠施用和外用施用之外的施用方式，通常通过注射进行，并且包括而不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼
眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。可替代地，可以经由非肠胃外途径施用所述药物组合物，所述非肠胃外途径诸如外用、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或外用。
[0052]
药物组合物可以呈无菌水性溶液或分散体的形式。也可以将它们配制成微乳液、脂质体或适合于实现高药物浓度的其他有序结构。所述组合物也可以以冻干物(用于在施用前在水中重构)的形式提供。
[0053]
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据正在被治疗的受试者和特定的施用方式而变化并且将通常是产生治疗效果的组合物量。通常，从百分比来说，此量的范围将是从约0.01％至约99％的活性成分，优选从约0.1％至约70％、最优选从约1％至约30％的活性成分，与药学上可接受的载体组合。
[0054]
调整剂量方案以提供治疗反应。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以如由情况的紧急程度所指示的按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物是尤其有利的，以便于施用和剂量的均匀。“剂量单位形式”是指适合作为单位剂量用于待治疗的受试者的物理上离散的单位；每个单位含有与所需的药物载体联合的经计算产生所需治疗反应的预定量的活性化合物。
[0055]
剂量范围是从约0.0001至100mg/kg宿主体重并且更通常0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或者在1-10mg/kg或可替代地0.1至5mg/kg的范围内。示例性治疗方案是每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3至6个月一次的施用。优选的剂量方案包括使用以下给药时间表中的一种经由静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重：(i)每四周，持续六个剂量，然后每三个月；(ii)每三周；(iii)一次3mg/kg体重，然后是每三周1mg/kg体重。在一些方法中，调整剂量以达到约1-1000μg/ml并且在一些方法中约25-300μg/ml的血浆抗体浓度。
[0056]
本发明的化合物的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状的严重程度的降低、无疾病症状时期的频率和持续时间的增加或对由于疾病困扰而引起的损伤或残疾的预防。例如，对于荷瘤受试者的治疗，相对于未经治疗的受试者，“治疗有效量”优选地抑制肿瘤生长至少约20％、更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％、仍更优选至少约80％。治疗有效量的治疗化合物可以减小受试者的肿瘤大小或在其他方面改善受试者的症状，所述受试者典型地是人，但是可以是另一种哺乳动物。在组合治疗中施用两种或更多种治疗剂的情况下，“治疗有效量”是指组合作为整体的功效，而不是单独地每种药剂的功效。
[0057]
所述药物组合物可以是控释或缓释配制品，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的可生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。参见例如，sustained and controlled release drug delivery systems,j.r.robinson,编辑,marcel dekker,inc.,纽约,1978。
[0058]
可以经由诸如(1)无针皮下注射装置；(2)微量输注泵；(3)透皮装置；(4)输注装置；和(5)渗透装置的医疗装置施用治疗组合物。
[0059]
在某些实施方案中，可以配制所述药物组合物以确保在体内的适当分布。例如，为了确保本发明的治疗化合物穿过血脑屏障，可以将它们配制在脂质体中，所述脂质体可以另外地包含靶向部分以增强向特定细胞或器官的选择性转运。
工业实用性和用途
[0060]
本文公开的tlr7激动剂化合物可以用于治疗可通过激活tlr7而改善的疾病或病症。
[0061]
在一个实施方案中，将tlr7激动剂与抗癌免疫治疗剂(也称为免疫肿瘤学药剂)组合使用。抗癌免疫治疗剂通过刺激身体的免疫系统以攻击和破坏癌细胞，尤其是通过激活t细胞来工作。免疫系统具有许多检查点(调节)分子，以帮助维持其攻击正当的靶细胞与防止其攻击健康的正常细胞之间的平衡。一些分子是刺激剂(上调剂)，这意味着它们的参与促进t细胞激活并且增强免疫应答。其他分子是抑制剂(下调剂或制止剂)，这意味着它们的参与抑制t细胞激活并且减轻免疫应答。激动性免疫治疗剂与刺激性检查点分子的结合可以导致后者的激活和针对癌细胞的免疫应答增强。相反，拮抗性免疫治疗剂与抑制性检查点分子的结合可以防止免疫系统被后者下调并且帮助维持针对癌细胞的强烈应答。刺激性检查点分子的例子是b7-1、b7-2、cd28、4-1bb(cd137)、4-1bbl、icos、cd40、icos-l、ox40、ox40l、gitr、gitrl、cd70、cd27、cd40、dr3和cd28h。抑制性检查点分子的例子是ctla-4、pd-1、pd-l1、pd-l2、lag-3、tim-3、半乳凝素9、ceacam-1、btla、cd69、半乳凝素-1、cd113、gpr56、vista、2b4、cd48、garp、pd1h、lair1、tim-1、cd96和tim-4。
[0062]
无论抗癌免疫治疗剂的作用方式是哪种，均可以通过总体上调免疫系统(诸如通过激活tlr7)来提高其有效性。因此，在一个实施方案中，本说明书提供了治疗癌症的方法，所述方法包括向患有这样的癌症的患者施用抗癌免疫治疗剂和如本文公开的tlr7激动剂的治疗有效组合。施用时间可以是同时的、顺序的或交替的。施用方式可以是全身的或局部的。可以经由缀合物以靶向的方式递送tlr7激动剂。
[0063]
可以通过如上所述的组合治疗进行治疗的癌症包括急性髓系白血病、肾上腺皮质癌、卡波西肉瘤、淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、畸胎样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、支气管肿瘤、类癌瘤、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、胆管癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、尤因肉瘤、眼癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、生殖细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、肝癌、下咽癌、胰腺癌、肾癌、喉癌、慢性髓细胞性白血病、唇和口腔癌、肺癌、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、口癌、口腔癌、骨肉瘤、卵巢癌、阴茎癌、咽喉癌、前列腺癌、直肠癌、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌。
[0064]
可以用于如本文公开的组合疗法的抗癌免疫治疗剂包括：amg 557、amp-224、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、bms 936559、西米普利单抗(cemiplimab)、cp-870893、达西珠单抗(dacetuzumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)、依诺妥珠单抗(enoblituzumab)、加利昔单抗(galiximab)、imp321、伊匹单抗、鲁卡木单抗(lucatumumab)、medi-570、medi-6383、medi-6469、莫罗单抗(muromonab)-cd3、纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗(pidilizumab)、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、曲美目单抗(tremelimumab)、乌瑞鲁单抗(urelumab)、乌托鲁单抗(utomilumab)、瓦立鲁单抗(varlilumab)、珀伽利珠单抗(vonlerolizumab)。下表b列出了它们的一个或多个替代名称(商标名称、曾用名、研究代码或同义词)和各自的靶检查点分子。
[0065]
在用tlr7激动剂的组合治疗的一个实施方案中，所述抗癌免疫治疗剂是拮抗性抗ctla-4、抗pd-1或抗pd-l1抗体。所述癌症可以是肺癌(包括非小细胞肺癌)、胰腺癌、肾癌、头颈癌、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤)、皮肤癌(包括黑素瘤和梅克尔皮肤癌)、尿路上皮癌(包括膀胱癌)、胃癌、肝细胞癌或结直肠癌。
[0066]
在用tlr7激动剂的组合治疗的另一个实施方案中，所述抗癌免疫治疗剂是拮抗性抗ctla-4抗体，优选伊匹单抗。
[0067]
在用tlr7激动剂的组合治疗的另一个实施方案中，所述抗癌免疫治疗剂是拮抗性抗pd-1抗体，优选纳武单抗或派姆单抗。
[0068]
本文公开的tlr7激动剂还可用作疫苗佐剂。
[0069]
通过参考以下实施例可以进一步理解本发明的实践，所述实施例是通过说明而非
限制的方式来提供的。分析程序nmr
[0070]
以下条件用于获得质子核磁共振(nmr)谱：使用dmso-d6或cdcl3作为溶剂和内标，在400mz或500mhz bruker仪器中采集nmr谱。通过使用adc labs的acd spectrus版本2015-01或mestrenova软件分析原始nmr数据。
[0071]
化学位移以相对于内部四甲基硅烷(tms)或相对于由氘化nmr溶剂推断出的tms位置的低场百万分率(ppm)报告。表观多重性报告为：单峰-s、双峰-d、三重峰-t、四重峰-q或多重峰-m。展现出增宽的峰进一步表示为br。积分是近似的。应当注意，积分强度、峰形、化学位移和耦合常数可以取决于溶剂、浓度、温度、ph和其他因素。此外，在nmr谱中与水或溶剂峰重叠或交换的峰可能不能提供可靠的积分强度。在一些情况下，可以使用水峰抑制获得nmr谱，水峰抑制可能导致重叠峰不可见或具有改变的形状和/或积分。液相色谱法
[0072]
使用以下制备型和分析型(lc/ms)液相色谱方法：
[0073]
lcms程序a：柱：waters xbridge c18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含10mm nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含10mm nh4oac)；温度：50℃；梯度：经3min 0％b至100％b，然后在100％b下保持0.50min；流量：1ml/min；检测：ms和uv(220nm)。
[0074]
lcms程序b：柱：waters xbridge c18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含0.1％tfa)；流动相b：95:5乙腈:水(含0.1％tfa)；温度：50℃；梯度：经3min 0％b至100％b，然后在100％b下保持0.50min；流量：1ml/min；检测：ms和uv(220nm)。
[0075]
lcms程序c：柱：waters xbridge beh c18 xp(50x2.1 mm)2.5μm；流动相a：5:95乙腈:水(含10mm nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含10mm nh4oac)；温度：50℃；梯度：经3分钟0-100％b；流量：1.1ml/min。
[0076]
lcms程序d：柱：ascentis express c18(50x2.1mm)2.7μm；流动相a：5:95乙腈:水(含10mm nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含10mm nh4oac)；温度：50℃；梯度：经3分钟0-100％b；流量：1.1ml/min。
[0077]
lcms程序e：柱：beh c18 2.1x50mm；流动相a：含0.05％tfa的水；流动相b：含0.05％tfa的乙腈；温度：50℃；梯度：经1.7min 2％-98％b；流量：0.8ml/min。
[0078]
lcms程序f：柱：waters xbridge c18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含10mm nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含10mm nh4oac)；温度：50℃；梯度：经3min 0％b至100％b，然后在100％b下保持0.50min；流量：1ml/min；检测：ms和uv(220nm)。此方法是超高效液相色谱(uplc
tm
)方法。合成-通用程序
[0079]
通常，本文公开的程序产生在吡唑并嘧啶环系统的1h或2h位置处烷基化的区域异构体(其也分别称为n1和n2区域异构体，暗指被烷基化的氮)的混合物。为简洁起见，n2区域异构体出于便利而未示出，但应理解，它们存在于最初的产物混合物中，并且稍后例如通过制备型hplc进行分离。
[0080]
可以在合成的早期分离区域异构体的混合物，并且用1h区域异构体进行剩余的合成步骤，或者可替代地，可以携带区域异构体的混合物进行合成，并且根据需要在后期进行分离。
[0081]
可以通过合成有机化学领域的技术人员熟知的多种方法制备本公开文本的化合物。这些方法包括下文描述的那些或其变体。优选的方法包括但不限于下文在以下方案中描述的那些。方案1方案1
[0082]
在方案1及其其他出现时，ra可以是例如或其他合适的部分。在方案1及其其他出现时，rb是例如c1-c3烷基。在方案1及其其他出现时，rcnhrd是伯胺或仲胺。在合成过程期间，ra、rb、rc和/或rd可以具有被保护基团掩蔽的官能团，所述保护基团在适当的时候被去除。
[0083]
可以通过以上方案1中概述的合成序列制备化合物11。还原硝基吡唑1以提供化合物2，然后用1,3-双(甲氧基羰基)-2-甲基-2-硫代异脲环化得到羟基吡唑并嘧啶3。使用bop/dbu偶联条件引入胺ranh2，并且随后使用nbs进行溴化或使用nis(步骤4)进行碘化得到溴或碘-吡唑并嘧啶5。使用苄基卤6进行烷基化得到n1和n2产物的混合物，将它们分离，从而得到n1中间体7。催化氢化(步骤6)，然后是一锅法lialh4还原和氨基甲酸酯水解，得到中间体醇9。将醇9转化为苄基氯，然后用合适的胺对其进行置换，得到化合物11。(与未经溴化的中间体4的烷基化相比，在步骤5中经溴化的中间体5的烷基化得到更好的n1/n2产物比)。方案2方案2
[0084]
可替代地，可以使用在以上方案2中描述的途径获得中间体9。将中间体3使用nbs或nis溴化或碘化，然后烷基化以得到中间体酯12。然后使用bop偶联条件进行胺化以得到中间体7。催化加氢，然后将lialh4还原至醇并且进行氨基甲酸甲酯去保护得到中间体9。方案3
[0085]
到中间体8的替代途径开始于用苄基卤6烷基化硝基吡唑1，从而得到苄基吡唑13。还原硝基，然后用1,3-双(甲氧基羰基)-2-甲基-2-硫代异脲环化得到羟基吡唑并嘧啶15，将其使用bop/dbu条件转化为适当的胺衍生物8。这在以上方案3中有说明。方案4
[0086]
到目标化合物的另一条替代途径在以上方案4中示出。从中间体15开始，将酯基还原并且使用naoh去除氨基甲酸甲酯，得到醇16。将醇16转化为氯化物，然后用合适的胺置换得到17，并且随后使用bop/dbu条件胺化得到目标分子11。方案5
[0087]
在上述方案5中，7/8或15中的甲酯水解，然后形成酰胺，可以得到相应的酰胺7a/8a或15a。7a催化氢化，然后氨基甲酸酯脱保护产生化合物7b。8a上的氨基甲酸酯脱保护得到化合物8b。最后，在15a上安装胺，然后氨基甲酸酯脱保护，得到化合物15b。合成-具体实施例
[0088]
为了进一步说明上述内容，包括以下非限制性、以下示例性合成方案。在权利要求范围内的这些实施例的变化在本领域技术人员的能力范围内，并且被认为落入本公开文本的范围内。读者应认识到，被提供本公开文本并且是相关领域的技术人员的熟练技术人员将能够在没有穷举实施例的情况下制备和使用本文公开的化合物。
[0089]
编号100及以上的化合物的分析数据可以见于表a。实施例1-化合物101
[0090]
将(s)-3-((1-(4-((2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-5-氨基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-基)氨基)己-1-醇1(us 2020/0038403 a1；31mg，0.065mmol)在d mf(1ml)中的溶液用ac2o(6.09μl，0.065mmol)处理并且在室温下搅拌1h。蒸发溶剂并且将残余物溶解在dmf(1ml)中。用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗残余物：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在4％b下保持0分钟，经20分钟4％-44％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以获得5mg化合物101。
[0091]
类似地制备以下化合物：化合物106、化合物107、化合物215(通过化合物1与甲醛的还原胺化制备)和化合物216(通过化合物1与丙酮的还原胺化制备)。实施例2-化合物110
[0092]
将1-(4-((2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-n7-丁基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺2(us 2020/0038403 a1；32mg，0.073mmol)和环丁烷甲酸(7.01μl，0.073mmol)在dmf(0.5ml)中的溶液用胡宁氏碱(hunig’s base)(0.064ml，0.366mmol)和hatu(33.4mg，0.088mmol)处理并且搅拌30min。蒸发碱并且用注射筒过滤。用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含10mm nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含10mm nh4oac)；梯度：在12％b下保持0分钟，经20分钟12％-52％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以产生化合物110。
[0093]
类似地制备以下化合物：化合物104、化合物105和化合物111。实施例3-化合物102
[0094]
将n7-丁基-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺3(us2020/0038403a1；15mg，0.04mmol)在2ml dmf中的溶液用6,6-二氟-2-氮杂螺[3.3]庚烷(10.6mg，0.08mml)处理并且在80℃下加热1h。lcms显示反应完成。将反应用注射筒过滤。用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含10mm nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含10mm nh4oac)；梯度：在21％b下保持0分钟，经20分钟21％-61％b，然后在100％b下保持4分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以产生化合物102。
[0095]
类似地制备化合物103。实施例4-化合物112
[0096]
将(s)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯4(us 2020/0038403；20mg，
0.028mmol)在1ml dmf中的溶液用1-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷(13mf，0.14mmol)处理并且在80℃下加热1h。将反应混合物用三乙胺-三氟化氢(23μl，0.14mmol)处理并且在室温下搅拌3h。将粗产物用naoh(112μl，0.559mmol)处理并且在80℃下加热2h。将反应混合物用6m hcl水溶液中和至ph 7。在旋转蒸发器中蒸发溶剂。将残余物溶解在1ml dmf中并且用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在9％b下保持0分钟，经20分钟9％-49％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以产生化合物112。
[0097]
类似地制备化合物113和化合物114。实施例5-化合物108
[0098]
步骤1.将(7-羟基-1-(4-(羟甲基)-2-甲氧基苄基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯5(us 2020/0038403 a1；300mg，0.835mmol)、螺[2.3]己-5-基甲胺盐酸盐(139mg，1.252mmol)在dmso(2ml)中的溶液用dbu(0.378ml，2.505mmol)处理。添加bop(554mg，1.252mmol)。将反应混合物在40℃下加热1h。将反应混合物用naoh(0.835ml，4.17mmol)处理并且在80℃下加热2h。将产物在反相isco上使用50g c-18柱用0-50％水/mecn(0.05％tfa)洗脱进行直接纯化并且将级分冻干以产生呈白色固体的化合物166。
[0099]
步骤2.将(4-((5-氨基-7-((螺[2.3]己-5-基甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇166(300mg，0.760mmol)在thf(2ml)中的溶液用socl2(0.111ml，1.521mmol)处理并且在室温下搅拌30min。在v-10蒸发器中蒸发溶剂并且将30mg粗氯化物溶解在dmso(0.5ml)并且用1-(2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-基)乙-1-酮(51mg，0.363mmol)和胡宁氏碱(0.127ml，0.727mmol)处理。将反应混合物在80℃下加热3h。蒸发过量碱并且用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗产物：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在12％b下保持0分钟，经20分钟12％-52％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。将含有化合物109的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以产生化合物108。
