抗MUC1-SEA抗体

抗muc1-sea抗体
技术领域
1.本发明涉及特异性地针对存在于人细胞的细胞表面上的糖蛋白muc1的α链和β链的连接部(其包含sea结构域)的抗体，并且涉及这些抗体在癌症的检测和治疗中的方法和用途，以及在多种非恶性疾病和疾患的检测和治疗中的方法和用途。
2.

背景技术：
文献
3.以下列出了被认为作为背景技术与本发明所公开的主题相关的参考文献：
4.[1]g.rivalland,b.loveland,p.mitchell,update on mucin-1 immunotherapy in cancer:a clinical perspective,expert opin biol ther,15(2015)1773-1787.
[0005]
[2]j.taylor-papadimitriou,j.m.burchell,r.graham,r.beatson,latest developments in muc1 immunotherapy,biochem soc trans,46(2018)659-668.
[0006]
[3]j.m.burchell,a.mungul,j.taylor-papadimitriou,o-linked glycosylation in the mammary gland:changes that occur during malignancy,j mammary gland biol neoplasia,6(2001)355-364.
[0007]
[4]w.fiedler,s.dedosso,s.cresta,j.weidmann,a.tessari,m.salzberg,b.dietrich,h.baumeister,s.goletz,l.gianni,c.sessa,a phase i study of pankomab-gex,a humanised glyco-optimised monoclonal antibody to a novel tumour-specific muc1 glycopeptide epitope in patients with advanced carcinomas,eur j cancer,63(2016)55-63.
[0008]
[5]k.ryuko,d.j.schol,f.g.snijdewint,s.von mensdorff-pouilly,r.j.poort-keesom,y.a.karuntu-wanamarta,r.a.verstraeten,k.miyazaki,p.kenemans,j.hilgers,characterization of a new muc1 monoclonal antibody(vu-2-g7)directed to the glycosylated pdtr sequence of muc1,tumour biol,21(2000)197-210.
[0009]
[6]m.a.tarp,a.l.sorensen,u.mandel,h.paulsen,j.burchell,j.taylor-papadimitriou,h.clausen,identification of a novel cancer-specific immunodominant glycopeptide epitope in the muc1 tandem repeat,glycobiology,17(2007)197-209.
[0010]
[7]d.zhou,l.xu,w.huang,t.tonn,epitopes of muc1 tandem repeats in cancer as revealed by antibody crystallography:toward glycopeptide signature-guided therapy,molecules,23(6)(2018)1326.
[0011]
[8]t.kimura,o.j.finn,muc1 immunotherapy is here to stay,expert opin biol ther,13(2013)35-49.
[0012]
[9]n.k.ibrahim,k.o.yariz,i.bondarenko,a.manikhas,v.semiglazov,a.alyasova,v.komisarenko,y.shparyk,j.l.murray,d.jones,s.senderovich,a.chau,f.erlandsson,g.acton,m.pegram,randomized phase ii trial of letrozole plus anti-muc1 antibody as1402 in hormone receptor-positive locally advanced or metastatic breast cancer,clin cancer res,17(2011)6822-6830.
[0013]
[10]d.b.rubinstein,m.karmely,r.ziv,i.benhar,o.leitner,s.baron,b.z.katz,d.h.wreschner,muc1/x protein immunization enhances cdna immunization in generating anti-muc1 alpha/beta junction antibodies that target malignant cells,cancer res,66(2006)11247-11253.
[0014]
[11]e.pichinuk,i.benhar,o.jacobi,m.chalik,l.weiss,r.ziv,c.sympson,a.karwa,n.i.smorodinsky,d.b.rubinstein,d.h.wreschner,antibody targeting of cell-bound muc1 sea domain kills tumor cells,cancer res,72(2012)3324-3336.
[0015]
[12]d.b.rubinstein,m.karmely,e.pichinuk,r.ziv,i.benhar,n.feng,n.i.smorodinsky,d.h.wreschner,the muc1 oncoprotein as a functional target:immunotoxin binding to alpha/beta junction mediates cell killing,int j cancer,124(2009)46-54.
[0016]
[13]d.v.gold,z.karanjawala,d.e.modrak,d.m.goldenberg,r.h.hruban,pam4-reactive muc1 is a biomarker for early pancreatic adenocarcinoma,clin cancer res,13(2007)7380-7387.
[0017]
本文对以上参考文献的承认不应被推断为意味着这些参考文献以任何方式与本发明所公开的主题的专利性相关。
背景技术
[0018]
muc1糖蛋白由多种高发生率、高死亡率的人上皮恶性肿瘤(包括乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和结肠癌)，以及由多发性骨髓瘤的恶性浆细胞和急性骨髓性白血病的骨髓性细胞过度表达。由于其优先被恶性细胞高表达，并且由于其在细胞表面上表达并因此是裸露的分子，所以已经将muc1作为定向癌症疗法的靶标和疾病进展的标记物进行了研究[1,2]。
[0019]
在结构上，muc1分子是一种跨膜糖蛋白(称为muc-tm)。muc-tm是由包含20个氨基酸长的序列的20至125个重复(称为可变数目串联重复，vntr)的细胞外结构域、跨膜结构域以及介导细胞内信号传导的短胞质尾区组成的异源二聚体(参见图1a)。muc1分子在sea模块内被自蛋白水解切割，该模块是具有120个氨基酸的高度保守结构域。这导致含有串联重复阵列的大的细胞外α亚基以强非共价相互作用结合到含有该分子的跨膜结构域和胞质结构域的跨膜β亚基。链与链的结合是间断性的：链以断续的方式结合链。当链始终保持在细胞表面上时，具有其vntr的链仅间断性地保持细胞结合。