[0100]
类似地制备以下化合物：化合物109(使用螺[2.2]戊-1-基甲胺代替步骤1中的螺[2.3]己-5-基甲胺)、化合物129、化合物130、化合物131、化合物132、化合物133、化合物134、化合物135、化合物145、化合物146、化合物147、化合物148、化合物152(使用(3-环丙基
环丁基)甲胺代替步骤1中的螺[2.3]己-5-基甲胺)、化合物167、化合物168、化合物169、化合物170、化合物183和化合物241。实施例6-化合物115
[0101]
步骤1.将(7-羟基-1-(4-(羟甲基)-2-甲氧基苄基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯7(us 2020/0038403 a1；100mg，0.278mmol)、(1-氟螺[2.3]己-5-基)甲胺(71.9mg，0.557mmol)在dmso(2ml)中的溶液用dbu(0.126ml，0.835mmol)处理。添加bop(185mg，0.417mmol)。将反应混合物在40℃下加热1h。将反应混合物用naoh(0.278ml，1.391mmol)处理并且在80℃下加热2h。将产物在反相isc上使用50g c-18柱用0-50％水/mecn(0.05％tfa)洗脱直接纯化并且将所希望的级分冻干以产生84mg作为非对映异构体混合物的呈白色固体的化合物8。lc/ms[m+h]
+
＝469.1。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.34(s,1h),7.88(s,1h),7.75(d,j＝1.8hz,1h),6.98(s,1h),6.86-6.74(m,2h),5.71(s,2h),4.67-4.58(m,1h),4.45(d,j＝3.6hz,3h),3.75(d,j＝3.2hz,5h),2.80(s,1h),2.18(q,j＝9.1hz,1h),2.05-1.90(m,2h),1.85-1.76(m,1h),0.74(ddd,j＝21.0,11.2,5.9hz,2h)。
[0102]
步骤2.将socl2(0.030ml，0.407mmol)添加到化合物8(84mg，0.204mmol)在thf(1ml)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1h。在v-10蒸发器中蒸发溶剂以产生粗氯化物，将其不经进一步纯化用于下一步骤。将12mg氯化物和环丁胺(3.96mg，0.056mmol)在0.5ml dmf中在20ml密封小瓶中的溶液在70℃下加热1h。蒸发过量碱并且用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含0.05％tfa；流动相b：95:5乙腈:水(含0.05％tfa；梯度：在2％b下保持0分钟，经23分钟2％-42％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以提供6mg作为非对映异构体混合物的化合物115。
[0103]
类似地制备以下化合物：化合物116、化合物117、化合物118、化合物119、化合物120、化合物121、化合物124、化合物125、化合物126、化合物127和化合物128。实施例7-化合物136
[0104]
步骤1.将化合物7(200mg，0.557mmol)(1,1-二氟螺[2.3]己-5-基)甲胺(164mg，1.113mmol)在dmso(2ml)中的溶液用dbu(0.252ml，1.670mmol)处理。添加bop(369mg，0.835mmol)。将反应混合物在40℃下加热1h。将反应混合物用naoh(0.557ml，2.78mmol)处理并且在80℃下加热2h。将反应在反相isc上使用50g c-18柱用0-50％水/乙腈洗脱直接纯化并且将级分冻干以产生呈白色固体的所希望的产物。lc/ms，针对c
21h24
f2n6o2的预期值＝431.4，实测值[m+h]
+
＝431.2
[0105]
步骤2.将化合物10(142mg，0.330mmol)在四氢呋喃(2ml)中的溶液用socl2(0.048ml，0.660mmol)处理并且搅拌1h。在v-10蒸发器中蒸发溶剂并且将粗产物用于下一步骤。将粗氯化物和环丁胺(11.8mg，0.167mmol)在0.5ml dmf中的混合物在80℃下加热1h。蒸发过量胺并且用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在15％b下保持0分钟，经20分钟15％-55％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以产生4.2mg化合物136，作为非对映异构体混合物分离。
[0106]
类似地制备以下化合物：化合物122、化合物123、化合物137、化合物138、化合物139、化合物140、化合物141、化合物142、化合物143和化合物144。实施例8-化合物173化合物173
[0107]
步骤1.将化合物11(us 2020/0038403 a1；350mg，0.904mmol)、螺[2.3]己-5-基甲胺盐酸盐(151mg，1.355mmol)在dmso(2ml)中的溶液用dbu(0.409ml，2.71mmol)处理。添加bop(599mg，1.355mmol)。将反应混合物在40℃下加热1h。将反应混合物用naoh(0.904ml，4.52mmol)处理并且在80℃下加热2h。将反应在反相isco上使用50g c-18柱用0-50％水/乙腈(0.05％tfa)洗脱直接纯化并且将级分冻干以产生呈白色固体的化合物12。lc/ms[m+h]
+
＝395.2。1h nmr(400mhz,dmso-d6)12.34(s,1h),8.32(t,j＝5.7hz,1h),7.86(s,1h),7.80(s,1h),7.53-7.43(m,2h),6.79(d,j＝7.9hz,1h),5.81(s,2h),3.84(s,3h),3.72(t,j＝6.5hz,3h),2.77-2.65(m,1h),1.82(dd,j＝12.0,6.3hz,3h),1.66(s,1h),0.36(s,4h)。
[0108]
步骤2.将化合物12(40mg，0.098mmol)和2-甲基-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷(11mg，0.098mmol)在0.5ml dmf中的溶液用胡宁氏碱(1微升，0.294mmol)和hatu(44mg，0.118mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌30min。蒸发过量碱并且将粗产物通过反相isco使用50g c-18柱用0-50％水/乙腈(0.05％tfa)洗脱纯化并且将级分冻干以产生呈白色固体的化合物173。
[0109]
类似地制备以下化合物：化合物171、化合物172、化合物174、化合物175、化合物176、化合物177、化合物178、化合物179、化合物184、化合物190、化合物192、化合物193、化合物194、化合物195、化合物196、化合物197、化合物201、化合物222、化合物225、化合物226、化合物227、化合物228、化合物230、化合物231、化合物234、化合物235、化合物236、化合物237、化合物238、化合物239和化合物240。实施例9-化合物149
[0110]
步骤1.将化合物11(100mg，0.258mmol)(1,1-二氟螺[2.3]己-5-基)甲胺(76mg，0.516mmol)在dmso(2ml)中的溶液用dbu(0.117ml，0.774mmol)处理。添加bop(171mg，0.387mmol)。将反应混合物在40℃下加热1h，用naoh(0.258ml，1.291mmol)处理，在80℃下加热2h并且在反相isc上使用50g c-18柱用0-50％水/乙腈(0.05％tfa)洗脱直接纯化并且将级分冻干以产生91mg呈白色固体的化合物14。lc/ms[m-h]
+
＝443.2。
[0111]
步骤2.将化合物14(15mg，0.034mmol)和2-甲基-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷(3.8mg，0.034mmol)在0.5ml dmf中的溶液用胡宁氏碱(18微升，0.1mmol)和hatu(15.4mg，
0.041mmol)处理。将反应在室温下搅拌20min。蒸发过量胺并且用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在8％b下保持0分钟，经20分钟8％-48％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以获得呈白色固体的化合物149。
[0112]
类似地制备以下化合物：化合物150、化合物151、化合物159、化合物160、化合物161、化合物162、化合物163、化合物164和化合物165。实施例10-化合物153
[0113]
步骤1.将化合物7(100mg，0.278mmol)、螺[3.3]庚-2-基甲胺(69.7mg，0.557mmol)在dmso(2ml)中的溶液用dbu(0.126ml，0.835mmol)处理。添加bop(185mg，0.417mmol)。将反应混合物在40℃下加热1h，用naoh(0.278ml，1.391mmol)处理，在80℃下加热2h，并且在反相isc上使用50g c-18柱用0-50％水/mecn(0,05％tfa)洗脱直接纯化并且将级分冻干以产生呈白色固体的化合物16。lc/ms[m+h]
+
＝409.3。
[0114]
步骤2.将化合物16(190mg，0.465mmol)在thf(1ml)中的溶液用socl2(0.068ml，0.930mmol)处理并且搅拌30min。蒸发溶剂并且将粗氯化物用于下一步骤。将氯化物(15mg，0.035mmol)和环丁胺(12mg，0.176mmol)的溶液溶解在0.5ml dmf中并且在70℃下加热1h。蒸发环丁胺并且用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含0.05％tfa；流动相b：95:5乙腈:水(含0.05％tfa；梯度：在9％b下保持0分钟，经20分钟9％-49％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以提供7.9mg化合物153。
[0115]
根据此实施例类似地制备以下化合物：化合物154、化合物155、化合物156、化合物157、化合物158、化合物185和化合物186。在化合物185和化合物186的实例中，使用(6,6-二氟螺[3.3]庚-2-基)甲胺代替步骤1中的螺[3.3]庚-2-基甲胺。实施例11-化合物200
[0116]
步骤1.将化合物7(100mg，0.258mmol)、螺[3.3]庚-2-基甲胺(48.5mg，0.387mmol)在dmso(2ml)中的溶液用dbu(0.117ml，0.774mmol)处理。添加bop(171mg，0.387mmol)。将反应混合物在40℃下加热1h，用naoh(0.258ml，1.291mmol)处理，并且在80℃下加热2h。将反应产物在反相isc上使用50g c-18柱用0-50％水/乙腈(0.05％tfa)洗脱直接纯化并且将级分冻干以产生呈白色固体的化合物18。lc/ms[m+h]
+
＝422.3。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ7.59(s,1h),7.22(s,1h),7.05(d,j＝7.8hz,1h),6.46(s,0h),6.37(d,j＝7.8hz,1h),5.66(d,j＝12.0hz,4h),4.31(s,2h),4.08(s,2h),3.89(s,3h),3.53(s,1h),3.38(t,j＝6.4hz,1h),3.31(d,j＝7.6hz,1h),3.24(d,j＝7.5hz,1h),3.01(d,j＝4.4hz,0h),2.31(q,j＝7.7hz,1h),2.17(s,3h),1.93-1.86(m,2h),1.85(td,j＝12.7,11.5,3.7hz,4h),1.80(d,j＝7.3hz,3h),1.72(q,j＝7.7hz,2h),1.57-1.50(m,2h)。
[0117]
步骤2.将化合物18(20mg，0.047mmol)在dmf(0.5ml)中的溶液用2-甲基-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷(5.31mg，0.047mmol)处理，然后用hatu(21.60mg，0.057mmol)和胡宁氏碱(0.025ml，0.142mmol)处理。30min后，lcms显示反应完成。用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-？m颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在11％b下保持0分钟，经20分钟11％-51％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以产生化合物200。
[0118]
类似地制备以下化合物：化合物180、化合物181、化合物182、化合物187、化合物188、化合物189、化合物202、化合物203、化合物204和化合物205。在化合物187的实例中，使用(6,6-二氟螺[3.3]庚-2-基)甲胺代替步骤1中的螺[3.3]庚-2-基甲胺。实施例12-化合物210
[0119]
步骤1.将化合物7(100mg，0.278mmol)和(5-甲基异噁唑-3-基)甲胺(62mg，0.557mmol)在dmso(2ml)中的溶液用dbu(0.210ml，1.391mmol)处理。bop(185mg，0.417mmol)。将反应混合物在40℃下加热1h，用naoh(0.278ml，1.391mmol)处理，并且在80℃下加热2h。将反应混合物在反相isc上使用50g c-18柱用0-50％水/乙腈(0.05％tfa)洗脱直接纯化。将级分冻干以产生化合物20(白色固体)。lc/ms[m+h]+＝396.1.1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.80(t,j＝5.9hz,1h),7.84(s,1h),7.70(s,1h),6.88(s,1h),6.81-6.71(m,2h),6.11(s,1h),5.62(s,2h),4.73(d,j＝5.8hz,2h),4.39(s,2h),4.13(d,j＝5.9hz,0h),3.61(s,3h),2.29(d,j＝4.0hz,3h),1.56-1.43(m,1h),0.59-0.50(m,1h)。
[0120]
步骤2.将化合物20(70mg，0.177mmol)在thf(0.5ml)中的溶液用socl2(0.026ml，0.354mmol)处理并且在室温下搅拌30min。在v-10蒸发器中蒸发溶剂并且将粗氯化物用于下一步骤。将粗氯化物(18mg，0.043mmol)和2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷(21mg，0.217mmol)混合在0.5ml dmso中并且将反应混合物在80℃下加热1h。用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在5％b下保持0分钟，经20分钟5％-45％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以提供7.4mg呈白色固体的化合物210。
[0121]
类似地制备以下化合物：化合物211、化合物212和化合物213。实施例13-化合物214
[0122]
步骤1.将4-((7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(300mg，0.774mmol)在dmso(3.9ml)中的溶液用(5-甲基异噁唑-3-基)甲胺(174mg，1.55mmol)、bop(411mg，0.929mmol)和dbu(233μl，1.549mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌2h，用etoac稀释并且用h2o(3x)洗涤。将有机层经na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩，以得到3-甲氧基-4-((5-((甲氧基羰基)氨基)-7-(((5-甲基异噁唑-3-基)甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(353mg，95％产率)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.80(s,1h),7.99-7.93(m,1h),7.77(t,j＝5.9hz,1h),7.49(d,j＝1.5hz,1h),7.45(dd,j＝7.8,1.5hz,1h),6.62(d,j＝7.9hz,1h),6.10(d,j＝0.9hz,1h),5.80(s,2h),4.73(d,j＝5.9hz,2h),3.84(s,3h),3.82(s,3h),3.64(s,3h),2.31(s,3h)。lc/ms条件：柱：aquity uplc beh c18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相a：含0.05％tfa的100％水；流动相b：含0.05％tfa的100％乙腈；梯度：经1min 2％b至98％b，然后在98％b下保持0.50min；流量：0.8ml/min。
[0123]
步骤2.将3-甲氧基-4-((5-((甲氧基羰基)氨基)-7-(((5-甲基异噁唑-3-基)甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(125mg，0.260mmol)在二噁烷(1.3ml)中的溶液用naoh(10m水性溶液，0.2ml，2.0mmol)处理并且加热至75℃。在2h后，将反应混合物冷却至室温并且用hcl(在二噁烷中4m，0.52ml，2.1mmol)处理。将所得溶液在真空中浓缩。将残余物重新溶解在meoh/dcm中并且再次在真空中浓缩以得到粗4-((5-氨基-7-(((5-甲基异噁唑-3-基)甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸。将此粗产物(40mg)在dmf(469μl)中的溶液用2-甲基-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷
·
2hcl(17mg，0.094mmol)、diea(57μl，0.33mmol)和2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三磷杂环己烷(trioxatriphosphorinane)-2,4,6-三氧化物(在etoac中的50％溶液，55.8μl，0.094mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物用dmf(1ml)and h2o(0.2ml)稀释并且通过ptfe玻璃料过滤。用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含10mm nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含10mm nh4oac)；梯度：在5％b下保持0分钟，经20分钟5％-45％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以得到化合物214(13.7mg，58％产率)。实施例14-化合物198
[0124]
步骤1.向4-硝基-1h-吡唑-5-甲酸甲酯(5g，29.2mmol)在dmf(30ml)中的搅拌溶液中添加cs2co3(11.42g，35.1mmol)。在冰浴中冷却后，经5分钟分批添加4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(7.57g，29.2mmol)在dmf(20ml)中的溶液。允许将反应缓慢加温至室温，搅拌过夜，倒入水(150ml)中，并且用etoac(3x70ml)萃取。将合并的有机相用盐水(4x50ml)洗涤，干燥(mgso4)，过滤并且浓缩。快速色谱法(220g sio2柱，0至50％etoac的己烷溶液)得到呈固体的1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-4-硝基-1h-吡唑-5-甲酸甲酯(1.012g，2.90mmol，9.92％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
350.1。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.40(s,1h),7.57(d,j＝7.6hz,1h),7.50(s,1h),7.27(d,j＝7.9hz,1h),5.53(s,2h),3.96(s,3h),3.86(s,3h),3.82(s,3h)。
[0125]
步骤2.将1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-4-硝基-1h-吡唑-5-甲酸甲酯(2g，5.73mmol)悬浮在乙醇(100ml)中。添加碳载10％钯(100mg)，并且将反应容器抽空并且用氢气吹扫六次。将反应混合物在氢气气氛下搅拌过夜，并且通过celite
tm
过滤，并且用etoh(100ml)洗涤。将滤液蒸发至干，得到呈固体的4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-1h-吡唑-5-甲酸甲酯(1.764g，5.52mmol，96％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
320.1。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.50(s,1h),7.46(d,j＝7.7hz,1h),7.18(s,1h),6.42(d,j＝7.9hz,1h),5.55(s,2h),5.14(s,2h),3.91(s,3h),3.84(s,3h),3.70(s,3h)。
[0126]
步骤3.将4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-1h-吡唑-5-甲酸甲酯(1.75g，5.48mmol)悬浮在meoh(60ml)中。添加1,3-双(甲氧基羰基)-2-甲基-2-硫代假脲(1.243g，6.03mmol)，然后添加hoac(1.882ml，32.9mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h。