[0020]
文献中已经报道过许多抗muc1抗体，其中大多数针对的是链的高免疫原性vntr。尽管抗vntr抗体可以在体外成功地结合muc1+细胞，但是含有vntr的muc1α链在体内脱落进入外周循环严重损害了抗vntr抗体在临床上影响表达muc1的肿瘤的能力。链从肿瘤细胞表面脱落不仅大大降低了抗链抗体的muc1靶标的数量，而且此外，在体内的外周循环中自由循环的muc1α链可以结合并且中和抗vntr抗体或抗糖基化vntr抗体，从而限制它们的甚至是到达表达muc1的肿瘤的能力。
[0021]
已经提出将识别vntr的癌症特异性的截短o糖型的抗体(诸如抗体pankomab-gex、5e5、sm3和vu-2-g7)用作克服靶向由正常组织表达的muc1的潜在毒性的可能方式。然而，对靶向α链vntr的限制(图1a)，即其从细胞表面脱落及其能够结合治疗性施用的抗muc1抗体
的问题仍然存在[3-7]。
[0022]
由于这些抗体的靶标的不稳定性，如上所述，该靶标仅以断续的机制间断性地结合肿瘤细胞，所以还没有抗muc1 vntr抗体被证明是临床有效的[4,8,9]。值得注意的是，fiedler等人在抗vntr癌症特异性糖基化抗体pankomab-gex的临床试验中报道了16个稳定疾病病例[4]。然而，该研究是抗vntr抗体的i期试验，其中主要研究目标是抗体安全性而不是抗肿瘤功效，因此观察到的稳定疾病病例不能得到真正解释。迄今为止，没有抗muc1 vntr的抗体，也没有抗muc1的链的任何抗体显示对人的肿瘤有效。
[0023]
与α链及其vntr相反，由α亚基与β亚基的细胞外部分的相互作用而形成的muc1 sea结构域是稳定的细胞膜固定的分子部分。rubinstein等人和pichinuk等人所著的文献[10-12]公开了抗muc1α/β连接部抗体。


技术实现要素：

[0024]
在第一方面，本发明提供结合muc1 sea结构域的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：
[0025]
a.由seq id no.25表示的重链互补决定区(cdrh)1、由seq id no.26表示的cdrh2、由seq id no.27表示的cdrh3，以及由seq id no.28表示的轻链互补决定区(cdrl)1、由seq id no.29表示的cdrl2，以及由seq id no.30表示的cdrl3；或者
[0026]
b.由seq id no.31表示的重链互补决定区(cdrh)1、由seq id no.32表示的cdrh2、由seq id no.33表示的cdrh3，以及由seq id no.34表示的轻链互补决定区(cdrl)1、由seq id no.35表示的cdrl2，以及由seq id no.36表示的cdrl3；或者
[0027]
c.由seq id no.37表示的重链互补决定区(cdrh)1、由seq id no.38表示的cdrh2、由seq id no.39表示的cdrh3，以及由seq id no.40表示的轻链互补决定区(cdrl)1、由seq id no.41表示的cdrl2，以及由seq id no.42表示的cdrl3；或者
[0028]
d.由seq id no.43表示的重链互补决定区(cdrh)1、由seq id no.44表示的cdrh2、由seq id no.45表示的cdrh3，以及由seq id no.46表示的轻链互补决定区(cdrl)1、由seq id no.47表示的cdrl2，以及由seq id no.48表示的cdrl3；或者
[0029]
e.由seq id no.49表示的重链互补决定区(cdrh)1、由seq id no.50表示的cdrh2、由seq id no.51表示的cdrh3，以及由seq id no.52表示的轻链互补决定区(cdrl)1、由seq id no.53表示的cdrl2，以及由seq id no.54表示的cdrl3；或者
[0030]
f.由seq id no.55表示的重链互补决定区(cdrh)1、由seq id no.56表示的cdrh2、由seq id no.57表示的cdrh3，以及由seq id no.58表示的轻链互补决定区(cdrl)1、由seq id no.59表示的cdrl2，以及由seq id no.60表示的cdrl3。
[0031]
在一些实施方案中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
[0032]
a.所述重链可变区由与seq id no.1表示的核酸序列至少70％相同的核酸序列编码，并且其中所述轻链可变区由与seq id no.2至少70％相同的核酸序列编码；或者
[0033]
b.所述重链可变区由与seq id no.3表示的核酸序列至少70％相同的核酸序列编码，并且其中所述轻链可变区由与seq id no.4至少70％相同的核酸序列编码；或者
[0034]
c.所述重链可变区由与seq id no.5表示的核酸序列至少70％相同的核酸序列编码，并且其中所述轻链可变区由与seq id no.6至少70％相同的核酸序列编码；或者
[0035]
d.所述重链可变区由与seq id no.7表示的核酸序列至少70％相同的核酸序列编码，并且其中所述轻链可变区由与seq id no.8至少70％相同的核酸序列编码；或者
[0036]
e.所述重链可变区由与seq id no.9表示的核酸序列至少70％相同的核酸序列编码，并且其中所述轻链可变区由与seq id no.10至少70％相同的核酸序列编码；或者
[0037]
f.所述重链可变区由与seq id no.11表示的核酸序列至少70％相同的核酸序列编码，并且其中所述轻链可变区由与seq id no.12至少70％相同的核酸序列编码。
[0038]
在一些实施方案中，所述抗体包含：
[0039]
a.包含由seq id no.13表示的氨基酸序列或其变体的重链可变区和包含由seq id no.14表示的氨基酸序列或其变体的轻链可变区；或者
[0040]
b.包含由seq id no.15表示的氨基酸序列或其变体的重链可变区和包含由seq id no.16表示的氨基酸序列或其变体的轻链可变区；或者
[0041]
c.包含由seq id no.17表示的氨基酸序列或其变体的重链可变区和包含由seq id no.18表示的氨基酸序列或其变体的轻链可变区；或者
[0042]
d.包含由seq id no.19表示的氨基酸序列或其变体的重链可变区和包含由seq id no.20表示的氨基酸序列或其变体的轻链可变区；或者
[0043]
e.包含由seq id no.21表示的氨基酸序列或其变体的重链可变区和包含由seq id no.22表示的氨基酸序列或其变体的轻链可变区；或者
[0044]
f.包含由seq id no.23表示的氨基酸序列或其变体的重链可变区和包含由seq id no.24表示的氨基酸序列或其变体的轻链可变区。
[0045]
在一些实施方案中，所述抗体是完整的小鼠抗体、完整的嵌合抗体、完整的人源化抗体(例如，其中抗体序列部分来源于小鼠序列并且部分来源于人)，或完整的人抗体。
[0046]
在一些实施方案中，所述其抗原结合片段是fv、单链fv(scfv)、单链fv-fc(scfv-fc)、fab’、fab、f(ab’)2或f(ab)2。
[0047]
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段在免疫组织化学实验中鉴定muc1 sea，该免疫组织化学实验在来自新鲜冷冻(ff)组织的甲醛固定切片上和/或在石蜡包埋甲醛固定(peff)组织上进行，以及/或者通过表达muc1的人细胞的荧光激活细胞分选(facs)分析进行。
[0048]
在另一个实施方案中，本发明提供分离的核酸分子，其包含编码如本文所述的本发明抗体或其任何抗原结合片段的核苷酸序列。
[0049]
在另一个实施方案中，本发明提供表达载体，其包含本发明的分离的核酸分子。
[0050]
在另一个实施方案中，本发明提供宿主细胞，其用本发明的表达载体转染。
[0051]
在另一个实施方案中，本发明提供免疫偶联物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段和附加的细胞毒性剂或治疗剂。
[0052]
在某些实施方案中，所述细胞毒性剂选自由以下项组成的组：烷基化药物、蒽环类药物、嘧啶衍生物、长春花生物碱、光动力药物、含铂化合物、紫杉烷类、拓扑异构酶抑制剂、核糖体失活剂、诱导dna损伤的药剂、微管蛋白抑制剂、抗有丝分裂剂、放射性同位素、细胞毒性抗体和细菌毒素。
[0053]
在一个实施方案中，所述细胞毒性剂是假单胞菌外毒素。
[0054]
在一个实施方案中，所述免疫偶联物在施用于患有癌症的受试者后使肿瘤体积缩
小。
[0055]
在另一个实施方案中，本发明提供双特异性抗体，其包含与结合不同抗原靶标的第二抗体结合的本发明抗体或其抗原结合片段。
[0056]
在另一个实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含：作为活性成分的本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，或本发明的免疫偶联物，或本发明的双特异性抗体，以及药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
[0057]
在一个实施方案中，所述药物组合物用于治疗疾病或疾患，例如癌症。
[0058]
在一个实施方案中，所述药物组合物还包含附加的治疗剂。
[0059]
在一些实施方案中，本发明提供治疗或改善疾病或疾患的方法，其包括：向对其有需要的受试者施用治疗有效量的至少一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者本发明的免疫偶联物、或双特异性抗体、或药物组合物。
[0060]
在一个实施方案中，所述方法还包括向对其有需要的受试者施用附加的治疗剂。
[0061]
在一个实施方案中，所述疾病或疾患是癌症。
[0062]
在一个实施方案中，所述癌症是表达muc1的癌症。
[0063]
在一些实施方案中，所述癌症选自由以下项组成的组：肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤和急性骨髓性白血病。
[0064]
已知所有列举的癌症类型均在其恶性细胞上表达muc1。
[0065]
在一个实施方案中，所述疾病或疾患是自体免疫疾病或炎症性疾病。
[0066]
在一些实施方案中，所述自体免疫疾病或炎症性疾病选自但又不限于由以下项组成的组：类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、系统性红斑狼疮、淀粉样变性和自体免疫胰腺炎。
[0067]
在一个实施方案中，所述疾病或疾患是非恶性但异常的且临床上显著的生长状况，如囊肿，例如肾囊肿、甲状腺囊肿和甲状腺肿块，或肝囊肿。
[0068]
在一些实施方案中，本发明提供在治疗或改善疾病或疾患的方法中使用的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者本发明的免疫偶联物、或双特异性抗体、或药物组合物，所述方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段、所述免疫偶联物、所述双特异性抗体，或所述药物组合物。
[0069]
在一个实施方案中，所述方法还包括向对其有需要的受试者施用附加的治疗剂。
[0070]
在一个实施方案中，所述疾病或疾患是癌症。
[0071]
在一个实施方案中，所述癌症是表达muc1的癌症。
[0072]
在一个实施方案中，所述疾病或疾患是自体免疫疾病或炎症性疾病。
[0073]
在一个实施方案中，所述疾病或疾患是非恶性的异常生长状况，如囊肿，例如肾囊肿、甲状腺囊肿和甲状腺肿块，或肝囊肿。
[0074]
在另一方面，本发明提供诊断受试者的疾病或疾患的方法，其中所述疾病或疾患与muc-1表达相关联，所述方法包括：
[0075]
a.使从所述患者获得的活检组织与至少一种本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；以及
[0076]
b.检测所述分离的单克隆抗体或其任何抗原结合片段；
[0077]
其中在活检组织中检测到过表达muc1 sea的细胞表明受试者被诊断患有疾病或
疾患。
[0078]
在一个实施方案中，所述疾病或疾患是癌症。
[0079]
在一个实施方案中，所述疾病或疾患是自体免疫疾病或炎症性疾病。
[0080]
在一个实施方案中，所述疾病或疾患是非恶性的临床上显著的异常生长状况，如囊肿，例如肾囊肿、甲状腺囊肿和甲状腺肿块，或肝囊肿。
[0081]
在一个实施方案中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段被可检测地标记。
[0082]
在另一方面，本发明提供疾病或疾患的成像方法，所述方法包括：
[0083]
a.将本发明的至少一种分离的抗muc1 sea单克隆抗体或其抗原结合片段引入受试者体内，其中所述抗体或其抗原结合片段用放射性同位素或用可视化剂(即，可以例如通过扫描而可视化的作用剂)可检测地标记；以及
[0084]
b.使所述可检测地标记的分离的抗muc1 sea单克隆抗体或其任何抗原结合片段可视化；
[0085]
其中检测到用所述同位素或用所述可视化剂标记的细胞和/或组织指示所述受试者中所述疾病或疾患的存在和/或定位，以及/或者所述疾病或疾患的转移的程度和/或存在。
[0086]
在一个实施方案中，所述疾病或疾患是癌症。
[0087]
在一个实施方案中，所述疾病或疾患是自体免疫疾病或炎症性疾病。
[0088]
在一个实施方案中，所述疾病或疾患是非恶性的异常生长状况，如囊肿，例如肾囊肿、甲状腺囊肿和甲状腺肿块，或肝囊肿。
附图说明
[0089]
为了更好地理解本文所公开的主题并且为了举例说明该主题在实践中可以如何实施，现在将参考附图仅通过非限制性示例的方式对实施方案进行描述：
[0090]
图1a至图1c是muc1-tm分子、muc1-x同种型分子和重组muc1-x分子的示意图。(1a)从n端(n)到c端(c)，muc1-tm由以下部分组成：n端信号肽，随后是30个氨基酸长的片段(n30)，得到n端和c端侧接可变串联重复阵列(vntr)的序列。之后是muc1-x同种型(1b)和muc1 x、muc1-xex(1c)的可溶性细胞外结构域所共有的区域。β亚基细胞外结构域由紧接跨膜(tm)结构域和胞质(ct)结构域的n端的58个氨基酸组成。sea模块包含由α和β这两种亚基贡献的120个氨基酸。重组可溶性muc1-xex蛋白(1c)包括信号肽、n端的30个氨基酸长的序列和sea模块区。
[0091]
图1d至图1k是显示抗muc1 sea抗体dmb5f3的流式细胞术分析的图。用muc1-tm稳定转染的da3细胞(1d)或未转染的da3细胞(1e)与抗muc1 sea mab dmb5f3反应，然后与fitc偶联物反应(箭头所标示的描记线)。muc1+人胰腺癌细胞系colo357(1f)以及muc1+乳腺癌细胞t47d和zr75(1h，1j)与dmb5f3反应(箭头所标示的描记线)。在所有四幅小图中，未用箭头标示的描记线代表与单独的二级抗体结合的细胞，而用箭头标示的描记线代表与dmb5f3和二级抗体两者反应的细胞。存在可溶性muc1-xex蛋白完全竞争掉抗muc1 sea与muc1+细胞的结合(由muc1-xex介导的被消除的结合由1g、1i和1k中的空心箭头指示)。
[0092]
图2示出抗muc1 seaα-β连接部单克隆抗体的可变区的氨基酸序列。对于所有序列，提出以下通式结构：前导序列-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。
[0093]
图3a至图3n示出由抗muc1 seaα-β连接部抗体dmb5f3描绘的muc1表达的结构。图3a至图3d：正常胰腺组织(3a和3b)和恶性胰腺组织(3c和3d)的石蜡包埋微阵列用dmb5f3染色。dmb5f3以近似圆周的模式强烈染色恶性细胞(3c和3d)，而在正常胰腺腺泡细胞中仅观察到弱顶端阳性(3a(i)，黑色箭头)。添加muc1-xex蛋白连同dmb5f3竞争性地消除了染色(3b)，表明dmb5f3结合的特异性。图3e至图3h：来自4名患者的石蜡包埋的正常乳腺组织(3e和3f)和恶性侵袭性乳腺导管腺癌(3g和3h)用dmb5f3抗体染色。图3i至图3n：6名患者的乳腺癌活检组织标本(每个标本由相邻非恶性组织及其包围的肿瘤组成)用dmb5f3染色。在每个标本中，dmb5f3以近似圆周的模式强烈染色侵袭性癌上皮细胞(暗染色)。相比之下，相邻的正常腺上皮细胞仅显示弱顶端阳性(黑色箭头)。