添加2ml tfa，并且将反应混合物搅拌过夜。添加naome(23.69g，110mmol，按重量计25％)，然后在室温下搅拌4h。将沉淀物滤出并且悬浮在meoh(50ml)中。添加naome(3g，13.88mmol，按重量计25％)并且将反应在室温下搅拌1小时。将反应混合物用acoh酸化，并且搅拌10min后，将产物滤出，用meoh洗涤以得到固体4-((7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(670mg，1.730mmol，32％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
388.1。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.92(s,1h),7.52(s,1h),7.47(d,j＝7.6hz,1h),6.70(d,j＝7.7hz,1h),5.76(s,2h),3.90(s,3h),3.85(s,3h),3.76(s,3h)。
[0127]
步骤4.向20ml闪烁瓶中装入4-((7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(180mg，0.465mmol)、螺[2.3]己-5-基甲胺盐酸盐(103mg，0.697mmol)、bop(308mg，0.697mmol)和dmso(1ml)。添加dbu(0.245ml，1.626mmol)。将反应混合物在60℃下搅拌2h，冷却，过滤并且使用反相快速色谱法纯化(50g c
18
柱，在含有0.05％甲酸的水中0至65％mecn)，得到3-甲氧基-4-((5-((甲氧基羰基)氨基)-7-((螺[2.3]己-5-基甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(165mg，0.343mmol，73.9％产率，白色固体)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
481.2。
[0128]
步骤5.将3-甲氧基-4-((5-((甲氧基羰基)氨基)-7-((螺[2.3]己-5-基甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(165mg，0.343mmol)溶解在二噁烷(4ml)中。添加naoh(1.030ml，5.15mmol)并且将反应在80℃下加热2小时。冷却后，将反应混合物用hcl酸化并且蒸发至干，然后将产物不经纯化使用。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
409.3。
[0129]
步骤6.向20ml闪烁瓶中装入4-((5-氨基-7-((螺[2.3]己-5-基甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸(100mg，0.086mmol)、hbtu(39.0mg，0.103mmol)、1-甲基哌啶-4-胺(19.57mg，0.171mmol)和dmf(2ml)。添加dipea(0.045ml，0.257mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h，过滤，并且用以下条件经由制备型lc/ms纯化：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在0％b下保持0分钟，经25分钟0-40％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。级分化合物198(16.4mg，0.032mmol，38％产率)。
[0130]
类似地制备化合物199。实施例15-化合物207，二三氟乙酸盐
[0131]
步骤1.向4-硝基-1h-吡唑-5-甲酸甲酯(10g，58.4mmol)在etoh(100ml)中的搅拌溶液中添加碳载10％钯(0.622g，0.584mmol)。将反应抽空并且用氢气吹扫六次，然后在氢气气氛下搅拌2天。将反应混合物通过celite
tm
过滤，用etoh(100ml)洗涤。将滤液蒸发至干并且与乙醚/己烷一起碾磨以得到呈固体的4-氨基-1h-吡唑-5-甲酸甲酯(8.012g，56.8mmol，97％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
142.1。
[0132]
步骤2.将4-氨基-1h-吡唑-5-甲酸甲酯(4g，28.3mmol)溶解在meoh(75ml)中，并且添加1,3-双(甲氧基羰基)-2-甲基-2-硫代假脲(6.43g，31.2mmol)，然后添加乙酸(6.49ml，113mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5小时。添加naome(36.7g，170mmol，按重量计25％)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，用acoh酸化，并且过滤，用水(100ml)、thf(100ml)和乙醚(100ml)洗涤，以得到呈固体的(7-羟基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(5.098g，24.37mmol，86％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
210.0。
[0133]
步骤3.将(7-羟基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(5.1g，24.38mmol)悬浮在dmf(100ml)中。添加nbs(4.34g，24.38mmol)，并且将反应在室温下搅拌1小时。将反应混合物用水(100ml)淬灭，搅拌10分钟，然后过滤，用水(100ml)、thf(2x50ml)和乙醚(2x50ml)洗涤，得到呈固体的(3-溴-7-羟基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(8.32g，23.11mmol，95％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
288.0、290.0。
[0134]
步骤4.向(3-溴-7-羟基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(2.50g，8.68mmol)在dmf(35ml)中的搅拌溶液中添加cs2co3(3.11g，9.55mmol)，然后添加4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸酯(2.249g，8.68mmol)在dmf(15ml)中的搅拌溶液。将反应混合物在室
温下搅拌过夜，用水(400ml)淬灭，并且用etoac(3x150ml)萃取。将合并的有机相用盐水(4x100ml)洗涤，干燥(mgso4)，过滤并且浓缩。使用dcm/乙醚/己烷碾磨得到4-((3-溴-7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.791g，3.07mmol，35.4％产率)，其通过lcms是80％纯的(另外20％是n2-区域异构体)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
466.1,468.1。
[0135]
步骤5.向20ml微波瓶中装入4-((3-溴-7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(500mg，1.072mmol)(大约80％纯的，被n2-区域异构体污染)、2,4,6-三甲基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三硼杂环己烷(tmb，269mg，2.145mmol)、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(ii)(235mg，0.322mmol)、k2co3(296mg，2.145mmol)、二噁烷(12ml)和水(3ml)。将反应混合物在微波炉中在120℃下加热1h并且蒸发至干。将dmso(3ml)添加到残余物中。将混合物过滤并且使用反相快速色谱法纯化(100g c
18
柱，在含有0.05tfa的水中的0至50％乙腈)得到呈灰白色固体的4-((5-氨基-7-羟基-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(117mg，0.341mmol，31.8％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
344.1。
[0136]
步骤6.向20ml闪烁瓶中装入4-((5-氨基-7-羟基-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(130mg，0.379mmol)、螺[2.3]己-5-基甲胺盐酸盐(84mg，0.568mmol)、bop(251mg，0.568mmol)和dmso(2ml)。添加dbu(0.200ml，1.325mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌1h，冷却，用水(1ml)稀释，过滤并且使用反相快速色谱法纯化(50g c
18
柱，在含有0.05％tfa的水中的0至60％乙腈)，得到呈固体的4-((5-氨基-3-甲基-7-((螺[2.3]己-5-基甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(80mg，0.183mmol，48.4％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
437.3。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.29(br t,j＝5.6hz,1h),7.80(br s,2h),7.53-7.46(m,2h),6.79(d,j＝7.7hz,1h),5.74(s,2h),3.85(s,6h),3.71(br t,j＝6.5hz,2h),2.78-2.64(m,1h),2.31(s,3h),2.03-1.93(m,2h),1.82(dd,j＝12.1,6.4hz,2h),0.35(s,4h)。
[0137]
步骤7.向20ml闪烁瓶中装入4-((5-氨基-3-甲基-7-((螺[2.3]己-5-基甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(75mg，0.172mmol)、二噁烷(2ml)和naoh(0.412ml，2.062mmol)。将反应混合物加热至80℃持续2h，冷却，用5n hcl中和，并且蒸发至干，得到呈固体的4-((5-氨基-3-甲基-7-((螺[2.3]己-5-基甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸(190mg，0.157mmol，92％产率)，将其不经纯化使用。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
423.3。
[0138]
步骤8.向20ml闪烁瓶中装入4-((5-氨基-3-甲基-7-((螺[2.3]己-5-基甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸(100mg，0.083mmol，35％纯)、hatu(37.8mg，0.099mmol)、1-甲基哌啶-4-胺(18.92mg，0.166mmol)和dmf(2ml)。添加dipea(0.043ml，0.249mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h，过滤，并且用以下条件经由制备型lc/ms纯化：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含0.05％tfa；流动相b：95:5乙腈:水(含0.05％tfa；梯度：在9％b下保持0分钟，经20分钟9％-49％b，
然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。将含有产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥，得到化合物207(43.3mg，0.058mmol，70％产率)。
[0139]
类似地制备化合物208和化合物217。实施例16-化合物218
[0140]
步骤1.将氢氧化钾(5n，24.07ml，120mmol)在水中的溶液添加到3-羟基-4-甲基苯甲酸甲酯(4g，24.07mmol)在乙腈(150ml)中的冷却(冰浴)溶液中。在0℃下搅拌5min后，添加(溴二氟甲基)膦酸二乙酯(12.85g，48.1mmol)。允许将反应混合物缓慢加温至室温并且搅拌16h。添加更多koh溶液(5n，16ml，80mmol)。将反应混合物在室温下搅拌另外30min，用水(200ml)稀释并且用etoac(3x50ml)萃取。将合并的有机相用盐水(2x50ml)洗涤，干燥(mgso4)，过滤并且浓缩。快速色谱法(sio2柱，0至10％etoac的己烷溶液)得到呈油状物的3-(二氟甲氧基)-4-甲基苯甲酸甲酯(2.552g，11.80mmol，49.0％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
217.1。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.76(dd,j＝7.8,1.7hz,1h),7.68(br.s,1h),7.51-7.10(m,2h),3.87(s,3h),2.31(s,3h)。
[0141]
步骤2.将nbs(1.811g，10.18mmol)和过氧化苯甲酰(0.448g，1.850mmol)添加到3-(二氟甲氧基)-4-甲基苯甲酸甲酯(2g，9.25mmol)在四氯化碳(20ml)中的搅拌溶液中。将反应在75℃下搅拌4h，然后在室温下搅拌过夜。将反应混合物蒸发至干并且使用快速色谱法(sio2柱，0至15％etoac的己烷溶液)纯化，得到呈油状物的4-(溴甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸甲酯(1.561g，5.29mmol，57.2％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
295.0,297.0。
5-基甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸(126mg，0.284mmol，44.4％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
445.2。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.71(s,1h),7.67(d,j＝7.9hz,1h),7.63(s,1h),7.37(t,j＝73.5hz,1h),6.80(br t,j＝5.4hz,1h),6.55(d,j＝7.9hz,1h),5.92(br s,2h),5.81(s,2h),3.57-3.51(m,2h),2.72-2.57(m,1h),1.98-1.88(m,2h),1.77-1.69(m,2h),0.37-0.25(m,4h)。
[0146]
步骤7.向20ml闪烁瓶中装入4-((5-氨基-7-((螺[2.3]己-5-基甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸(30mg，0.068mmol)、hatu(30.8mg，0.081mmol)、(3ar,6as)-2-甲基八氢吡咯并[3,4-c]吡咯(12.78mg，0.101mmol)和dmf(2ml)。添加dipea(0.035ml，0.203mmol)。将反应在室温下搅拌过夜，，过滤，并且用以下条件经由制备型lc/ms纯化：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在10％b下保持0分钟，经25分钟10％-50％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥，得到化合物218(30.3mg，81％产率)。
[0147]
类似地制备以下化合物：化合物219、化合物220、化合物221和化合物224。实施例17-化合物223
[0148]
步骤1.将cs2co3(1329mg，4.08mmol)添加到(3-溴-7-(丁基氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(700mg，2.040mmol)在dmf(5ml)中的搅拌溶液中。在冰浴中冷却后，添加4-(溴甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸甲酯(572mg，1.938mmol)在dmf(2ml)中的溶液。允许将反应混合物温热至室温并且搅拌3h。添加水(20ml)，并且将反应混合物用etoac(3x5ml)萃取。将合并的有机相用盐水(4x10ml)洗涤，干燥(mgso4)，过滤并且浓缩。快速色谱法(sio2柱，负载在dcm中，在己烷中的0至60％etoac)得到呈固体的4-((3-溴-7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸甲酯(275mg，0.493mmol，24.19％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
557.1,559.1。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.89(s,1h),7.82-7.69(m,2h),7.61-7.14(m,2h),6.87(d,j＝7.9hz,1h),5.88(s,2h),3.87(s,3h),3.64(s,3h),3.54-3.45(m,2h),1.58-1.46(m,
2h),1.19(dq,j＝15.0,7.4hz,2h),0.83(t,j＝7.3hz,3h)。
[0149]
步骤2.将4-((3-溴-7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸甲酯(275mg，0.493mmol)溶解在乙醇(15ml)中。添加10％pd/c(27mg)。将反应容器抽空并且用氢气吹扫六次。将反应混合物在h2气氛下搅拌2h，过滤并且蒸发至干。将残余物溶解在二噁烷(2ml)中。添加naoh(0.564ml，2.82mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌2h，冷却，用5n hcl中和，并且蒸发至干。将残余物溶解在meoh/水(1:1，8ml)中。通过蒸发去除甲醇。将残余的水性悬浮液过滤(用水洗涤)，以得到呈固体的4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸(54mg，0.133mmol，27％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
＝407.22。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.50(br s,1h),7.84(s,2h),7.79-7.68(m,2h),7.63-7.05(t,j＝73.2hz 1h),6.97(d,j＝7.9hz,1h),5.94(s,2h),3.54(q,j＝6.4hz,2h),1.54(quin,j＝7.2hz,2h),1.19(dq,j＝14.9,7.3hz,2h),0.84(t,j＝7.3hz,3h)。
[0150]
步骤3.向20ml闪烁瓶中装入4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸(50mg，0.123mmol)、hatu(56.1mg，0.148mmol)、2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-甲酸叔丁酯(24.39mg，0.123mmol)和dmf(2ml)。添加dipea(0.064ml，0.369mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h，用饱和nahco3溶液(10ml)淬灭，并且用etoac(3x5ml)萃取。将合并的有机相用盐水(4x5ml)洗涤，干燥(mgso4)，过滤并且浓缩。将残余物溶解在dcm(1.5ml)中并且添加tfa(0.5ml)。将反应在室温下搅拌30分钟，然后蒸发至干。将粗材料溶解在dmf(2ml)中，过滤并且用以下条件经由制备型lc/ms纯化：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在0％b下保持0分钟，经20分钟0-37％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥，得到化合物223(20.9mg，0.043mmol，35％产率)。实施例18-化合物242，三-tfa盐
[0151]
步骤1.向20ml闪烁瓶中装入4-((3-溴-7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸甲酯(750mg，1.493mmol)、螺[2.3]己-5-基甲胺盐酸盐(500mg，2.370mmol)、bop(991mg，2.240mmol)和dmso(7.5ml)。添加dbu
(0.788ml，5.23mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌过夜，倒入饱和nahco3溶液(100ml)中，并且用etoac(3x50ml)萃取。将合并的有机相用盐水(4x50ml)洗涤，干燥(mgso4)，过滤并且浓缩。快速色谱法(80g sio2柱，在己烷中的0至60％etoac)得到呈固体的4-((3-溴-5-((甲氧基羰基)氨基)-7-((螺[2.3]己-5-基甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸甲酯(286mg，0.480mmol，32.2％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
595.1,597.1。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.91(s,1h),7.78-7.71(m,2h),7.44(t,j＝5.4hz,1h),7.38(t,j＝73.2hz,1h),6.86(d,j＝7.9hz,1h),5.89(s,2h),3.86(s,3h),3.70-3.59(m,5h),2.76(br t,j＝7.2hz,1h),2.15-2.03(m,2h),1.80(dd,j＝12.1,6.4hz,2h),0.32(s,4h)。