[0094]
图4a至图4o示出用抗muc1 seaα-β连接部抗体对组织微阵列进行ihc染色：
[0095]
图4a至图4l：使用抗muc1 seaα-β连接部抗体对肺癌、前列腺癌、结肠癌和乳腺癌进行ihc染色。肺癌、前列腺癌、结肠癌和乳腺癌的石蜡包埋微阵列用抗体dmb5f3染色，代表性切片分别以图4a、图4d、图4g和图4j示出。图4b、图4e、图4h和图4k示出更高的放大率，而图4a、图4d、图4g和图4j中以及图4b、图4e、图4h和图4k中的三角形用于确定放大区域的方向。在100μg/ml竞争性可溶性muc1-xex蛋白存在下，用抗体dmb5f3染色再次被消除，从而证明抗体dmb5f3的特异性(未示出)。图4c、图4f、图4i和图4l示出用非特异性小鼠免疫球蛋白进行的对照染色。抗体dmb5f3以近似圆周的模式强烈染色恶性细胞。图4a、图4d、图4g和图4j底部的线(在线的任一端具有箭头)和图4b、图4e、图4h和图4k底部的线(在线的任一端具有实心圆)分别表示200微米和100微米。暗染色沉淀表示muc1蛋白(将图4a、图4b、图4d、图4e、图4g、图4h、图4j和图4k与图4c、图4f、图4i和图4l进行比较)。图4a、图4d、图4g和图4j中的组织分别来源于病理性2级肺腺癌、病理性5级前列腺腺癌、病理性3级结肠腺癌和浸润性乳腺导管腺癌。
[0096]
图4m至图4o：确证用抗muc1 seaα-β连接部抗体对正常胰腺组织和恶性胰腺组织进行ihc染色。为了确证muc1在胰腺癌中的高表达和改变的分子结构，用抗muc1 sea将附加的胰腺恶性肿瘤染色并与正常组织进行比较。正常胰腺组织(图4m)和恶性胰腺组织(图4n和图4o)的石蜡包埋微阵列用抗体dmb5f3染色。染色证实正常胰腺腺泡细胞中存在弱顶端阳性(图4m)，而恶性细胞始终以近似圆周的模式染色(图4n和图4o)。
[0097]
图5a至图5d是对chdmb5f3、爱必妥和赫赛汀的杀细胞活性进行比较的图，这三种物质中的每一种均通过蛋白zz与假单胞菌外毒素pe38连接。将所得的三种zz-pe38免疫毒素与人肿瘤细胞系t47d、kb、a431和n87反应(分别为图5a至图5d)。免疫毒素chdmb5f3:zz-pe38(椭圆形描记线)、爱必妥:zz-pe38(菱形描记线)和赫赛汀:zz-pe38(矩形描记线)以不同的抗体浓度(x轴)与细胞反应。通过碱性磷酸酶测定法评估细胞存活率(y轴)。在仅添加了zz-pe38毒素(5nm)的对照孔中测定总(100％)存活率。
[0098]
图6a至图6d示出chdmb5f3:zz-pe38在异种移植到裸鼠体内的人胰腺肿瘤中的体内细胞毒性。图6a：用muc1
+
胰腺肿瘤colo357对裸鼠接种(第0天)。然后将异种移植的小鼠分成三组：在第1、6、9、14、22和29天，a组接受chdmb5f3:zz-pe38、b组接受非特异性的匹配同种型igg-zz:pe38(每次注射5μg)，而c组仅接受hepes缓冲液；所有施用均为静脉内施用(时间点由箭头指示)。在注射期期间并且直至第38天，在以下三组中每周测量肿瘤体积：接受chdmb5f3:zz-pe38免疫毒素的小鼠、接受非特异性的匹配同种型higg-zz:pe38的小鼠，
和接受hepes缓冲液的小鼠。肿瘤体积(以mm3为单位)出现在y轴上，而照片图像显示hepes对照小鼠中的肿瘤(图6b)和接受chdmb5f3:zz-pe38免疫毒素的小鼠中的肿瘤(图6c)。图6d：为了定量抗muc sea dmb5f3-zz-p38免疫毒素的血清半衰期，向小鼠施用单一5微克剂量，并且通过连续稀释的elisa测量血清水平。与第7天(7d)相比，第14天(14d)和第28天(28d)的chdmb5f3血清水平分别降低至1/2和1/4。
[0099]
图7a至图7d示出chdmb5f3:zz-pe38免疫毒素在体内的细胞毒性，证明scid小鼠中muc1+胰腺癌异种移植物的消融。图7a：scid小鼠在第0天皮下接种人colo357胰腺癌细胞，并且被分成三组：组[1]接受5μgchdmb5f3:zz-pe38免疫毒素，组[2]接受5μg非特异性的匹配同种型人ig:zz-pe38偶联物，组[3]接受hepes缓冲液。在第1、4、8、11、16、24、31和38天对这三组的全部异种移植小鼠进行注射。在细胞接种后比较肿瘤体积，直到49天。直方图代表每组的平均肿瘤体积，而每个星号代表各个小鼠的值。左侧的y轴表示组1和组2的肿瘤体积(以mm3为单位)；右侧的y轴则表示组3(hepes缓冲液组)中的肿瘤体积，其延伸至500mm3，以包括hepes对照组中的较大肿瘤体积。组3中数值高于500mm3点的两个点表示肿瘤体积705mm3和1008mm3。图7b至图7d示出来自每个组的代表性小鼠及其在49天肿瘤测量期结束时的肿瘤体积。图7b：接受chdmb5f3:zz-pe38免疫毒素的小鼠，图7c：接受非特异性人ig:zz-pe38偶联物的小鼠，图7d：仅接受hepes缓冲液的小鼠。
具体实施方式
[0100]
本发明提供针对muc1 seaα-β连接部(称为sea结构域)的单克隆抗体(mab)的序列，这类单克隆抗体在体内具有强效抗癌活性。
[0101]
本发明提供针对muc1 sea结构域的抗体(本文称为dmb5f3、dmb7f3、dmb4b4、dmb10f10、dmb4f4、dmb10b7、dmb13d11和dmc209)的序列。
[0102]
如以下的实施例所示，用被命名为dmb5f3的mab对来自一系列恶性肿瘤(包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和胰腺癌)的细胞进行免疫组织化学染色揭示了正常细胞对比恶性细胞上的muc1表达之间的定量差异和定性差异：dmb5f3以近似圆周的模式强烈染色恶性细胞，而正常胰腺和乳腺组织中的muc1在导管/腺泡细胞中仅显示弱顶端阳性模式。与zz-pe38连接的嵌合(小鼠-人)dmb5f3(zz是与假单胞菌外毒素pe38融合的igg结合蛋白)在体外诱导muc1+恶性细胞的剧烈细胞毒性。抗muc1 dmb5f3:zz-pe38蛋白-外毒素构建体的细胞杀伤强度与靶细胞表达的muc1水平相关，表明muc1表达的阈值是细胞杀伤所必需的。为了证明抗体dmb5f3在体内对肿瘤杀伤的作用，将muc1+colo357人胰腺癌细胞异种移植到裸鼠和scid小鼠中，然后用chdmb5f3:zz-pe38免疫复合物处理。在两种移植模型(裸鼠和scid小鼠)中，chdmb5f3:zz-pe38证实了显著的体内抗肿瘤活性，与伴随对照相比抑制scid小鼠中高达90％的肿瘤体积。
[0103]
因此，本发明提供了用于治疗表达muc1的恶性肿瘤的抗体。
[0104]
因此，在其第一方面，本发明提供结合muc1 sea结构域的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。
[0105]
术语“muc1 sea结构域”(本文也称为“muc1 sea模块”)是指通过muc1α亚基与muc1β亚基的细胞外部分的相互作用而形成的120个氨基酸的高度保守结构域。因此，其定位在muc1α-β连接部处并且是稳定的细胞膜固定部分；它在任何时候都不从细胞表面脱落(参见
图1a、图1b和图1c，由椭圆形指示的区域)。
[0106]
本领域已知的sea结构域被定义为位于人muc1蛋白(uniprotkb-a0a087x2a4(a0a087x2a4_human))的氨基酸264与氨基酸384之间的区域。
[0107]
muc1跨膜糖蛋白(muc-tm)是由包含20个氨基酸长的序列的20至125个重复(称为可变数目串联重复，vntr)的细胞外结构域、跨膜结构域以及介导细胞内信号传导的短胞质尾区组成的异源二聚体。muc1在sea模块内被自蛋白水解切割。这导致含有串联重复阵列的大的细胞外α亚基以强非共价相互作用结合到含有该分子的跨膜结构域和胞质结构域的跨膜β亚基。
[0108]
具体地讲，本发明提供结合muc1 sea结构域的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：
[0109]
a.由seq id no.25表示的重链互补决定区(cdrh)1、由seq id no.26表示的cdrh2、由seq id no.27表示的cdrh3，以及由seq id no.28表示的轻链互补决定区(cdrl)1、由seq id no.29表示的cdrl2，以及由seq id no.30表示的cdrl3；或者
[0110]
b.由seq id no.31表示的重链互补决定区(cdrh)1、由seq id no.32表示的cdrh2、由seq id no.33表示的cdrh3，以及由seq id no.34表示的轻链互补决定区(cdrl)1、由seq id no.35表示的cdrl2，以及由seq id no.36表示的cdrl3；或者
[0111]
c.由seq id no.37表示的重链互补决定区(cdrh)1、由seq id no.38表示的cdrh2、由seq id no.39表示的cdrh3，以及由seq id no.40表示的轻链互补决定区(cdrl)1、由seq id no.41表示的cdrl2，以及由seq id no.42表示的cdrl3；或者
[0112]
d.由seq id no.43表示的重链互补决定区(cdrh)1、由seq id no.44表示的cdrh2、由seq id no.45表示的cdrh3，以及由seq id no.46表示的轻链互补决定区(cdrl)1、由seq id no.47表示的cdrl2，以及由seq id no.48表示的cdrl3；或者
[0113]
e.由seq id no.49表示的重链互补决定区(cdrh)1、由seq id no.50表示的cdrh2、由seq id no.51表示的cdrh3，以及由seq id no.52表示的轻链互补决定区(cdrl)1、由seq id no.53表示的cdrl2，以及由seq id no.54表示的cdrl3；或者
[0114]
f.由seq id no.55表示的重链互补决定区(cdrh)1、由seq id no.56表示的cdrh2、由seq id no.57表示的cdrh3，以及由seq id no.58表示的轻链互补决定区(cdrl)1、由seq id no.59表示的cdrl2，以及由seq id no.60表示的cdrl3。
[0115]
如上文所指出的，本发明提供结合muc1 sea结构域的分离的单克隆抗体。术语“抗体”是指由免疫球蛋白基因编码的多肽，其特异性地结合与识别抗原(在本发明的情况下为muc1 sea结构域)。
[0116]
如本文所定义的术语“单克隆抗体”或“mab”是指同源抗体群体，即，构成该群体的各个抗体除了可能天然存在的稀有突变外都是相同的。单克隆抗体针对单一抗原性位点(表位)。
[0117]
单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法来制备和纯化。例如，单克隆抗体可以从取自免疫动物(例如，兔、大鼠、小鼠或猴)的脾或淋巴结的b细胞制备。
[0118]
单克隆抗体的纯化可以使用本领域已知的任何方法进行，例如通过亲和层析法，即通过使用与特定表位(或抗原)偶联的亲和柱。替代性地，抗体的纯化可以基于使用蛋白a和蛋白g柱层析法。
[0119]
如本领域已知的，示例性抗体结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻链”和一条“重链”。每条链的n端限定了主要负责抗原(表位)识别的具有约100至110个或更多个氨基酸的可变区。
[0120]
因此，术语“重链可变区”(vh)和“轻链可变区”(v
l
)分别指这些重链和轻链。更具体地讲，可变区被细分为高变区和框架(fr)区。高变区在特定位置相对于该位置最常见的氨基酸具有高比例的不同氨基酸。具有更稳定的氨基酸序列的四个fr区将高变区隔开。高变区直接接触抗原表面的一部分。为此，本文将高变区称为“互补决定区”或“cdr”，这些cdr定位在抗体的重链处(“重链互补决定区”)，还定位在抗体的轻链处(“轻链互补决定区”)。
[0121]
从n端到c端，轻链和重链都包含结构域fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。cdr主要负责结合抗原的表位。每条链的cdr通常被称为cdr1、cdr2和cdr3(从n端开始按顺序编号)，并且通常也通过该cdr所在的链来鉴定。
[0122]
因此，互补决定区cdrh1、cdrh2和cdrh3是指从抗体重链的n端开始的三个互补决定区(本文也称为重链互补决定区)，而互补决定区cdrl1、cdrl2和cdrl3是指从抗体轻链的n端开始的三个互补决定区(本文也称为轻链互补决定区)。
[0123]
本发明涵盖本发明分离的抗muc1 sea结构域单克隆抗体的抗原结合片段。
[0124]
如本文所用，术语“抗原结合片段”涉及全长抗体的保留该抗体结合muc1sea结构域的特异性的片段。抗原结合片段涵盖但不限于fv、单链fv(scfv)、单链fv-fc(scfv-fc)、fab’、fab、f(ab’)2和f(ab)2。
[0125]
此类片段可以通过本领域已知的任何方法产生，例如通过蛋白水解切割，使用酶诸如木瓜蛋白酶(以产生fab片段)或胃蛋白酶(以产生f(ab')2片段)。
[0126]
因此，在根据本发明的抗体的一些实施方案中，其中所述抗体是选自由以下项组成的组的抗体片段：单链fv-fc(scfv-fc)分子、单链fv(scfv)、fv、fab’、fab、f(ab’)2和f(ab)2。
[0127]
在具体实施方案中，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与muc1 sea结构域结合。
[0128]
如下文的实施例5中所展示，施用包含抗体dmb5f3和细胞毒性部分的免疫复合物使小鼠的体内癌症模型中的肿瘤体积显著缩小。因此，在具体实施方案中，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段能够有效地缩小受试者的肿瘤体积。
[0129]
在本发明的上下文中，术语“缩小”肿瘤体积意味着如通过本领域已知的任何手段测量的，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段将肿瘤尺寸相比于不存在本发明的抗体或其抗原结合片段的情况下的肿瘤尺寸至少减小约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％。在某些实施方案中，术语“缩小”意味着至少减小约50％、60％、70％、80％或90％。
[0130]
在一些实施方案中，分离的抗muc1 sea结构域单克隆抗体是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[0131]
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指具有来自一个物种的抗原结合可变结构域(例如，鼠抗体的可变结构域)和来自不同物种(例如，人)的恒定结构域的抗体。
[0132]
如本文所用，术语“人源化抗体”是指基于非人物种(例如小鼠)的结构的抗体，所述非人物种的氨基酸序列已被修饰以增加其与人类中天然产生的抗体变体的相似性。
[0133]
如本文所用，术语“人抗体”是指具有与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列并且/或者已使用本领域已知的用于制备人抗体的任何技术制备出来的抗体。该定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
[0134]
用于制备嵌合抗体、人源化抗体和人抗体的方法是本领域熟知的。
[0135]