[0152]
步骤2.向4-((3-溴-5-((甲氧基羰基)氨基)-7-((螺[2.3]己-5-基甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸甲酯(286mg，0.480mmol)在乙醇(15ml)中的搅拌溶液中添加碳载10％钯(28mg)。将反应混合物抽空并且用氢气吹扫六次，然后在氢气气氛下搅拌1小时。将反应混合物过滤并且蒸发至干，得到呈白色固体的3-(二氟甲氧基)-4-((5-((甲氧基羰基)氨基)-7-((螺[2.3]己-5-基甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(290mg，0.477mmol，99％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
517.3。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.93(br s,1h),8.92(br s,1h),8.17(s,1h),7.80(d,j＝7.9hz,1h),7.77(s,1h),7.42(t,j＝73.0hz,1h),7.11(d,j＝7.9hz,1h),6.04(s,2h),3.92(s,3h),3.90(s,3h),3.82(br t,j＝6.5hz,2h),2.89-2.75(m,1h),2.03(dd,j＝12.1,8.4hz,2h),1.92(dd,j＝12.2,6.7hz,2h),0.40(s,4h)。
[0153]
步骤3.向在0℃下的3-(二氟甲氧基)-4-((5-((甲氧基羰基)氨基)-7-((螺[2.3]己-5-基甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(250mg，0.484mmol)在thf(10ml)中的搅拌溶液中经10分钟分批添加lialh4(1.065ml，1.065mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟并且仍然会用罗谢尔盐(rochelle’s salt)(10ml，20w/v)淬灭。搅拌10分钟后，将反应混合物转移到含有50ml水的分液漏斗中并且用etoac(3x30ml)萃取。将合并的有机物用盐水(3x30ml)洗涤，干燥(mgso4)，过滤并且浓缩。快速色谱法(24g sio2柱，负载在dcm中，在dcm中的0至10％meoh)得到呈固体的(1-(2-(二氟甲氧基)-4-(羟甲基)苄基)-7-((螺[2.3]己-5-基甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(117mg，0.240mmol，49.5％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
489.2。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.65(s,1h),7.88(s,1h),7.43-6.98(m,4h),6.62(d,j＝7.9hz,1h),5.79(s,2h),5.29(t,j＝5.6hz,1h),4.46(d,j＝5.5hz,2h),3.68-3.59(m,5h),2.78(dt,j＝15.0,7.3hz,1h),2.00(dd,j＝12.0,8.5hz,2h),1.83(dd,j＝12.2,6.3hz,2h),0.35(s,4h)。
[0154]
步骤4.将(1-(2-(二氟甲氧基)-4-(羟甲基)苄基)-7-((螺[2.3]己-5-基甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(55mg，0.113mmol)溶解在dcm(2ml)中，并且添加socl2(0.025ml，0.338mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后蒸发至干。将残余物溶解在dmf(2ml)中，并且添加2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-甲酸叔丁酯(33.5mg，
0.169mmol)，然后添加dipea(0.059ml，0.338mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌4h，然后在室温下过夜，用饱和nahco3溶液(10ml)淬灭，并且用etoac(3x4ml)萃取。将合并的有机相用盐水(3x5ml)洗涤，干燥(mgso4)，过滤并且浓缩。将残余物溶解在dcm(2ml)中并且添加tfa(0.4ml)。将反应在室温下搅拌1h，然后蒸发至干并且重新溶解在二噁烷(2ml)中。添加naoh(0.338ml，1.689mmol，5n)，并且将反应在80℃下搅拌1小时，冷却，使用5n hcl中和，并且蒸发至干。将残余物溶解在dmf(2ml)中，过滤并且用以下条件经由制备型lc/ms纯化：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含0.05％tfa)；流动相b：95:5乙腈:水(含0.05％tfa)；梯度：在2％b下保持0分钟，经20分钟2％-42％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥，得到化合物242，3tfa盐(21.1mg，0.025mmol，21.7％产率)。
[0155]
类似地制备化合物243。实施例19-化合物206
[0156]
步骤1.将dbu(0.856ml，5.68mmol)添加到4-((7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(550mg，1.420mmol；参见naoh处理前的实施例2的步骤6)和(s)-3-氨基己-1-醇盐酸盐2(327mg，2.130mmol)在dmso(5ml)中的悬浮液中。将反应混合物在室温下搅拌10min，此时它变成澄清溶液。添加bop(1256mg，2.84mmol)并且将反应混合物在70℃下搅拌2h，此后lcms没有检测到任何起始材料。将此溶液用5m naoh(5ml，25.00mmol)溶液处理并且在70℃下搅拌0.5h。冷却后，将反应混合物通过注射筒滤盘过滤。将滤液在制备型反向c18柱(150g)上纯化，用乙腈:水(含0.05％tfa改性剂)＝0-50％洗脱，将所希望的级分冷冻并且冻干以得到(s)-4-((5-氨基-7-((1-羟基己-3-基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸(860.8mg，1.246mmol，88％产率)。lcms esi：针对c
20h27
n6o4的计算值＝415.2(m+h
+
)，实测值415.2(m+h
+
)。
[0157]
步骤2.将(s)-4-((5-氨基-7-((1-羟基己-3-基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸(60mg，0.145mmol)、2-甲基-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷、2hcl(53.6mg，0.290mmol)在dmf(1ml)中的混合物用胡宁氏碱(0.126ml，0.724mmol)处理，然后用bop(96mg，0.217mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌3h。用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含
nh4oac；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在5％b下保持0分钟，经25分钟5％-45％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥并且产生化合物206(15.5mg，0.030mmol，20.88％产率)。
[0158]
类似地制备以下化合物：化合物209、化合物229、化合物232和化合物233。实施例20-化合物244化合物244
[0159]
步骤1.将在室温下的肼甲酸叔丁酯(12.75g，96mmol)和dipea在dmf(24ml)中的溶液通过经由加液漏斗经1小时逐滴添加在24ml dmf中的4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(5g，19.30mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌过夜。添加etoac(135ml)和h2o(75ml)并且将两相混合物搅拌30分钟。将反应混合物倒入分液漏斗中并且去除水层。将有机层用另外2份h2o(75ml)、2份10％licl溶液(75ml)洗涤，经na2so4干燥并且浓缩。柱色谱法(isco，220g sio2，0％ch2cl2(5min)，然后15％etoac-ch2cl2)提供呈澄清油状物的2-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)肼-1-甲酸叔丁酯(3.85g)。
lc/ms(m+h)311.2；lc rt＝0.80min(程序e)。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ7.64(dd,j＝7.7,1.5hz,1h),7.56(d,j＝1.5hz,1h),7.37(d,j＝7.7hz,1h),6.08-5.87(m,1h),4.07(s,2h),3.94(d,j＝4.6hz,6h),1.50-1.40(m,9h)。
[0160]
步骤2.在室温下将2-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)肼-1-甲酸叔丁酯(25.4g，82mmol)溶解在meoh(164ml)中。添加4n hcl-二噁烷(123ml，59.5mmol)并且将反应在室温下搅拌过夜。通过过滤收集白色沉淀物并且干燥以得到4-(肼基甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯二盐酸盐(20g)。lc/ms(m+h)211.1；lc rt＝0.51min(程序f)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.12(br s),7.62-7.55(m,1h),7.53-7.47(m,2h),4.10(s,2h),3.88(s,3h),3.87(s,3h)。
[0161]
步骤3.将(e)-n,n-二甲基-2-硝基乙-1-胺(46.4g，400mmol)和吡啶(420ml，5195mmol)在ch2cl2(799ml)中的溶液冷却指-10℃并且用2-氯-2-氧代乙酸乙酯(51.4ml，460mmol)缓慢处理。允许将反应混合物经2h温热至25℃并且搅拌过夜。通过旋转蒸发除去ch2cl2并且一次性添加4-(肼基甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯二盐酸盐(31.7g，112mmol)。将溶液在室温下搅拌2h并且在真空下除去溶剂。将残余物用水、1n hcl水溶液洗涤并且用etoac萃取。将有机层经na2so4干燥并且浓缩。将残余物溶解在ch2cl2中，通过短硅胶柱并且从乙醇中重结晶以得到1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-4-硝基-1h-吡唑-5-甲酸乙酯(29.4g)。lc/ms(m+na)386.0；lc rt＝0.98min(程序f)。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.06(s,1h),7.64(dd,j＝7.9,1.5hz,1h),7.56(d,j＝1.5hz,1h),7.13(d,j＝7.8hz,1h),5.53(s,2h),4.45(q,j＝7.2hz,2h),3.94(s,3h),3.88(s,3h),1.37(t,j＝7.2hz,3h)。
[0162]
步骤4.在室温下将甲酸铵(1.41g，22.4mmol)和锌(0.915g，14.0mmol)添加到1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-4-硝基-1h-吡唑-5-甲酸乙酯(2.03g，5.60mmol)在thf(4.67ml)/meoh(4.7ml)中的溶液中。将反应在室温下搅拌2h并且添加另外一份甲酸铵(0.353g，5.60mmol)和锌(0.229g，4.67mmol)。1h后，将反应混合物通过celite
tm
垫过滤，并且将滤液在真空中浓缩以得到白色固体。将固体悬浮在etoac中，搅拌30分钟并且过滤。然后将有机滤液在真空中浓缩以得到4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-1h-吡唑-5-甲酸乙酯(1.83g，98％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.50-7.49(m,1h),7.48-7.44(m,1h),7.18(s,1h),6.39(d,j＝7.8hz,1h),5.53(s,2h),5.10(s,2h),4.14(q,j＝7.1hz,2h),3.90(s,3h),3.83(s,3h),1.13(t,j＝7.1hz,3h)。lc/ms条件：柱：aquity uplc beh c18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相a：含0.05％tfa的100％水；流动相b：含0.05％tfa的100％乙腈；梯度：经1min 2％b至98％b，然后在98％b下保持0.50min；流量：0.8ml/min。lc rt：0.86min。lcms(m+h)＝334.2。
[0163]
步骤5.将4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-1h-吡唑-5-甲酸乙酯(1.65g，4.95mmol)溶解在chcl3(49.5ml)中并且冷却至0℃。将nbs(0.925g，5.20mmol)一次性添加到混合物中。15分钟后，将反应用chcl3稀释并且与10％na2s2o3水溶液一起剧烈搅拌
10分钟。将有机相分离，用h2o洗涤，经mgso4过滤并且浓缩。将粗产物通过柱色谱法纯化(80g sio2，0至50％etoac-己烷梯度洗脱)以得到呈白色固体的4-氨基-3-溴-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-1h-吡唑-5-甲酸乙酯(1.32g)。lc/ms(m+h)412.2/414.2；lc rt＝1.02min(程序e)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.61-7.41(m,2h),6.55(d,j＝8.3hz,1h),5.56(s,2h),5.02(s,2h),4.20(q,j＝7.1hz,2h),3.90(s,3h),3.85(s,3h),1.15(t,j＝7.1hz,3h)。
[0164]
步骤6.将4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酸乙酯(741.2mg，67.1％产率)、k2co3(1.098g，7.94mmol)和2,4,6-三甲基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三硼杂环己烷(在thf中3.5m)(1.816ml，6.36mmol)悬浮在二噁烷(26.5ml):水(5.30ml)(5:1)中。将n2流鼓泡通过反应混合物持续5min，然后添加pdcl2(dppf)-ch2cl2加合物(0.052g，0.064mmol)并且继续另外4min，然后密封反应并且加热至90℃。3h后，添加另外份的2,4,6-三甲基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三硼杂环己烷(在thf中3.5m)(0.908ml，3.18mmol)和pdcl2(dppf)-ch2cl2加合物(0.052g，0.064mmol)并且将反应在100℃下搅拌16小时。将冷却的反应混合物用100ml etoac稀释并且通过celite
tm
过滤，用另外的etoac洗涤。将粗产物在4g celite
tm
上浓缩。柱色谱法(80g sio2，0至30％etoac-ch2cl2梯度洗脱)得到呈奶油色固体的预期产物4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酸乙酯(741mg)。lc/ms(m+h)348.2；lc rt＝0.89min(程序e)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.49(d,j＝1.5hz,1h),7.46(dd,j＝7.9,1.5hz,1h),6.40(d,j＝7.8hz,1h),5.48(s,2h),4.94-4.86(m,2h),4.14(q,j＝7.0hz,2h),3.90(s,3h),3.84(s,3h),2.10(s,3h),1.15-1.08(m,3h)。
[0165]
步骤7.将4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酸乙酯(742mg，2.136mmol)悬浮在meoh(10.800ml)中并且在剧烈搅拌下温和加热以溶解材料。添加1,3-双-(甲氧基羰基)-2-甲基-2-硫代假脲(661mg，3.20mmol)，然后添加acoh(0.611ml，10.68mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16h。添加另外一份acoh(0.049ml，0.854mmol)，然后在室温下搅拌另外72h，然后添加naome(在meoh中25％wt)(5.69ml，25.6mmol)。搅拌3h后，将反应混合物用acoh重新酸化。通过过滤收集产物，风干10分钟并且在化学干燥炉中彻底干燥以得到呈奶油色固体的4-((7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(722.0mg)。lc/ms(m+h)402.3；lc rt＝0.86min(程序e)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.58-11.17(m,2h),7.51(d,j＝1.4hz,1h),7.49-7.42(m,1h),6.67(d,j＝7.9hz,1h),5.67(s,2h),3.90(s,3h),3.84(s,3h),3.71(s,3h),2.31(s,3h)。
[0166]
步骤8.在室温下将4-((7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(200mg，0.498mmol)和bop(331mg，0.747mmol)悬浮在dmf(2491μl)中。添加丁-1-胺(64.0μl，0.648mmol)，然后添加dbu(3当量)(225μl，1.495mmol)，此后反应混合物变得均匀。将反应混合物在40℃下搅拌16h。将另外的丁-1-胺(64.0μl，0.648mmol)、bop(331mg，0.747mmol)和dbu(3当量)(225μl，1.495mmol)添加到反应中，并且将其在40℃下搅拌2h，然后冷却至室温。将反应混合物在etoac与饱和nahco3之
间分配。将有机层除去，并且将水相用另外三份etoac萃取。将合并的有机物用10％licl溶液洗涤，经na2so4干燥并且浓缩。将粗产物通过柱色谱法纯化(24g sio2，0至80％etoac-己烷梯度洗脱)以得到4-((7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(117.4mg)。lc/ms(m+h)457.4；lc rt＝0.84min(程序e)。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ7.66(d,j＝1.3hz,1h),7.64(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),7.11(d,j＝7.8hz,1h),5.64(s,2h),4.04(s,3h),3.94(s,3h),3.86(s,3h),3.54-3.44(m,2h),2.43(s,3h),1.50(quin,j＝7.3hz,2h),1.32-1.19(m,2h),0.94-0.87(m,3h)。
[0167]
步骤9.在室温下将4-((7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(117mg，0.256mmol)溶解在thf(854μl)中。逐滴添加lialh4(在thf中1m)(256μl，0.256mmol)并且将反应在室温下搅拌20min。添加另外的lialh4(在thf中1m)(256μl，0.256mmol)并且将反应搅拌另外20min。将反应混合物用meoh淬灭，用罗谢尔盐和etoac稀释并且搅拌16h。将有机层分离并且将水相用另外三份etoac萃取。将合并的有机层经na2so4干燥并且浓缩以得到(7-(丁基氨基)-1-(4-(羟甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(86.6mg)。lc/ms(m+h)429.4；lc rt＝0.74min(程序e)。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ7.04(s,1h),6.99(d,j＝7.8hz,1h),6.91-6.86(m,1h),5.58(s,3h),4.70(s,2h),3.97(s,3h),3.81(s,3h),3.50(td,j＝6.9,5.6hz,2h),2.54(s,3h),1.54-1.43(m,2h),1.31-1.22(m,2h),0.94-0.88(m,3h)。
[0168]
步骤10.在室温下将(7-(丁基氨基)-1-(4-(羟甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(86mg，0.201mmol)溶解在thf(1004μl)中。添加socl2(73.2μl，1.004mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h并且浓缩以得到(7-(丁基氨基)-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(57.1mg)。lc/ms(m+h)447.4；lc rt＝0.89min(程序e)。
[0169]