为了制备大量的抗体(嵌合抗体、人源化抗体或人抗体)，可以通过用含有该抗体的重链和轻链的ig表达载体转染细胞(例如cho细胞)来制备表达该抗体的稳定细胞系。然后可以例如在生物反应器系统中制造这些抗体。可以使用公认的单克隆抗体纯化方法将这些抗体纯化至临床级。然后，可以基于上清液中的抗体水平选择并扩增产生高水平的抗muc1 sea结构域抗体的克隆，如通过本领域已知的任何方法(例如muc1 sea结构域特异性elisa测定法)所测试的。为特定克隆开发的主细胞库可以充当所有临床级批次的起始生长材料。
[0136]
在一些实施方案中，本发明提供抗muc1 sea结构域分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区由与seq id no.1表示的核酸序列至少70％、或75％、或80％、或85％、或90％或更高百分比相同的核酸序列编码，并且其中所述轻链可变区由与seq id no.2表示的核酸序列至少70％、或75％、或80％、或85％、或90％或更高百分比相同的核酸序列编码。
[0137]
在其他实施方案中，本发明提供抗muc1 sea结构域分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段由重链可变区和轻链可变区组成，其中所述重链可变区由与seq id no.3表示的核酸序列至少70％、或75％、或80％、或85％、或90％或更高百分比相同的核酸序列编码，并且其中所述轻链可变区由与seq id no.4表示的核酸序列至少70％、或75％、或80％、或85％、或90％或更高百分比相同的核酸序列编码。
[0138]
在一些另外的实施方案中，本发明提供抗muc1 sea结构域分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段由重链可变区和轻链可变区组成，其中所述重链可变区由与seq id no.5表示的核酸序列至少70％、或75％、或80％、或85％、或90％或更高百分比相同的核酸序列编码，并且其中所述轻链可变区由与seq id no.6表示的核酸序列至少70％、或75％、或80％、或85％、或90％或更高百分比相同的核酸序列编码。
[0139]
在一些实施方案中，本发明提供抗muc1-sea结构域分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段由重链可变区和轻链可变区组成，其中所述重链可变区由与seq id no.7表示的核酸序列至少70％、或75％、或80％、或85％、或90％或更高百分比相同的核酸序列编码，并且其中所述轻链可变区由与seq id no.8表示的核酸序列至少70％、或75％、或80％、或85％、或90％或更高百分比相同的核酸序列编码。
[0140]
在一些实施方案中，本发明提供抗muc1 sea结构域分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可
变区由与seq id no.9表示的核酸序列至少70％、或75％、或80％、或85％、或90％或更高百分比相同的核酸序列编码，并且其中所述轻链可变区由与seq id no.10表示的核酸序列至少70％、或75％、或80％、或85％、或90％或更高百分比相同的核酸序列编码。
[0141]
在一些实施方案中，本发明提供抗muc1 sea结构域分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区由与seq id no.11表示的核酸序列至少70％、或75％、或80％、或85％、或90％或更高百分比相同的核酸序列编码，并且其中所述轻链可变区由与seq id no.12表示的核酸序列至少70％、或75％、或80％、或85％、或90％或更高百分比相同的核酸序列编码。
[0142]
在一些实施方案中，本发明提供抗muc1 sea结构域分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由seq id no.13表示的氨基酸序列或其变体，所述轻链可变区包含由seq id no.14表示的氨基酸序列或其变体。
[0143]
在其他实施方案中，本发明提供抗muc1 sea结构域分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由seq id no.15表示的氨基酸序列或其变体，所述轻链可变区包含由seq id no.16表示的氨基酸序列或其变体。
[0144]
在一些另外的实施方案中，本发明提供抗muc1 sea结构域分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由seq id no.17表示的氨基酸序列或其变体，所述轻链可变区包含由seq id no.18表示的氨基酸序列或其变体。
[0145]
在一些实施方案中，本发明提供抗muc1 sea结构域分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由seq id no.19表示的氨基酸序列或其变体，所述轻链可变区包含由seq id no.20表示的氨基酸序列或其变体。
[0146]
在某些实施方案中，本发明提供抗muc1 sea结构域分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由seq id no.21表示的氨基酸序列或其变体，所述轻链可变区包含由seq id no.22表示的氨基酸序列或其变体。
[0147]
在一些实施方案中，本发明提供抗muc1 sea结构域分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由seq id no.23表示的氨基酸序列或其变体，所述轻链可变区包含由seq id no.24表示的氨基酸序列或其变体。
[0148]
在根据本发明的分离的抗体的其他实施方案中，其中所述抗体是抗muc1sea结构域分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含由seq id no.25至30表示的六个cdr序列，以及重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no.13具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与seq id no:14具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[0149]
在根据本发明的分离的抗体的其他实施方案中，其中所述抗体是抗muc1sea结构域分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含由seq id no.31至36表示的六
个cdr序列，以及重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no:15具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与seq id no:16具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[0150]
在根据本发明的分离的抗体的另外实施方案中，其中所述抗体是抗muc1sea结构域分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含由seq id no.37至42表示的六个cdr序列，以及重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no.17具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与seq id no.18具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[0151]
在根据本发明的分离的抗体的各种实施方案中，其中所述抗体是抗muc1sea结构域分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含由seq id no.43至48表示的六个cdr序列，以及重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no.19具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与seq id no.20具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[0152]
在根据本发明的分离的抗体的其他实施方案中，其中所述抗体是抗muc1sea结构域分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含由seq id no.49至54表示的六个cdr序列，以及重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no.21具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与seq id no.22具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[0153]
在根据本发明的分离的抗体的另外实施方案中，其中所述抗体是抗muc1sea结构域分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含由seq id no.55至60表示的六个cdr序列，以及重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no.23具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与seq id no:24具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[0154]
在另一个实施方案中，本发明提供分离的单克隆抗体，其与包含以下部分的抗体竞争：
[0155]
(a)具有seq id no.25的重链cdr1、具有seq id no.26的重链cdr2，和具有seq id no.27的重链cdr3；以及
[0156]
具有seq id no.28的轻链cdr1、具有seq id no.29的轻链cdr2，和具有seq id no.30的轻链cdr3；或者
[0157]
(b)具有seq id no.31的重链cdr1、具有seq id no.32的重链cdr2，和具有seq id no.33的重链cdr3；以及
[0158]
具有seq id no.34的轻链cdr1、具有seq id no.35的轻链cdr2，和具有seq id no.36的轻链cdr3；或者
[0159]
(c)具有seq id no.37的重链cdr1、具有seq id no.38的重链cdr2，和具有seq id no.39的重链cdr3；以及
[0160]
具有seq id no.40的轻链cdr1、具有seq id no.41的轻链cdr2，和具有seq id no.42的轻链cdr3；或者
[0161]
(d)具有seq id no.43的重链cdr1、具有seq id no.44的重链cdr2，和具有seq id no.45的重链cdr3；以及
[0162]
具有seq id no.46的轻链cdr1、具有seq id no.47的轻链cdr2，和具有seq id no.48的轻链cdr3；或者
[0163]
(e)具有seq id no.49的重链cdr1、具有seq id no.50的重链cdr2，和具有seq id no.51的重链cdr3；以及
[0164]
具有seq id no.52的轻链cdr1、具有seq id no.53的轻链cdr2，和具有seq id no.54的轻链cdr3；或者
[0165]
(f)具有seq id no.55的重链cdr1、具有seq id no.56的重链cdr2，和具有seq id no.57的重链cdr3；以及
[0166]
具有seq id no.58的轻链cdr1、具有seq id no.59的轻链cdr2，和具有seq id no.60的轻链cdr3。
[0167]
编码本文称为dmb5f3、dmb7f3、dmb4b4、dmb4f4、dmb10b7和dmc209的抗体的重链和轻链的核酸序列详述于下表1中。此外，本文所述抗体的重链和轻链的氨基酸序列详述于下表2中。此外，上述抗体的cdr的序列显示在下表3中。
[0168]
dmb4b4和dmb10f10具有相同的氨基酸序列。
[0169]
dmb4f4是mig-γ1。dmb10b7和dmb13d11是miga。然而，所有三种抗体的可变区dmb4f4、dmb10b7和dmb13d11是相同的。
[0170]
表1：核酸序列
[0171]
[0172]
[0173]
[0174][0175]
表2：氨基酸序列
[0176]
[0177][0178]
cdr序列在重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列内突出显示，并且列于表3中。
[0179]
表3：cdr氨基酸序列
[0180]
[0181]
[0182][0183]
抗体的基因组来源在以下多个表中示出。
[0184]
表4：组i，dmb5f3
[0185][0186]
表5：组ii，dmb7f3
[0187][0188]
表6：第三组，dmb4b4、dmb10f10
[0189][0190]
表7：组iv，dmb4f4、dmb10b7、dmb13d11
[0191][0192][0193]
表8：dmc209
[0194][0195]
本发明还涵盖重链可变区和轻链可变区的变体。这些变体可以在重链和轻链的互补决定区中包含不改变本文所述抗体的活性的突变，或者可以在框架区中包含突变。
[0196]
术语“变体”意味着与本文具体鉴定的序列不同的氨基酸序列或核苷酸序列，其中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸残基或核苷酸。
[0197]
应当理解，如本文所用，术语“添加”意味着向本文所述序列中添加任何氨基酸残基。
[0198]
变体涵盖各种氨基酸取代。氨基酸“取代”是将一种氨基酸用具有相似或不同的结构特性和/或化学特性的另一种氨基酸替换的结果。氨基酸取代可以基于所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性方面的相似性来进行。
[0199]
通常，变体涵盖保守性氨基酸取代。提供功能相似氨基酸的保守性取代表是本领域熟知的。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
[0200]
以下八组中的每一组包含彼此为保守性取代的其他示例性氨基酸：
[0201]
1)丙氨酸(a)，甘氨酸(g)；
[0202]
2)天冬氨酸(d)，谷氨酸(e)；
[0203]
3)天冬酰胺(n)，谷氨酰胺(q)；
[0204]
4)精氨酸(r)，赖氨酸(k)；
[0205]
5)异亮氨酸(i)，亮氨酸(l)，甲硫氨酸(m)，缬氨酸(v)；
[0206]
6)苯丙氨酸(f)，酪氨酸(y)，色氨酸(w)；
[0207]
7)丝氨酸(s)，苏氨酸(t)；以及
[0208]
8)半胱氨酸(c)，甲硫氨酸(m)。
[0209]
保守性核酸取代是导致如上文所定义的保守性氨基酸取代的核酸取代。
[0210]
根据本发明的变体还涵盖非极性至极性氨基酸取代，以及极性至非极性氨基酸取代。
[0211]
如本文所用，术语“氨基酸”或“氨基酸残基”是指天然存在的氨基酸与合成的氨基酸，以及功能类似于天然存在的氨基酸的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。
[0212]
变体序列是指可以通过其氨基酸序列或核苷酸序列与本文所述的氨基酸序列或核苷酸序列(例如，本文所述抗体的重链和轻链的氨基酸序列或核苷酸序列)的同一性百分比来表征的氨基酸序列或核酸序列。
[0213]
在一些实施方案中，如本文所定义的变体序列是指编码重链可变区和轻链可变区的核酸序列，这些重链可变区和轻链可变区各自具有与本文所述的重链可变区和轻链可变区的序列相比具有至少70％或75％的序列同一性、约80％或85％的序列同一性，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核苷酸序列。