步骤11.在室温下将(7-(丁基氨基)-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(28mg，0.063mmol)和1-(2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-基)乙-1-酮盐酸盐(33.2mg，0.188mmol)溶解在乙腈(626μl)中。添加dipea(32.8μl，0.188mmol)并且将反应混合物加热至50℃持续16h。将反应混合物浓缩并且将残余物重新溶解在二噁烷(0.7ml)中，向其中添加naoh溶液(10m，125μl，1.253mmol)。将反应混合物加热至80℃持续3h，冷却至室温并且浓缩。将残余物溶解在dmf:h2o:acoh(6:2:2,1ml)中，通过ptfe玻璃料过滤并且用以下条件经由制备型lc/ms纯化：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在10％b下保持0分钟，经25分钟10％-50％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以得到含有0.8当量acoh的化合物244(4.7mg)。实施例21-化合物269
1h-吡唑-5-甲酸乙酯(741mg)。lc/ms(m+h)348.2；lc rt＝0.89min(方法a)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.49(d,j＝1.5hz,1h),7.46(dd,j＝7.9,1.5hz,1h),6.40(d,j＝7.8hz,1h),5.48(s,2h),4.94-4.86(m,2h),4.14(q,j＝7.0hz,2h),3.90(s,3h),3.84(s,3h),2.10(s,3h),1.15-1.08(m,3h)。
[0172]
步骤3.将4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酸乙酯(742mg，2.136mmol)悬浮在meoh(10.800ml)中并且在剧烈搅拌下温和加热以溶解材料。添加1,3-双-(甲氧基羰基)-2-甲基-2-硫代假脲(661mg，3.20mmol)，然后添加acoh(0.611ml，10.68mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16h。添加另外一份acoh(0.049ml，0.854mmol)并且将反应在室温下搅拌另外72h，然后添加naome(在meoh中25％wt)(5.69ml，25.6mmol)。搅拌3h后，将反应混合物用acoh重新酸化直到呈酸性。通过过滤收集产物，风干10分钟并且在化学干燥炉中彻底干燥以得到呈奶油色固体的4-((7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(722.0mg)。lc/ms(m+h)402.3；lc rt＝0.86min(方法a)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.58-11.17(m,2h),7.51(d,j＝1.4hz,1h),7.49-7.42(m,1h),6.67(d,j＝7.9hz,1h),5.67(s,2h),3.90(s,3h),3.84(s,3h),3.71(s,3h),2.31(s,3h)。
[0173]
步骤4.在室温下将4-((7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(300mg，0.747mmol)、(s)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-胺hcl(381mg，0.972mmol)和bop(496mg，1.121mmol)悬浮在dmf(3737μl)中。添加dbu(4当量)(451μl，2.99mmol)后，反应混合物变得均匀并且加热至40℃。15min后，添加另外一份dbu(2当量)(225μl，1.495mmol)并且将反应在40℃下搅拌16h。添加(s)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-胺hcl(381mg，0.972mmol)、bop(496mg，1.121)和dbu(4当量)(451μl，2.99mmol)并且将反应搅拌另外48h。将反应混合物用etoac稀释并且用h2o(2x)和10％licl溶液(1x)洗涤。将有机相经na2so4干燥并且浓缩。将粗产物通过柱色谱法纯化(24g sio2，0至80％etoac-己烷梯度洗脱)，然后进一步纯化(12g sio2，0至70％etoac-己烷梯度洗脱)以提供(s)-4-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(270.6mg)。lc/ms(m+h)739.7；lc rt＝1.04min(方法a)。
[0174]
步骤5.在氮气气氛下向(s)-4-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(500mg，0.677mmol)在干thf(10ml)和meoh(3ml)中的溶液中添加libh4(1.692ml，3.38mmol)。将反应混合物在45℃下加热24h。将反应混合物在nh4cl水溶液与etoac之间分配。将有机层用水和盐水洗涤，经无水na2so4干燥并且浓缩。将粗产物通过combi快速色谱法纯化(60-120硅胶；在石油醚中的10％-100％乙酸乙酯)以提供呈浅黄色固体的(s)-(4-((5-氨基-7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(150mg，0.230mmol，34.0％产率)。
lc/ms(m+h)653.4。
[0175]
步骤6：向(s)-(4-((5-氨基-7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(150mg，0.230mmol)在t hf(0.5ml)中的搅拌溶液中添加socl2(0.1ml，1.370mmol)。将反应混合物在氮气气氛下在0℃下搅拌1h并且随后在真空中浓缩以提供呈浅黄色固体的(s)-n7-(1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺，将其不经进一步纯化用于下一步骤。lc/ms(m+h)671.4。
[0176]
步骤7：向(s)-n7-(1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺(150mg，0.223mmol)在dmf(2ml)中的搅拌溶液中添加2-甲基-2-氮杂螺[3.3]庚-6-胺hcl(72.7mg，0.447mmol)和k2co3(61.8mg，0.447mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌3h并且随后过滤。将滤液在真空中浓缩以提供呈浅棕色油状物的(s)-n7-(1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)-1-(2-甲氧基-4-(((2-甲基-2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)氨基)甲基)苄基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺，将其不经进一步纯化用于下一步骤。lc/ms(m+h)761.5。
[0177]
步骤8：向(s)-n7-(1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)-1-(2-甲氧基-4-(((2-甲基-2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)氨基)甲基)苄基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺(150mg，0.197mmol)在meoh(3ml)中的搅拌溶液中添加hcl(0.3ml，9.87mmol)。将反应混合物在氮气气氛下在0℃至室温下搅拌2h并且随后在真空中浓缩。将残余物通过制备型hplc在以下条件下纯化(柱：柱：ascentis express c18(50x2.1mm)，2.7μm；流动相a：5:95乙腈:水(含10mm nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含10mm nh4oac)；温度：50℃；梯度：经3分钟0-100％b；流量：1.1ml/min。注射2条件：柱：ascentis express c18(50x2.1mm)，2.7μm；流动相a：5:95乙腈:水(含0.1％tfa)；流动相b：95:5乙腈:水(含0.1％tfa)；温度：50℃；梯度：经3分钟0-100％b；流量：1.1ml/min)以提供化合物269(14.6mg，0.027mmo l，13.75％产率)。实施例22-化合物245
[0178]
步骤1.将(7-羟基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(2g，9.56mmol)和selectfluor
tm
(10.16g，28.7mmol)悬浮在mecn(20ml)中。添加乙酸(2ml)。将反应混合物在70℃下搅拌24小时，冷却，并且倒入水(100ml)中。将所得混合物在冰箱(-20℃)中静置30分钟。通过过滤收集沉淀的产物，用水(40ml)洗涤，得到呈固体的(3-氟-7-羟基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(1311mg，5.77mmol，60.4％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
＝228.2。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.69(s,1h),11.63(s,1h),11.26(s,1h),3.76(s,3h)。
[0179]
步骤2.将(3-氟-7-羟基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(1.311g，5.77mmol)和cs2co3(2.257g，6.93mmol)在dmf(5ml)中的搅拌悬浮液在冰浴中冷却。添加4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.495g，5.77mmol)在dmf(5ml)中的溶液。允许将反应混合物缓慢温热至室温，搅拌过夜并且过滤。将滤液在genevac装置中蒸发。将沉淀物用thf(100ml)和水(100ml)洗涤，并且分开收集滤液。将最终沉淀物与来自dmf滤液和thf滤液的干燥材料合并，并且蒸发到二氧化硅上，然后使用快速色谱法纯化(80g sio2柱，在dcm中的0至10％meoh)，得到呈固体的4-((3-氟-7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.03g，2.54mmol，44.0％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
＝406.1。
[0180]
步骤3.向40ml闪烁瓶中装入4-((3-氟-7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1013mg，2.499mmol)、(s)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-胺(1333mg，3.75mmol)、bop(1658mg，3.75mmol)、dbu(1.13ml，7.5mmol)和dmso(10ml)。将反应混合物在60℃下搅拌2h，冷却，倒入饱和nahco3溶液(150ml)中并且萃取到etoac(3x60ml)中。将合并的有机相用盐水(4x50ml)洗涤，干燥(mgso4)，过滤并且浓缩。将粗材料使用快速色谱法纯化(80g sio2柱，在己烷中的0至70％
etoac)，得到呈油状物的(s)-4-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-氟-5-((甲氧基羰基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(493mg，0.664mmol，26.6％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
＝743.3。
[0181]
步骤4.将(s)-4-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-氟-5-((甲氧基羰基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(493mg，0.664mmol)在thf(50ml)中的溶液在冰浴中冷却。添加lialh4(0.697ml，1.394mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌15min。添加罗谢尔盐(20ml，20w/v)，并且在室温下搅拌15分钟后，将反应混合物倒入水(100ml)中并且萃取到etoac(3x50ml)中。将合并的有机相用盐水(3x40ml)洗涤，干燥(mgso4)，过滤并且浓缩。将粗材料使用快速色谱法纯化(24g sio2柱，在己烷中的0至100％etoac)，得到呈固体的(s)-(3-氟-7-((1-羟基己-3-基)氨基)-1-(4-(羟甲基)-2-甲氧基苄基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(125mg，0.262mmol，39.5％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]
+
＝477.2。
[0182]
步骤5.向(s)-(3-氟-7-((1-羟基己-3-基)氨基)-1-(4-(羟甲基)-2-甲氧基苄基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(40mg，0.084mmol)在dcm(2ml)中的搅拌溶液中添加dipea(0.044ml，0.252mmol)和甲磺酰基氯(0.013ml，0.168mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30min并且然后蒸发至干。将残余物溶解在dmf(2ml)中，并且添加2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-甲酸叔丁酯(33.3mg，0.168mmol)和dipea(0.044ml，0.252mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌2h，冷却，用饱和nahco3溶液(10ml)淬灭，并且萃取到etoac(3x5ml)中。将合并的有机相用盐水(4x5ml)洗涤，干燥(mgso4)，过滤并且浓缩。将残余物溶解在dcm(2ml)中并且添加tfa(0.4ml)。将反应混合物在室温下搅拌过夜并且然后蒸发至干。然后将残余物溶解在二噁烷(2ml)中。添加naoh(0.420ml，2.099mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌2h，冷却，用5n hcl酸化，并且蒸发至干。将粗材料溶解在dmf(2ml)中，过滤并且用以下条件经由制备型lc/ms纯化：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在4％b下保持0分钟，经20分钟4％-44％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥，得到化合物245(6.1mg，0.012mmol，14.14％产率)。实施例23-化合物246
[0183]
步骤1.将4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-1h-吡唑-5-甲酸乙酯(1.65g，4.95mmol)溶解在chcl3(49.5ml)中并且冷却至0℃。将nbs(0.925g，5.20mmol)一次性添加到反应混合物中。15分钟后，将反应用chcl3稀释并且与10％na2s2o3水溶液一起剧烈搅拌10分钟。将有机相分离，用h2o洗涤，经mgso4过滤并且浓缩。将粗产物通过柱色谱法纯化(80g sio2，0至50％etoac-己烷梯度洗脱)以得到呈白色固体的4-氨基-3-溴-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-1h-吡唑-5-甲酸乙酯(1.32g)。lc/ms(m+h)412.2/414.2；lc rt＝1.02min(方法a)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.61-7.41(m,2h),6.55(d,j＝8.3hz,1h),5.56(s,2h),5.02(s,2h),4.20(q,j＝7.1hz,2h),3.90(s,3h),3.85(s,3h),1.15(t,j＝7.1hz,3h)。
[0184]
步骤2.将4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酸乙酯(741.2mg，67.1％产率)、k2co3(1.098g，7.94mmol)和2,4,6-三甲基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三硼杂环己烷(在thf中3.5m)(1.816ml，6.36mmol)悬浮在二噁烷(26.5ml):水(5.30ml)(5:1)中。将n2流鼓泡通过反应混合物持续5min，然后添加pdcl2(dppf)-ch2cl2加合物(0.052g，0.064mmol)并且继续另外4min，然后密封反应容器并且加热至90℃。3h后，添加另外一份2,4,6-三甲基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三硼杂环己烷(在thf中3.5m)(0.908ml，3.18mmol)和pdcl2(dppf)-ch2cl2加合物(0.052g，0.064mmol)并且将反应混合物在100℃下搅拌16小时。将冷却的反应混合物用100ml etoac稀释并且通过celite
tm
过滤，用另外的etoac洗涤。将粗产物在4g celite
tm
上浓缩。柱色谱法(80g sio2，0至30％etoac-ch2cl2梯度洗脱)得到呈奶油色固体的预期产物4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酸乙酯(741mg)。
lc/ms(m+h)348.2；lc rt＝0.89min(方法a)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.49(d,j＝1.5hz,1h),7.46(dd,j＝7.9,1.5hz,1h),6.40(d,j＝7.8hz,1h),5.48(s,2h),4.94-4.86(m,2h),4.14(q,j＝7.0hz,2h),3.90(s,3h),3.84(s,3h),2.10(s,3h),1.15-1.08(m,3h)。
[0185]
步骤3.将4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-3-甲基-1h-吡唑-5-甲酸乙酯(742mg，2.136mmol)悬浮在meoh(10.800ml)中并且在剧烈搅拌下温和加热以溶解材料。添加1,3-双-(甲氧基羰基)-2-甲基-2-硫代假脲(661mg，3.20mmol)，然后添加acoh(0.611ml，10.68mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16h。添加另外一份acoh(0.049ml，0.854mmol)并且将反应在室温下搅拌另外72h，然后添加naome(在meoh中25％wt)(5.69ml，25.6mmol)。搅拌3h后，将反应混合物用acoh重新酸化直到呈酸性。通过过滤收集产物，风干10分钟并且在化学干燥炉中彻底干燥以得到呈奶油色固体的4-((7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(722.0mg)。lc/ms(m+h)402.3；lc rt＝0.86min(方法a)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.58-11.17(m,2h),7.51(d,j＝1.4hz,1h),7.49-7.42(m,1h),6.67(d,j＝7.9hz,1h),5.67(s,2h),3.90(s,3h),3.84(s,3h),3.71(s,3h),2.31(s,3h)。
[0186]
步骤4.在室温下将4-((7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(300mg，0.747mmol)、(s)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-胺hcl(381mg，0.972mmol)和bop(496mg，1.121mmol)悬浮在dmf(3737μl)中。添加dbu(4当量)(451μl，2.99mmol)后，反应混合物变得均匀并且加热至40℃。15min后，添加另外一份dbu(2当量)(225μl，1.495mmol)并且将反应在40℃下搅拌16h。添加(s)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-胺hcl(381mg，0.972mmol)、bop(496mg，1.121)和dbu(4当量)(451μl，2.99mmol)并且将反应搅拌另外48h。将反应混合物用etoac稀释并且用h2o(2x)和10％licl溶液(1x)洗涤。将有机相经na2so4干燥并且浓缩。将粗产物通过柱色谱法纯化(24g sio2，0至80％etoac-己烷梯度洗脱)，然后进一步纯化(12g sio2，0至70％etoac-己烷梯度洗脱)以提供(s)-4-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(270.6mg)。lc/ms(m+h)739.7；lc rt＝1.04min(方法a)。
[0187]
步骤5.在室温下将(s)-4-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(270mg，0.365mmol)溶解在thf(3654μl)中。经5分钟逐滴添加lialh4(731μl，0.731mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15min并且用meoh和罗谢尔盐淬灭。添加etoac并且将混合物搅拌3h，直到层变得澄清。将有机相除去，并且将水层用另外三份etoac萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，经na2so4干燥并且浓缩。柱色谱法(12g sio2，0至100％etoac-己烷梯度洗脱，然后0至20％meoh-ch2cl2)提供预期材料(s)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-(4-(羟甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(61.7mg)。lc/ms(m+h)711.4；lc rt＝1.08min(方法a)。
[0188]
步骤6.在室温下将(s)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-(4-(羟甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(60mg，0.084mmol)溶解在ch2cl2(844μl)中。添加socl2(30.8μl，0.422mmol)并且反应h。浓缩得到预期产物(s)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(56.6mg)。lc/ms(m+h)729.3；lc rt＝1.18min(方法a)。
[0189]
步骤7.在室温下将(s)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(45mg，0.02mmol)溶解在乙腈(620μl)中。添加2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-甲酸叔丁酯hcl(29.0mg，0.123mmol)，然后添加dipea(21.55μl，0.123mmol)。将反应混合物在80℃下加热16h并且浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化(4g sio2，0-5％meoh-ch2cl2梯度)。使一些副产物通过色谱柱并且获得部分纯化的(s)-6-(4-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苄基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-甲酸叔丁酯(42mg)。lc/ms(m+h)892.7；lc rt＝0.995min(方法a)。
[0190]
步骤8.在室温下将(s)-6-(4-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苄基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-甲酸叔丁酯(42mg，0.047mmol)溶解在ch2cl2(471μl)中。添加tfa(100μl)。2h后，将反应在n2流下浓缩并且重新溶解在二噁烷(470μl)中。添加三乙胺三氟化氢(16.79μl，0.103mmol)并且将反应加热至70℃。45min后，添加10m naoh水溶液(61.3μl，0.613mmol)。将反应混合物在70℃下搅拌16h，用acoh(54μl)淬灭，在n2流下浓缩，用dmf-h2o稀释，通过ptfe玻璃料过滤并且经由制备型lc/ms用这些条件纯化：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在1％b下保持0min，经20min 1％-41％b，然后在100％b下保持0min；流速：20ml/min；柱温：25℃。将含有产物的级分-通过ms信号触发的收集-合并，并且通过离心蒸发干燥以提供化合物246(2.9mg)。实施例24-化合物247
[0191]
步骤1.将4-((7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(510mg，1.32mmol；us 2020/0038403 a1，图2a，化合物16)在dmso(6.6ml)中的溶液用(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲胺
·
hcl(236mg，1.58mmol)、bop(698mg，1.58mmol)和dbu(595μl，3.95mmol)处理。将反应在室温下搅拌。16h后，添加另外的(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲胺
·
hcl(50mg，0.33mmol)、bop(50mg，0.11mmol)和dbu(200μl，1.33mmol)并且将反应在室温下搅拌2。将反应混合物用etoac稀释并且用h2o(4x)洗涤。将有机层吸附到celite
tm
上并且经由柱色谱法纯化(100g c18 gold柱；流动相a：5:95乙腈:水(含0.05％tfa)；流动相b：95:5乙腈:水(含0.05％tfa)；流速：60ml/min，20％-60％梯度)。将含有所希望的级分合并，用hcl(1m的h2o溶液，2ml，2mmol)处理并且在真空中浓缩，以得到3-甲氧基-4-((5-((甲氧基羰基)氨基)-7-(((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(382mg，60％产率)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.72-9.70(m,1h),7.96-7.94(m,1h),7.83-7.76(m,1h),7.49(d,j＝1.4hz,1h),7.46(dd,j＝7.8,1.5hz,1h),6.74(d,j＝7.8hz,1h),5.79(s,2h),4.86(d,j＝5.8hz,2h),3.86(s,3h),3.84(s,3h),3.60(s,3h),2.54(s,3h)。lc rt:0.64min.lc/ms[m+h]
+
483.3(方法e)。
[0192]
步骤2.将3-甲氧基-4-((5-((甲氧基羰基)氨基)-7-(((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(382mg，0.791mmol)在二噁烷(9.0ml)中的溶液用naoh(10m水溶液，0.32ml，3.2mmol)处理并且加热至40℃。30分钟后，使温度升高至60℃。将另外份的naoh(10m水溶液，450μl，3mmol)和meoh(1ml)经6h的时间段添加到反应混合物中。将反应混合物冷却至室温，用hoac中和并且在真空中浓缩。将粗产物溶解在meoh中，通过ptfe玻璃料过滤，并且用以下条件经由制备型hplc纯化：柱：axia c18 100mm x 30mm，5-μm颗粒；流动相a：10:90甲醇:水(含0.1％tfa)；流动相b：90:10甲醇:水(含0.1％tfa)；梯度：在15％b下保持0分钟，经10分钟15％-30％b，然后在30％b下保持4分钟；流速：40ml/min；在220nm处uv检测；柱温：25℃。将含有所希望的级分合并，用hcl(1m的h2o溶液，2ml，2mmol)处理并且在真空中浓缩，以得到4-((5-氨基-7-(((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸
·
hcl(98.9mg，28％产率)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.23-12.93(m,1h),12.67-12.43(m,1h),9.06-8.92(m,1h),8.03-7.87(m,2h),7.83(s,1h),7.51-7.46(m,2h),6.98(d,j＝8.2hz,1h),5.80(s,2h),4.91(d,j＝5.7hz,2h),3.82(s,3h),2.57(s,3h)。lc rt:0.52min。lc/ms[m+h]
+
411.3(方法e)。
[0193]
步骤3.将4-((5-氨基-7-(((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸
·
hcl(25mg，0.056mmol)在dmf(0.6ml)中的溶液用2-甲基-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷
·
2hcl(20.7mg，0.112mmol)、diea(68μl，0.39mmol)和2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三磷杂环己烷-2,4,6-三氧化物(在etoac中的50％溶液，67μl，0.11mmol)处理。将反应在室温下搅拌。16h后，将反应混合物用dmf(1ml)和h2o(0.2ml)稀释并且通过ptfe玻璃料过滤。用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含0.05％tfa)；流动相b：95:5乙腈:水(含0.05％tfa)；梯度：在0％b下保持0分钟，经26分钟0-40％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms信号触发级分收集。将含有所希望产物的
级分合并，并且通过离心蒸发干燥以得到呈双tfa盐的化合物247(20.5mg，72％产率)。
[0194]
类似地制备化合物248。实施例25-化合物254化合物254
[0195]
步骤1:将(7-羟基-1-(4-(羟甲基)-2-甲氧基苄基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(700mg，1.95mmol；us 2020/0038403 a1；图7，化合物64)在dmso(9.7ml)中的溶液用(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲胺
·
hcl(379mg，2.53mmol)、bop(129mg，2.92mmol)和dbu(1.0ml，6.8mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌2h，用dcm稀释并且用h2o洗涤。将有机层用h2o(6x)洗涤并且经na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将残余物溶解在dcm/meoh中，吸收到celite
tm
上并且经由柱色谱法纯化(100g c18 gold柱；流动相a：5:95乙腈:水(含0.05％tfa)；流动相b：95:5乙腈:水(含0.05％tfa)；流速：60ml/min，10％-50％梯度)。将纯化产物溶解在dcm中并且用饱和nahco3水溶液洗涤。将有机层经na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩以得到(1-(4-(羟甲基)-2-甲氧基苄基)-7-(((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(372mg，42％产率)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.69-9.66(m,1h),7.89(s,1h),7.76(t,j＝5.8hz,1h),6.95(s,1h),6.81-6.77(m,1h),6.76-6.70(m,1h),5.69(s,2h),5.17(t,j＝5.7hz,1h),4.89(d,j＝5.7hz,2h),4.45(d,j＝5.8hz,2h),3.77(s,3h),3.60(s,3h),2.56(s,3h)。lc rt:0.56min.lc/ms[m+h]
+
455.3(方法e)。
[0196]
步骤2:将(1-(4-(羟甲基)-2-甲氧基苄基)-7-(((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(372mg，0.818mmol)在dcm(8.2ml)中的溶液用socl2(179μl，2.46mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌10min并且在真空中浓缩。将残余物重新溶解在dcm中并且在真空中浓缩以得到(1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-7-(((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(387mg，100％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.82-11.60(m,1h),9.40-9.21(m,1h),8.12-8.08(m,1h),7.10(s,1h),7.04-6.95(m,2h),5.81(s,2h),5.02(br d,j＝5.3hz,2h),4.74(s,2h),3.80(s,3h),3.75(s,3h),2.60(s,3h)。lc rt:0.70min。
lc/ms[m+h]
+
＝473.3(方法e)。
[0197]
步骤3：将(1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-7-(((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(45mg，0.095mmol)在dmf(1.9ml)中的溶液用diea(83μl，0.48mmol)和2-硫杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷2,2-二氧化物
·
hcl(26.2mg，0.143mmol)处理。将反应混合物在60℃下搅拌6h并且在真空中浓缩。将残余物溶解在二噁烷(0.7ml)中并且用naoh(10m水溶液，76μl，0.76mmol)处理并且加热至60℃持续5h。将反应混合物在室温下用hoac中和并且在真空中浓缩。将粗产物溶解在dmf和h2o中，通过ptfe玻璃料过滤，并且用以下条件经由制备型lc/ms纯化：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含10mm nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含10mm nh4oac)；梯度：在1％b下保持0分钟，经20分钟1％-41％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥。将分离的产物用以下条件通过制备型lc/ms进一步纯化：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含0.05％tfa)；流动相b：95:5乙腈:水(含0.05％tfa)；梯度：在0％b下保持0分钟，经20分钟0-40％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以得到化合物254(11.7mg，16％)。实施例26-化合物263
[0198]
步骤1.将4-((5-((叔丁氧基羰基)氨基)-7-羟基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(685mg，1.59mmol；us 2020/0038403 a1，图8，化合物71)在thf(16ml)中的溶液冷却至0℃并且用lialh4(在thf中1m，2.8ml，2.8mmol)处理。将反应混合物在0℃下搅拌15min，用h2o和罗谢尔盐(饱和水溶液)淬灭，并且在室温下搅拌3h。将有机层吸收到celite
tm
上并且经由柱色谱法纯化(24g sio2；0至20％meoh-dcm梯度洗脱)以得到(7-羟基-1-(4-(羟甲基)-2-甲氧基苄基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸叔丁酯(460mg，72％产率)。1h(400mhz,dmso-d6)δ11.69-11.43(m,1h),10.95-10.62(m,1h),7.87-7.79(m,1h),6.97(s,1h),6.77(d,j＝7.7hz,1h),6.59(d,j＝7.8hz,1h),5.66(s,2h),5.16(t,j＝5.8hz,1h),4.45(d,j＝5.8hz,2h),3.79(s,3h),1.49(s,9h)。
lc rt:0.77min.lc/ms[m+h]
+
＝402.2(method e).
[0199]
步骤2.将(7-羟基-1-(4-(羟甲基)-2-甲氧基苄基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸叔丁酯(460mg，1.15mmol)在dmso(5.7ml)中的溶液用(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲胺
·
hcl(223mg，1.49mmol)、bop(760mg，1.72mmol)和dbu(0.69ml，4.6mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌2h，用etoac稀释并且用h2o(2x)洗涤。将有机层吸附到celite
tm
上并且经由柱色谱法纯化(100g c18 gold柱；流动相a：5:95乙腈:水(含0.05％tfa)；流动相b：95:5乙腈:水(含0.05％tfa)；流速：60ml/min，30％-50％梯度)。将纯化产物溶解在dcm中并且用饱和nahco3水溶液洗涤。将有机层经na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩以得到(1-(4-(羟甲基)-2-甲氧基苄基)-7-(((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸叔丁酯(190mg，33％产率)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.24-9.15(m,1h),7.87(s,1h),7.72(t,j＝5.8hz,1h),6.95(s,1h),6.82-6.75(m,1h),6.73-6.68(m,1h),5.68(s,2h),5.17(t,j＝5.7hz,1h),4.87(d,j＝5.7hz,2h),4.44(d,j＝5.7hz,2h),3.76(s,3h),2.55(s,3h),1.43(s,9h)。lc rt：0.75min。lc/ms[m+h]
+
＝497.2(方法e)。
[0200]
步骤3.将(1-(4-(羟甲基)-2-甲氧基苄基)-7-(((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸叔丁酯(91.5mg，0.184mmol)在二噁烷(0.6ml)中的溶液用hcl(在二噁烷中4m，0.69ml，2.8mmol)处理，在40℃下搅拌90min并且浓缩。将残余物溶解在dcm中并且在真空中浓缩以得到(4-((5-氨基-7-(((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(73.1mg，100％产率)。lc rt：0.65min。lc/ms[m+h]
+
＝397.1(方法e)。
[0201]
步骤4.将1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-n7-((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺(27mg，0.065mmol)在dmso(1.3ml)中的溶液用diea(57μl，0.33mmol)和2-异丙基-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷(14mg，0.098mmol)处理。将反应混合物在65℃下搅拌30min，用dmso稀释，通过ptfe玻璃料过滤，并且用以下条件经由制备型lc/ms纯化：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含10mm nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含10mm nh4oac)；梯度：在0％b下保持0分钟，经20分钟0-40％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以得到呈乙酸盐的化合物263(13.7mg，35％)。
[0202]
类似地制备化合物264。实施例27-化合物249
[0203]
将化合物835(20mg，0.042mmol)和乙醛(183mg，0.083mmol)在dmf(1ml)中的混合物用乙酸(0.024ml，0.416mmol)和20mg分子筛处理，然后用三乙酰氧基硼氢化钠(35.3mg，0.166mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌1h。蒸发乙酸(0.024ml，0.416mmol)。用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在3％b下保持0分钟，经25分钟3％-43％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥。将材料用以下条件通过制备型lc/ms进一步纯化：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含0.05％tfa)；流动相b：95:5乙腈:水(含0.05％tfa)；梯度：在0％b下保持0分钟，经25分钟0-40％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms信号触发级分收集。将含有所希望的化合物249的级分合并，并且经由离心蒸发干燥。
[0204]
类似地制备化合物252和化合物253。实施例28-化合物255化合物255
[0205]
步骤1.将(4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇818(400mg，1.122mmol)在thf(2ml)中的溶液用socl2(0.164ml，2.244mmol)处理并且在室温下搅拌1h。蒸发溶剂并且将粗氯化物2不经进一步纯化用于下一步骤。
[0206]
步骤2.将氯化物2在dmso中的溶液用胺3(可商购，cas：236406-55-6)处理并且在80℃下加热2h，此后lcms显示反应完成。将反应混合物用tfa处理并且搅拌1h。蒸发tfa。用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在4％b下保持0分钟，经20分钟4％-44％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。将含有所希望的化合物255的级分合并，并且经由离心蒸发干燥。
[0207]
类似地制备以下化合物：化合物256、化合物257、化合物258、化合物265和化合物266。实施例29-化合物259
[0208]
将化合物255(18mg，0.039mmol)在dmf(0.5ml)中的溶液用k2co3(16.06mg，0.116mmol)/2-溴乙-1-醇(5.49μl，0.077mmol)处理并且在50℃下加热2h。用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含0.05％tfa)；流动相b：95:5乙腈:水(含0.05％tfa)；梯度：在0％b下保持0分钟，经20分钟0-40％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。将含有所希望的化合物259的级分合并，并且经由离心蒸发干燥。
[0209]
类似地制备以下化合物：化合物260、化合物261、化合物262、化合物267和化合物268。实施例30-化合物270
[0210]
步骤1.向(5-溴-3-甲氧基吡啶-2-基)甲醇(sigma-aldrich)(2.462g，11.29mmol)在ch2cl2(113ml)中的0℃溶液中逐滴添加socl2(1.235ml，16.94mmol)。将反应在室温下搅拌1h并且在真空中浓缩。将残余物与ch2cl2混合并且在真空中浓缩(2x)以提供粗5-溴-2-(氯甲基)-3-甲氧基吡啶。此材料不经进一步纯化使用。lc-ms m/z 236/238[m+h]
+
。
[0211]
步骤2向(7-羟基-3-碘-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(3.44g，10.26mmol)在dmf(45.6ml)中的室温悬浮液中添加cs2co3(13.37g，41.0mmol)。将混合物在0℃下搅拌10min；然后添加来自步骤1的粗材料在dmf(22.80ml)中的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌1h。移除冷却浴并且在室温下继续搅拌20h。将反应混合物添加到h2o(250ml)中，并且允许所得混合物在室温下静置。通过真空过滤收集固体并且用h2o(3x15ml)、meoh(2x15ml)、ch2cl2(15ml)和己烷(15ml)洗涤以提供(1-((5-溴-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-7-羟基-3-碘-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(4.431g，81％)。lc-ms m/z 535/537[m+h]
+
。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.19-12.96(m,1h),8.95-8.80(m,1h),8.06(s,1h),7.71(s,1h),5.87-5.65(m,2h),3.89(s,3h),3.53(br s,3h)。
[0212]
步骤3.向(1-((5-溴-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-7-羟基-3-碘-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(0.990g，1.850mmol)在dmso(12.33ml)中的室温悬浮液中添加
(s)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-胺hcl盐(0.870g，2.220mmol)(us2020/0038403a1，图8，化合物71a)，然后添加1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(1.245ml，8.33mmol)和(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(0.982g，2.220mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h，用etoac(100ml)稀释，并且用h2o(100ml)洗涤。将各层分离，并且将水层用etoac(100ml)萃取。将合并的有机层用饱和nacl水溶液(100ml)洗涤，经na2so4干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将粗材料通过快速色谱法纯化(80g硅胶；线性梯度0-100％etoac-己烷)以提供呈黄色泡沫的(s)-(1-((5-溴-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-碘-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(810mg，50％)。lc-ms m/z 872/874[m+h]
+
。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.69(s,1h),7.92(d,j＝1.8hz,1h),7.79(d,j＝1.8hz,1h),7.57-7.53(m,2h),7.50-7.46(m,2h),7.42-7.31(m,4h),7.25-7.20(m,2h),7.12(d,j＝8.3hz,1h),5.78-5.69(m,2h),4.64-4.55(m,1h),3.91(s,3h),3.70-3.64(m,2h),3.58(s,3h),1.90-1.82(m,2h),1.57-1.48(m,2h),1.25-1.13(m,2h),0.92(s,9h),0.81(t,j＝7.3hz,3h)。
[0213]
步骤4.向(s)-(1-((5-溴-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-碘-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(0.810g，0.928mmol)在meoh(9.28ml)和acoh(9.28ml)的混合物中的0℃溶液添加锌(0.607g，9.28mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌30min并且通过celite
tm
过滤，用meoh(10ml)和etoac(50ml)洗涤。将滤液用etoac(200ml)稀释。在搅拌的同时，将饱和nahco3水溶液(250ml)缓慢地添加到此溶液中(调节添加速率以控制气体逸出速率)。将各层分离并且将有机层用饱和nacl水溶液(250ml)洗涤，经na2so4干燥，过滤，并且在真空中浓缩以提供粗产物(s)-(1-((5-溴-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯。此材料不经进一步纯化使用。lc-ms m/z 746/748[m+h]
+
。
[0214]
步骤5.将氮气鼓泡通过化合物5(500mg，0.670mmol)、化合物6(304mg，0.870mmol，cas 2240187-78-2)和k2co3(370mg，2.68mmol)在dmf(2ml)中的溶液持续2min。添加pdcl2(dppf)-ch2cl2加合物(54.7mg，0.067mmol)并且将反应混合物再次用n2鼓泡1min。将反应烧瓶密封并且在70℃下加热5h。在50g硅胶柱上用0-50％meoh/dcm洗脱进行纯化以提供476mg化合物7。lc/ms[m+h]
+
＝889.5。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.02(s,5h),7.92(d,j＝19.1hz,1h),7.63-7.50(m,3h),7.37-7.23(m,2h),7.22-7.14(m,2h),7.04(s,1h),6.62(d,j＝2.6hz,1h),5.64(dd,j＝14.7,1.4hz,1h),5.39(d,j＝14.9hz,1h),4.63(s,1h),3.95(d,j＝2.0hz,2h),3.82(d,j＝7.5hz,3h),3.57(s,1h),3.31-3.21(m,1h),2.96(s,7h),2.88(s,7h),2.49(s,1h),1.95(d,j＝17.4hz,1h),1.47(s,5h),1.52-1.36(m,2h),1.26(d,j＝13.9hz,5h),1.02(s,3h),1.04-0.90(m,2h)。
[0215]
步骤6-7.将固体化合物7(476mg，0.535mmol)用在二噁烷中的hcl(1.338ml，5.35mmol)在搅拌下在室温下处理2h，此后lc/ms显示反应完成。使用v-10蒸发器蒸发hcl。
将粗产物8溶解在1ml二噁烷中并且与naoh水溶液(1.071ml，10.71mmol)一起加热2h，此后lc/ms显示反应完成。用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在3％b下保持0分钟，经20分钟3％-43％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。将含有化合物272((3s)-3-({5-氨基-1-[(5-{7-氮杂螺[3.5]壬-1-烯-2-基}-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-基}氨基)己-1-醇)的级分合并，并且通过离心蒸发干燥。
[0216]
步骤8.将化合物272(40mg，0.081mmol)、四氢-4h-吡喃-4-酮(37.5μl，0.406mmol)在dma(1ml)中的溶液用乙酸(46.5μl，0.812mmol)处理，然后用50mg粒状分子筛和三乙酰氧基硼氢化钠(86mg，0.406mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌过夜并且用注射筒过滤。用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在7％b下保持0分钟，经20分钟7％-47％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以提供化合物273((3s)-3-{[5-氨基-1-({3-甲氧基-5-[7-(噁烷-4-基)-7-氮杂螺[3.5]壬-1-烯-2-基]吡啶-2-基}甲基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-基]氨基}己-1-醇)。
[0217]
步骤9.将氢气鼓泡通过化合物273(18mg，0.026mmol)在meoh(1ml)和pd/c(2.73mg，0.026mmol)中的溶液持续1min。将反应混合物在氢气球气氛下在60℃下加热2h。用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在7％b下保持0分钟，经20分钟7％-47％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以提供化合物27。
[0218]
类似地制备以下化合物：化合物274、化合物275和化合物278。实施例31-化合物271
[0219]
步骤1.将(s)-(1-((5-溴-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(552mg，0.739mmol)、7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-2-氮杂螺[3.5]壬-6-烯-2-甲酸叔丁酯1(336mg，0.961mmol；cas 235276-13-4)和k2co3(409mg，2.96mmol)在dmf(5ml)中的溶液用n2鼓泡2min。添加pdcl2(dppf)-ch2cl2加合物(60.4mg，0.074mmol)并且再次用n2鼓泡1min。lc/ms[m+h]
+
＝889.5。1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.70(d,j＝8.1hz,1h),8.04-7.95(m,1h),7.87(s,1h),7.65-7.58(m,2h),7.58-7.51(m,2h),7.40-7.31(m,1h),7.33-7.24(m,3h),7.21-7.12(m,3h),7.08(s,1h),6.02(s,1h),5.63(d,j＝14.9hz,1h),5.40(d,j＝15.0hz,1h),4.58(s,1h),3.94(s,3h),3.85-3.74(m,4h),3.73-3.64(m,2h),3.62(d,j＝8.3hz,2h),3.49(s,2h),2.95(s,1h),2.88(s,1h),2.41(d,j＝4.3hz,4h),2.02(dd,j＝13.0,6.2hz,0h),1.95(s,1h),1.91(d,j＝5.7hz,1h),1.45(s,6h),1.45-1.36(m,1h),1.24(s,6h),1.04(d,j＝8.8hz,0h),1.03(s,6h),1.02(s,1h),0.94(t,j＝7.3hz,3h)。
[0220]
步骤2.将化合物2(90mg，0.101mmol)用tfa(0.078ml，1.012mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌30min。在v-10蒸发器中蒸发tfa。将残余物溶解在dma(0.5ml)中并且用四氢-4h-吡喃-4-酮(0.028ml，0.506mmol)、乙酸(0.029ml，0.506mmol)、50mg分子筛处
理并且最后用三乙酰氧基硼氢化钠(107mg，0.506mmol)处理。在室温下搅拌1h后，将反应混合物用三乙胺三氟化氢(0.165ml，1.012mmol)处理并且在室温下搅拌2h。将反应混合物在50g反相isco上用0-50％mecn/水(0.05％tfa)洗脱直接纯化以产生呈白色固体的化合物3。lc/ms[m+h]
+
＝635.3。
[0221]
步骤3，部分1.将化合物(58mg，0.091mmol)在dmso(0.5ml)中的溶液用naoh(0.091ml，0.914mmol)处理并且在80℃下加热2h以提供脱羧基化化合物3。lc/ms[m+h]
+
＝577.3。
[0222]
步骤3，部分2.将脱氨基甲酰基化化合物3(12mg，0.021mmol)在含有pd-c(2.214mg，0.021mmol)的meoh(1ml)中的溶液用h2鼓泡1min。将反应混合物在60℃下在氢气球气氛下加热2h。将粗产物用以下条件经由制备型lc/ms纯化：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在9％b下保持0分钟，经20分钟9％-49％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以提供4.7mg化合物271。
[0223]
类似地制备化合物277。实施例32-化合物250
[0224]
步骤1.在0℃下将6-羟基-2-氮杂螺[3.3]庚-2-甲酸苄酯1(cas#1363383-32-7；3g，12.13mmol)在dcm(20ml)中的溶液用三乙胺(2.029ml，14.56mmol)、dmap(0.296g，2.426mmol)和甲苯磺酰基-cl(2.54g，13.34mmol)处理。允许将反应进行2h。将反应用50ml水淬灭并且用50ml 1m hcl水溶液、盐水(50ml)洗涤并且经na2so4干燥，过滤并且浓缩以提供呈黄色残余物的粗甲苯磺酰化中间体。将其溶解在dmso(20ml)中并且用碘化钠(5.46g，36.4mmol)处理。在120℃下加热2h。将反应混合物溶解在50ml etoac中并且用饱和na2s2o3水溶液(50ml)、水(50ml)、盐水(50ml)洗涤并且经na2so4干燥。过滤、浓缩并且在80g硅胶柱上用0-50％etoac/己烷洗脱纯化，得到呈白色固体的化合物2。lc/ms[m+h]
+
＝357.9。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.42-7.27(m,5h),5.01(s,2h),4.43(p,j＝7.9hz,1h),3.96(s,4h),2.92(ddd,j＝10.4,7.5,3.1hz,2h),2.74-2.61(m,2h)。
[0225]
步骤2.将化合物2(1649mg，4.62mmol)在4ml thf中的溶液添加到在n2下的烘箱干燥的圆底烧瓶中的在thf中的rieke锌(12.08ml，9.23mmol)中。烧瓶温度升高，表明形成锌试剂3。将反应混合物在室温下搅拌1h并且保持在n2下待将来使用。
[0226]
步骤3.将5-溴-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-甲氧基吡啶(1.4g，4.21mmol),1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁二氯化钯(ii)二氯甲烷络合物(0.308g，0.421mmol)和碘化铜(i)(0.160g，0.843mmol)在dmf(10ml)中的溶液用n2鼓泡1min。添加(2-((苄基氧基)羰基)-2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)碘化锌(ii)3(17.49ml，5.06mmol)。将反应混合物在70℃下加热h。将此溶液用三乙胺三氟化氢(1.372ml，8.43mmol)处理并且搅拌过夜。lcms显示形成化合物5(167mg，0.453mmol，10.76％产率)。将反应在150g反相c-18柱上用0-50％mecn/水(0.05％tfa)洗脱直接纯化，并且收集所希望的级分以得到呈淡黄色固体的化合物5。lc/ms[m+h]
+
＝369.2。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.08(s,1h),7.81(s,1h),7.43-7.28(m,5h),5.04(s,2h),4.71(s,2h),4.11(s,2h),3.66-3.56(m,3h),3.61-3.48(m,1h),2.58(ddt,j＝10.6,8.4,2.5hz,2h),2.41(td,j＝9.5,2.9hz,2h),1.84-1.70(m,3h)。
[0227]
步骤4-5.将化合物5(167mg，0.453mmol)在thf(1ml)中的溶液用socl2(0.066ml，0.907mmol)处理并且在室温下搅拌30min。用v-10蒸发器蒸发溶剂。将在1ml dmf中的粗产物6添加到(7-羟基-3-碘-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯7(152mg，0.453mmol)和cs2co3(295mg，0.907mmol)在1ml dmf中的溶液中。在60℃下加热2h后。将反应过滤并且在50g反相c-18柱上用0-50％mecn/水(0.05％tfa)洗脱直接纯化。将所希望的级分冻干以提供呈淡黄色固体的化合物8。lc/ms[m+h]
+
＝886.1。
[0228]
步骤6-7.将化合物8(140mg，0.204mmol)和(s)-3-氨基己-1-醇9(47.9mg，0.408mmol)在dmso(1ml)中的溶液用dbu(0.092ml，0.613mmol)处理，然后用bop(135mg，0.306mmol)处理。在40℃下加热1h后，lmcs显示反应完成以提供中间体10。将反应混合物用naoh(0.204ml，2.042mmol)处理并且在80℃下加热2h。将反应混合物在50g c-18反相柱上用0-50％mecn/水(0.05％tfa)洗脱直接纯化。将所希望的级分冻干以产生呈淡黄色固体的化合物11。lc/ms[m+h]
+
＝593.1。
[0229]
步骤8.将化合物11(30mg，0.051mmol)在含pd-c(5.39mg，0.051mmol)的meoh(1ml)中的溶液用h2(10.21mg，5.06mmol)鼓泡1min。将反应混合物在50℃下在h2气球下加热2h。用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在6％b下保持0分钟，经20分钟6％-46％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以提供7.6mg化合物12。lc/ms[m+h]
+
＝466.9。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ7.93(s,2h),7.90(d,j＝1.6hz,1h),7.51(d,j＝7.6hz,1h),7.43(d,j＝8.6hz,1h),5.96(s,1h),5.71-5.59(m,3h),4.43(s,2h),4.11(s,1h),3.90
(d,j＝6.9hz,3h),2.68(d,j＝9.9hz,0h),2.57(d,j＝22.7hz,2h),2.35(d,j＝14.2hz,2h),2.24(s,1h),1.92(s,1h),1.78(d,j＝6.3hz,2h),1.77-1.69(m,2h),1.58(s,4h),1.29(s,2h),0.91-0.84(m,3h)。
[0230]
步骤9.将化合物12(30mg，0.064mmol)和四氢-4h-吡喃-4-酮(0.012ml，0.129mmol)在dmf(0.5ml)中的溶液用2滴乙酸和50mg 分子筛和三乙酰氧基硼氢化钠(54.5mg，0.257mmol)处理。在室温下搅拌1h后。用以下条件通过制备型lc/ms纯化粗材料：柱：xbridge c18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在13％b下保持0分钟，经20分钟13％-53％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms和uv信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型lc/ms进一步纯化：柱：xbridge苯基，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相a：5:95乙腈:水(含nh4oac)；流动相b：95:5乙腈:水(含nh4oac)；梯度：在9％b下保持0分钟，经20分钟9％-49％b，然后在100％b下保持0分钟；流速：20ml/min；柱温：25℃。通过ms信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且通过离心蒸发干燥以提供1.9mg化合物250。
[0231]
类似地制备化合物251。实施例33-起始材料和中间体
[0232]
下文的图示出了用于制备可用作用于制备本文公开的tlr7激动剂的起始材料或中间体的化合物的方案。所述方案可以适用于制备其他类似的可以用作起始材料或中间体的化合物。所采用的试剂是本领域众所周知的，并且在许多情况下，它们的使用已经在前述实施例中进行了展示。图解1
生物活性
[0233]
可以通过以下程序测定本文公开的作为tlr7激动剂的化合物的生物活性。人tlr7激动剂活性测定
[0234]
此程序描述了用于测定在本说明书中公开的化合物的人tlr7(htlr7)激动剂活性的方法。
[0235]
将具有人tlr7分泌型胚胎碱性磷酸酶(seap)报告转基因的工程化人胚肾蓝细胞(hek-blue
tm
tlr细胞；invivogen)悬浮在非选择性培养基(补充有10％胎牛血清(sigma)的dmem高葡萄糖(invitrogen))中。将hek-blue
tm
tlr7细胞添加到384孔组织培养板的每个孔中(15,000个细胞/孔)，并且在37℃、5％co2下孵育16-18h。将化合物(100nl)分配到含有hek-blue
tm
tlr细胞的孔中，并且将经处理的孔在37℃、5％co2下孵育。在处理18h后，将十微升的新鲜制备的quanti-blue
tm
试剂(invivogen)添加到每个孔中，孵育30min(37℃，5％co2)，并且使用envision读板仪(od＝620nm)测量seap水平。计算半数最大有效浓度值(ec
50
；在测定基线与最大值之间引起反应的一半的化合物浓度)。人血液中i型干扰素基因(mx-1)和cd69的诱导
[0236]
i型干扰素(ifn)mx-1基因和b细胞激活标记物cd69的诱导是在tlr7途径激活后发生的下游事件。以下是人全血测定，其测量响应于tlr7激动剂的诱导。
[0237]
从人类受试者中收获肝素化的人全血，并且将其用1mm的测试tlr7激动剂化合物处理。将血液用rpmi 1640培养基稀释，并且使用echo预加样(predot)10nl/孔，从而得到1um的最终浓度(在10ul血液中有10nl)。在摇床上混合30秒后，将板盖住并且置于37℃室中过夜＝17h。制备固定/裂解缓冲液(在h2o中5x-》1x，在37℃下加温；目录号bd 558049)，并
且保持perm缓冲液(在冰上)，以备后用。
[0238]
对于表面标记物(cd69)染色：制备表面ab：0.045ul hcd14-fitc(thermofisher目录号mhcd1401)+0.6ul hcd19-ef450(thermofisher目录号48-0198-42)+1.5ul hcd69-pe(目录号bd555531)+0.855ul facs缓冲液。添加3ul/孔，1000rpm旋转1min，并且在摇床上混合30秒，置于冰上30min。在用70ul预温热的1x固定/裂解缓冲液30分钟后停止刺激，并且使用feliex伴侣重悬(15次，对每个板更换吸头)并且在37c下孵育10分钟。
[0239]
在2000rpm下离心5分钟，用hcs板清洗器抽出，在摇床上混合30秒，并且然后在dpbs中用70ul洗涤并且沉淀2次(2000rpm，持续5min)，并且在facs缓冲液中用50ul洗涤，沉淀1次(2000rpm，持续5min)。在摇床上混合30秒。对于细胞内标记物(mx-1)染色：添加50ul bd perm缓冲液iii，并且在摇床上混合30秒。在冰上孵育30分钟(在黑暗中)。用50ul facs缓冲液洗涤2次(在perm后，在2300rpm下旋转5min)，然后在摇床上混合30秒。在20ul含有mx1抗体()(4812)-alexa 647：novus biologicals#nbp2-43704af647)20ul facs缓冲液+0.8ul higg+0.04ul mx-1的facs缓冲液中重悬。1000rpm旋转1min，在摇床上混合30秒，并且将样品在黑暗中在室温下孵育45分钟，然后用facs缓冲液洗涤2次(在perm后，在2300rpm下旋转5min)。在20ul(每孔总计35ul)facs缓冲液重悬，并且用箔纸覆盖，并且置于4℃下，以在第二天读数。在iqueplus上读取板。将结果加载到工具集中，并且在curve master中生成ic50曲线。将y轴100％设置为1um瑞喹莫德。小鼠血液中tnf-α和i型ifn反应基因的诱导
[0240]
tnf-α和i型ifn反应基因的诱导是在tlr7途径激活后发生的下游事件。以下是测量在小鼠全血中响应于tlr7激动剂的诱导的测定。
[0241]
将肝素化的小鼠全血用含青霉素-链霉素的rpmi 1640培养基以5:4的比率稀释(50ul全血和40ul培养基)。将90ul体积的稀释血液转移到falcon平底96孔组织培养板的孔中，并且将板在4℃下孵育1h。将在100％dmso储备液中的测试化合物在相同培养基中稀释20倍用于浓度反应测定，并且然后将10ul稀释的测试化合物添加到孔中，使得最终dmso浓度为0.5％。对照孔接受10ul含有5％dmso的培养基。然后将板在37℃的5％co2培养箱中培养17h。孵育后，将100ul培养基添加到每个孔中。将板离心，并且取出130ul上清液用于通过elisa(invitrogen，目录号88-7324，thermo-fisher scientific)测定tnfa的产生。将来自invitrogen mrna catcher plus试剂盒(目录号k1570-02)的70ul体积的含dtt的mrna捕获裂解缓冲液(1x)添加到孔中剩余的70ul样品中，并且通过上下移液5次进行混合。然后将板在室温下摇动5-10min，然后向每个孔中添加2ul蛋白酶k(20mg/ml)。然后将板在室温下摇动15-20min。然后将板在-80℃下储存直到进一步加工。
[0242]
将冷冻样品解冻，并且根据制造商的说明书，使用invitrogen mrna catcher plus试剂盒(目录号k1570-02)提取mrna。使用invitrogen superscript iv vilo master mix(目录号11756500)，使用来自rna提取的一半产率的mrna在20μl逆转录酶反应中合成cdna。使用来自thermofisher(applied biosystems)的quantstudio实时pcr系统进行实时pcr。使用针对小鼠ifit1、ifit3、mx1和ppia基因表达的商业化预设计的taqman测定和taqman master mix一式两份地运行所有实时pcr反应。将ppia用作管家基因。遵循来自制造商的建议。通过平均管家基因(ct)归一化所有原始数据(ct)，然后利用比较ct(δδct)方法量化相对基因表达(rq)用于进行实验分析。
定义
[0243]“脂族”意指直链或支链的饱和或不饱和的非芳族烃部分，其具有指定数量的碳原子(例如，如在“c3脂族”、“c
1-5
脂族”、“c
1-c5脂族”或“c1至c5脂族”中，后三个短语与具有从1至5个碳原子的脂族部分同义)或者在未明确指定碳原子数量的情况下从1至4个碳原子(在不饱和脂族部分的情况下2至4个碳)。类似的理解也适用于诸如c
2-4
烯烃、c
4-c7脂环族等其他类型中的碳原子数。以类似的方式，诸如“(ch2)
1-3”的术语应理解为对下标是1、2或3的简写，使得这样的术语代表ch2、ch2ch2和ch2ch2ch2。
[0244]“烷基”意指饱和的脂族部分，其中用于指定碳原子数量的相同惯例是可适用的。通过说明的方式，c
1-c4烷基部分包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、叔丁基、1-丁基、2-丁基等。“烷二基”(有时也称为“亚烷基”)意指烷基的二价对应物，诸如
[0245]“烯基”意指具有至少一个碳-碳双键的脂族部分，其中用于指定碳原子数量的相同惯例是可适用的。通过说明的方式，c
2-c4烯基部分包括但不限于乙烯基(ethenyl/vinyl)、2-丙烯基(烯丙基或丙-2-烯基)、顺式-1-丙烯基、反式-1-丙烯基、e-(或z-)2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基(丁-1,3-二烯基)等。
[0246]“炔基”意指具有至少一个碳-碳三键的脂族部分，其中用于指定碳原子数量的相同惯例是可适用的。通过说明的方式，c
2-c4炔基包括乙炔基(ethynyl/acetylenyl)、炔丙基(丙-2-炔基)、1-丙炔基、丁-2-炔基等。
[0247]“脂环族”意指具有从1至3个环的饱和或不饱和的非芳族烃部分，每个环具有从3至8个(优选地从3至6个)碳原子。“环烷基”意指每个环是饱和的脂环族部分。“环烯基”意指至少一个环具有至少一个碳-碳双键的脂环族部分。“环炔基”意指至少一个环具有至少一个碳-碳三键的脂环族部分。通过说明的方式，脂环族部分包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基和金刚烷基。优选的脂环族部分是环烷基部分，尤其是环丙基、环丁基、环戊基和环己基。“环烷二基”(有时也称为“环亚烷基”)意指环烷基的二价对应物。类似地，“二环烷二基”(或“二环亚烷基”)和“螺烷二基”(或“螺亚烷基”)是指二环烷基和螺烷基(或“螺环烷基”)的二价对应物。通过说明方式，部分的例子是并且部分的例子是
[0248]“杂脂环族”意指这样的脂环族部分，其中在其至少一个环中，至多三个(优选地1至2个)碳已经被独立地选自n、o或s的杂原子替代，其中n和s任选地可以被氧化并且n任选地可以被季铵化。优选的脂环族部分由一个大小为5至6元的环组成。类似地，“杂环烷基”、“杂环烯基”和“杂环炔基”分别意指其至少一个环已经被如此修饰的环烷基、环烯基或环炔基部分。示例性杂脂环族部分包括氮杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、1,3-二噁烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、四氢噻喃基砜、吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜、硫代吗啉基砜、1,3-二氧戊环基、四氢-1,1-二氧代噻吩基、1,4-二噁烷基、硫杂环丁烷基等。“杂环亚烷基”意指杂环烷基的二价对应物。
[0249]“烷氧基”、“芳氧基”、“烷硫基”和“芳硫基”分别意指-o(烷基)、-o(芳基)、-s(烷基)和-s(芳基)。例子分别是甲氧基、苯氧基、甲硫基和苯硫基。
[0250]
除非指示较窄的含义，否则“卤素”或“卤代”意指氟、氯、溴或碘。
[0251]“芳基”意指具有单、双或三环环系统(优选地单环)的烃部分，其中每个环具有从3至7个碳原子，并且至少一个环是芳族的。环系统中的环可以彼此稠合(如在萘基中)或彼此键合(如在联苯基中)，并且可以与非芳族环稠合或键合(如在茚满基或环己基苯基中)。通过进一步说明的方式，芳基部分包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、联苯基、菲基、蒽基和苊基。“亚芳基”意指芳基的二价对应物，例如1,2-亚苯基、1,3-亚苯基或1,4-亚苯基。
[0252]“杂芳基”意指具有单、双或三环环系统(优选5至7元单环)的部分，其中每个环具有从3至7个碳原子，并且至少一个环是含有从1至4个独立地选自n、o或s的杂原子的芳族环，其中n和s任选地可以被氧化并且n任选地可以被季铵化。这样的至少一个含有杂原子的芳族环可以与其他类型的环稠合(如在苯并呋喃基或四氢异喹啉基中)，或者与其他类型的环直接键合(如在苯基吡啶基或2-环戊基吡啶基中)。通过进一步说明的方式，杂芳基部分包括吡咯基、呋喃基、噻吩基(thiophenyl/thienyl)、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、n-氧代吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉炔基(isoquinolynyl)、喹唑啉基、噌啉基、喹唑啉基(quinozalinyl)、萘啶基、苯并呋喃基、吲哚基、苯并噻吩基、噁二唑基、噻二唑基、吩噻唑基(phenothiazolyl)、苯并咪唑基、苯并三唑基、二苯并呋喃基、咔唑基、二苯并噻吩基、吖啶基等。“杂亚芳基”意指杂芳基的二价对应物。
[0253]
在指示部分可以被取代(诸如通过使用如在“未经取代或经取代的c
1-c5烷基”或“任选经取代的杂芳基”中的短语“未经取代或经取代的”或“任选经取代的”)的情况下，这样的部分可以具有一个或多个独立选择的取代基，优选地数量为1至5、更优选地数量为1或2。考虑到取代基所附接的部分，本领域普通技术人员可以选择取代基和取代模式，以提供化学稳定的并且可以通过本领域已知的技术以及本文列出的方法合成的化合物。在部分被鉴定为“未经取代或经取代的”或“任选经取代的”的情况下，在一个优选实施方案中，这样的部分是未经取代的。
[0254]“芳基烷基”、“(杂脂环族)烷基”、“芳基烯基”、“芳基炔基”、“联芳基烷基”等意指被芳基、杂脂环族、联芳基等部分(视情况而定)取代的烷基、烯基或炔基部分(视情况而定)，其中开放的(未满足的)化合价在烷基、烯基或炔基部分处，例如如在苄基、苯乙基、n-咪唑基乙基、n-吗啉代乙基等中。相反，“烷基芳基”、“烯基环烷基”等意指被烷基、烯基等部
分(视情况而定)取代的芳基、环烷基等部分(视情况而定)，例如如在甲基苯基(甲苯基)或烯丙基环己基中。“羟基烷基”、“卤代烷基”、“烷基芳基”、“氰基芳基”等意指被一个或多个鉴定的取代基(羟基、卤代等，视情况而定)取代的烷基、芳基等部分(视情况而定)。
[0255]
例如，允许的取代基包括但不限于烷基(尤其是甲基或乙基)、烯基(尤其是烯丙基)、炔基、芳基、杂芳基、脂环族、杂脂环族、卤代(尤其是氟)、卤代烷基(尤其是三氟甲基)、羟基、羟基烷基(尤其是羟基乙基)、氰基、硝基、烷氧基、-o(羟基烷基)、-o(卤代烷基)(尤其是-ocf3)、-o(环烷基)、-o(杂环烷基)、-o(芳基)、烷硫基、芳硫基、＝o、＝nh、＝n(烷基)、＝noh、＝no(烷基)、-c(＝o)(烷基)、-c(＝o)h、-co2h、-c(＝o)nhoh、-c(＝o)o(烷基)、-c(＝o)o(羟基烷基)、-c(＝o)nh2、-c(＝o)nh(烷基)、-c(＝o)n(烷基)2、-oc(＝o)(烷基)、-oc(＝o)(羟基烷基)、-oc(＝o)o(烷基)、-oc(＝o)o(羟基烷基)、-oc(＝o)nh2、-oc(＝o)nh(烷基)、-oc(＝o)n(烷基)2、叠氮基、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(芳基)、-nh(羟基烷基)、-nhc(＝o)(烷基)、-nhc(＝o)h、-nhc(＝o)nh2、-nhc(＝o)nh(烷基)、-nhc(＝o)n(烷基)2、-nhc(＝nh)nh2、-oso2(烷基)、-sh、-s(烷基)、-s(芳基)、-s(环烷基)、-s(＝o)烷基、-so2(烷基)、-so2nh2、-so2nh(烷基)、-so2n(烷基)2等。
[0256]
在被取代的部分是脂族部分的情况下，优选的取代基是芳基、杂芳基、脂环族、杂脂环族、卤代、羟基、氰基、硝基、烷氧基、-o(羟基烷基)、-o(卤代烷基)、-o(环烷基)、-o(杂环烷基)、-o(芳基)、烷硫基、芳硫基、＝o、＝nh、＝n(烷基)、＝noh、＝no(烷基)、-co2h、-c(＝o)nhoh、-c(＝o)o(烷基)、-c(＝o)o(羟基烷基)、-c(＝o)nh2、-c(＝o)nh(烷基)、-c(＝o)n(烷基)2、-oc(＝o)(烷基)、-oc(＝o)(羟基烷基)、-oc(＝o)o(烷基)、-oc(＝o)o(羟基烷基)、-oc(＝o)nh2、-oc(＝o)nh(烷基)、-oc(＝o)n(烷基)2、叠氮基、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(芳基)、-nh(羟基烷基)、-nhc(＝o)(烷基)、-nhc(＝o)h、-nhc(＝o)nh2、-nhc(＝o)nh(烷基)、-nhc(＝o)n(烷基)2、-nhc(＝nh)nh2、-oso2(烷基)、-sh、-s(烷基)、-s(芳基)、-s(＝o)烷基、-s(环烷基)、-so2(烷基)、-so2nh2、-so2nh(烷基)和-so2n(烷基)2。更优选的取代基是卤代、羟基、氰基、硝基、烷氧基、-o(芳基)、＝o、＝noh、＝no(烷基)、-oc(＝o)(烷基)、-oc(＝o)o(烷基)、-oc(＝o)nh2、-oc(＝o)nh(烷基)、-oc(＝o)n(烷基)2、叠氮基、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(芳基)、-nhc(＝o)(烷基)、-nhc(＝o)h、-nhc(＝o)nh2、-nhc(＝o)nh(烷基)、-nhc(＝o)n(烷基)2和-nhc(＝nh)nh2。尤其优选的是苯基、氰基、卤代、羟基、硝基、c
1-c4烷氧基、o(c
2-c4烷二基)oh和o(c
2-c4烷二基)卤代。
[0257]
在被取代的部分是脂环族、杂脂环族、芳基或杂芳基部分的情况下，优选的取代基是烷基、烯基、炔基、卤代、卤代烷基、羟基、羟基烷基、氰基、硝基、烷氧基、-o(羟基烷基)、-o(卤代烷基)、-o(芳基)、-o(环烷基)、-o(杂环烷基)、烷硫基、芳硫基、-c(＝o)(烷基)、-c(＝o)h、-co2h、-c(＝o)nhoh、-c(＝o)o(烷基)、-c(＝o)o(羟基烷基)、-c(＝o)nh2、-c(＝o)nh(烷基)、-c(＝o)n(烷基)2、-oc(＝o)(烷基)、-oc(＝o)(羟基烷基)、-oc(＝o)o(烷基)、-oc(＝o)o(羟基烷基)、-oc(＝o)nh2、-oc(＝o)nh(烷基)、-oc(＝o)n(烷基)2、叠氮基、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(芳基)、-nh(羟基烷基)、-nhc(＝o)(烷基)、-nhc(＝o)h、-nhc(＝o)nh2、-nhc(＝o)nh(烷基)、-nhc(＝o)n(烷基)2、-nhc(＝nh)nh2、-oso2(烷基)、-sh、-s(烷基)、-s(芳基)、-s(环烷基)、-s(＝o)烷基、-so2(烷基)、-so2nh2、-so2nh(烷基)和-so2n(烷基)2。更优选的取代基是烷基、烯基、卤代、卤代烷基、羟基、羟基烷基、氰基、硝基、烷氧基、-o(羟基烷基)、-c(＝o)(烷基)、-c(＝o)h、-co2h、-c(＝o)nhoh、-c(＝o)o(烷基)、-c(＝o)o
(羟基烷基)、-c(＝o)nh2、-c(＝o)nh(烷基)、-c(＝o)n(烷基)2、-oc(＝o)(烷基)、-oc(＝o)(羟基烷基)、-oc(＝o)o(烷基)、-oc(＝o)o(羟基烷基)、-oc(＝o)nh2、-oc(＝o)nh(烷基)、-oc(＝o)n(烷基)2、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(芳基)、-nhc(＝o)(烷基)、-nhc(＝o)h、-nhc(＝o)nh2、-nhc(＝o)nh(烷基)、-nhc(＝o)n(烷基)2和-nhc(＝nh)nh2。尤其优选的是c
1-c4烷基、氰基、硝基、卤代和c
1-c4烷氧基。
[0258]
在陈述范围的情况下，如在“c
1-c5烷基”或“5％至10％”中，这样的范围包括所述范围的端点，如在第一个实例中的c1和c5以及在第二个实例中的5％和10％。
[0259]
除非具体指示特定的立体异构体(例如，通过在结构式中的相关立体中心处的加粗或加虚线的键，通过在结构式中将双键描绘为具有e或z构型，或通过使用立体化学指定的命名法或符号)，否则作为纯化合物及其混合物的所有立体异构体都包括在本发明的范围内。除非另外指示，否则外消旋体、单独的对映体(不论是光学纯的还是部分拆分的)、非对映体、几何异构体及其组合和混合物都被本发明涵盖。
[0260]
本领域技术人员应理解，化合物可以具有互变异构体形式(例如，酮和烯醇形式)、共振形式和两性离子形式，所述形式等效于在本文使用的结构式中描绘的那些，并且所述结构式涵盖此类互变异构体形式、共振形式或两性离子形式。
[0261]“药学上可接受的酯”意指在体内(例如在人体中)水解产生母体化合物或其盐或者本身具有与母体化合物类似的活性的酯。合适的酯包括c
1-c5烷基、c
2-c5烯基或c
2-c5炔基酯，尤其是甲基、乙基或正丙基酯。
[0262]“药学上可接受的盐”意指适用于药物配制品的化合物的盐。在化合物具有一个或多个碱性基团的情况下，所述盐可以是酸加成盐，诸如硫酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐、双羟萘酸盐(恩波酸盐(embonate))、氢碘酸盐、硝酸盐、盐酸盐、乳酸盐、甲基硫酸盐、富马酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、甲磺酸盐、乳糖醛酸盐、辛二酸盐、甲苯磺酸盐等。在化合物具有一个或多个酸性基团的情况下，所述盐可以是诸如以下的盐：钙盐、钾盐、镁盐、葡甲胺盐、铵盐、锌盐、哌嗪盐、氨丁三醇盐、锂盐、胆碱盐、二乙胺盐、4-苯基环己胺盐、苯乍生盐、钠盐、四甲基铵盐等。多晶型结晶形式和溶剂化物也涵盖在本发明的范围内。
[0263]“受试者”是指动物，包括但不限于灵长类动物(例如，人)、猴、牛、猪、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠或小鼠。关于例如哺乳动物受试者(诸如人)的术语“受试者”和“患者”在本文中可互换地使用。
[0264]
在治疗疾病或障碍的上下文中，术语“治疗”(“treat”、“treating”和“treatment”)意在包括减轻或消除障碍、疾病或病症，或与障碍、疾病或病症相关的一种或多种症状；或减慢障碍、疾病或病症或其一种或多种症状的进展、扩散或恶化。“癌症的治疗”是指以下作用中的一种或多种：(1)在一定程度上抑制肿瘤生长，包括(i)减慢和(ii)完全阻止生长；(2)减少肿瘤细胞的数量；(3)维持肿瘤大小；(4)减小肿瘤大小；(5)抑制，包括(i)减少、(ii)减慢或(iii)完全防止肿瘤细胞浸润到外周器官中；(6)抑制，包括(i)减少、(ii)减慢或(iii)完全防止转移；(7)增强抗肿瘤免疫应答，这可以导致(i)维持肿瘤大小、(ii)减小肿瘤大小、(iii)减慢肿瘤生长、(iv)减少、减慢或防止侵袭和/或(8)在一定程度上缓解与障碍相关的一种或多种症状的严重程度或数量。
[0265]
在本说明书的式中，横向于键的波浪线或在键末端的星号(*)表示共价附
接位点。例如，在式中r是或r是的陈述意指
[0266]
在本说明书的式中，在其两个碳之间横穿芳族环的键意指附接至所述键的基团可以位于所述芳族环的任何位置，所述任何位置是通过除去隐含地在那里(或明确地在那里，如果画出来的话)的氢而变得可用的。通过说明的方式：代表代表代表并且代表
[0267]
本公开文本包括在本文描述的化合物中出现的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子序数但质量数不同的那些原子。通过一般举例而非限制的方式，氢的同位素包括氘和氚。碳的同位素包括
13
c和
14
c。本发明的同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与本文所述的那些类似的方法使用适当的同位素标记的试剂代替原本采用的未标记的试剂来制备。通过举例的方式，c
1-c3烷基可以是未氘化的、部分氘化的或完全氘化的，并且“ch
3”包括ch3、
13
ch3、
14
ch3、ch2t、ch2d、chd2、cd3等。在一个实施方案中，化合物中的各种元素以其天然同位素丰度存在。
[0268]
本领域技术人员应理解，某些结构可以绘制呈一种互变异构体形式或另一种互变异构体形式，例如酮与烯醇，并且这两种形式是等效的。首字母缩略词和缩写
[0269]
表c提供了在本说明书中使用的首字母缩略词和缩写及其含义的列表。
参考文献
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下文提供了在本说明书中较早以缩写方式通过第一作者(或发明人)和日期引用的以下参考文献的完整引用。将这些参考文献中的每一个出于所有目的通过引用并入本文。
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公开内容包括在不同段落中找到的信息的所有适当组合。类似地，尽管本文中的各种附图和描述涉及本发明的具体实施方案，但应理解，在特定附图或实施方案的背景下公开了具体特征的情况下，也可以在另一个附图或实施方案的背景下、与另一个特征组合或总体上在本发明中在适当的程度上使用这样的特征。
[0344]
此外，虽然已经根据某些优选实施方案具体描述了本发明，但本发明不限于此类优选实施方案。而是，本发明的范围由所附权利要求限定。