[0214]
在一些其他实施方案中，如本文所定义的变体序列是指重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，这些重链可变区和轻链可变区各自具有与本文所述的重链可变区和轻链可变区的序列相比具有至少70％或75％的序列同一性、约80％或85％的序列同一性，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
[0215]
术语“抗体的活性”意味着抗体结合muc1 sea结构域并且优选地单独或作为具有细胞毒性部分的免疫复合物的一部分介导细胞毒性的能力。抗体的活性可以使用本领域熟知的方法(例如，如以下的实施例中所述)在体内或在体外测量。
[0216]
本发明抗体与其靶标蛋白的结合可以例如使用elisa、生物层干涉测量法(bli)、蛋白质印迹法或免疫荧光测定法(ifa)来测量。
[0217]
抗体的生物活性可以例如在体内癌症模型中测量，例如，如以下实施例中所详述的。
[0218]
本发明的另一个方面提供分离的核酸分子，其包含编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
[0219]
如本文所定义的术语“核酸”或“核酸分子”是指核苷酸的聚合物，其可以是单链或双链的多核苷酸，诸如脱氧核糖核酸(dna)，以及适当时的核糖核酸(rna)。这些术语还应当被理解为包括作为等同物的由核苷酸类似物制备的rna或dna的类似物，以及(适用于所描述的实施方案时)单链(诸如正义或反义)多核苷酸和双链多核苷酸。本文所使用的术语“dna”还涵盖cdna，即，通过逆转录酶(rna依赖性dna聚合酶)的作用从rna模板产生的互补或拷贝dna。
[0220]
本发明还提供包含如本文所定义的分离的核酸分子的表达载体。
[0221]
如本文所用，“表达载体”有时称为“表达媒介物”或“表达构建体”，其涵盖以下载体：诸如质粒、病毒、噬菌体、可整合的dna片段，以及其他能将dna片段整合到宿主基因组中的媒介物。表达载体通常是自我复制dna或rna构建体，其含有所需基因或其片段，以及在合适的宿主细胞中被识别并且实现所需基因的表达的可操作地连接的遗传控制元件。这些控制元件能够在合适的宿主中实现表达。根据本发明的表达载体可以有能力在细菌、酵母或哺乳动物宿主细胞(仅举几例)中表达。
[0222]
本发明的又一个方面提供用根据本发明的分离的核酸分子或根据本发明的表达载体转染的宿主细胞。
[0223]
如本文使用，术语“宿主细胞”是指对引入根据本发明的分离的核酸分子或根据本发明的表达载体敏感的细胞。优选地，所述细胞是哺乳动物细胞，例如cho细胞或ns0细胞。可以通过本领域已知的任何方法将根据本发明的分离的核酸分子或表达载体转染到宿主细胞中。
[0224]
本发明的又一个方面提供免疫偶联物，其包含根据本发明的抗体或其抗原结合片段，以及如下文所定义的附加的细胞毒性剂或治疗剂。
[0225]
术语“免疫偶联物”、“免疫复合物”在本文中可互换使用，是指偶联(连接或接合)至附加的作用剂的根据本发明的抗体或其抗原结合片段。免疫偶联物可以通过本领域技术人员已知的任何方法制备，例如，通过将所述附加的作用剂与根据本发明的抗体交联，或者通过重组dna方法。
[0226]
在某些实施方案中，免疫偶联物是免疫毒素，由此根据本发明的抗体或其抗原结合片段与细胞毒性剂偶联。如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指在接触细胞时对细胞发挥细胞毒性作用的任何作用剂。此类细胞毒性剂是本领域技术人员熟知的。可以用于本发明的免疫复合物中的细胞毒性剂的示例包括但不限于：烷基化药物、蒽环类药物、嘧啶衍生物、长春花生物碱、光动力药物、含铂化合物、紫杉烷类、拓扑异构酶抑制剂、核糖体失活剂(例如白树毒素)、诱导dna损伤的药剂(例如卡奇霉素)、微管蛋白抑制剂(例如emtansine)、抗有丝分裂剂(例如单甲基澳瑞他汀)或细菌毒素。细胞毒性剂也可以是放射性同位素或细胞毒性抗体。在一个实施方案中，该毒性剂是假单胞菌外毒素，例如zz-pe38(与假单胞菌外毒素融合的zz igg结合蛋白)。
[0227]
本发明还涵盖能够结合两个分开的靶标或表位的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含根据本发明的抗体或其抗原结合片段以及附加的抗体或其抗原结合片段。
[0228]
因此，在一个具体实施方案中，本发明提供免疫复合物，其包含：与muc1 sea结构域结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：
[0229]
由seq id no.25表示的重链互补决定区(cdrh)1、由seq id no.26表示的cdrh2、由seq id no.27表示的cdrh3，以及由seq id no.28表示的轻链互补决定区(cdrl)1、由seq id no.29表示的cdrl2，以及由seq id no.30表示的cdrl3；以及细胞毒性剂(为假单胞菌外毒素)，并且其中所述免疫复合物在施用于患有癌症的受试者后使肿瘤体积缩小。
[0230]
本发明的抗muc1 sea结构域抗体可以与至少一种附加的治疗剂组合施用。
[0231]
本文所使用的术语“附加的治疗剂”是指可以用于治疗疾病或疾患(例如癌症)的任何作用剂。
[0232]
在某些实施方案中，该附加的治疗剂是附加的抗体。如本文所定义的术语“附加的抗体”是指本发明的抗体(即至少两种本发明抗体的组合使用)以及不是根据本发明的抗体的抗体，后者可以与本发明的抗体组合用于治疗疾病或疾患(例如癌症)。此类其他抗体包括但不限于抗cd22抗体、抗cd30抗体、抗her2受体抗体、抗vegf抗体、抗egfr抗体、抗肿瘤相关抗原(taa)抗体和抗检查点抑制剂。
[0233]
所述附加的治疗剂也可以是化疗剂或抗炎剂。
[0234]
本发明还提供药物组合物，其包含：作为活性成分的至少一种本发明的分离的抗muc1 sea抗体或其抗原结合片段，或者如本文所定义的免疫偶联物，以及药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
[0235]
在一个具体实施方案中，所述药物组合物用于治疗与muc1的过表达相关联的疾病或疾患。
[0236]
术语“与muc1的过表达相关联的疾病或疾患”在本文中以其最广泛的含义使用，是指以muc1的异常表达为特征的任何疾病。在一个具体实施方案中，所述与muc1的过表达相
关联的疾病或疾患是癌症。示例包括但不限于：肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、小肠癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、多发性骨髓瘤，或急性骨髓性白血病。
[0237]
在其他实施方案中，所述与muc1的过表达相关联的疾病或疾患是自体免疫疾病或炎症性疾病。自体免疫疾病或炎症性疾病的非限制性示例包括类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、系统性红斑狼疮、淀粉样变性和自体免疫胰腺炎。
[0238]
在其他实施方案中，所述疾病或疾患是非恶性的异常生长状况，如囊肿，例如临床上显著的肾囊肿，大的非功能性甲状腺囊肿和甲状腺肿块、肝囊肿等等。
[0239]
本发明的“药物组合物”通常包含如本文所定义的抗体或其任何抗原结合片段、缓冲剂(调节组合物的渗透压的作用剂)，以及任选地，一种或多种本领域已知的药学上可接受的载剂、赋形剂和/或稀释剂。
[0240]
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂”包括本领域已知的任何溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂，等等。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物和植物油的溶剂或分散介质。每种载剂从与其他成分相容并且对受试者无害的意义上说，应当既是药学上可接受的，也是生理学上可接受的。除任何常规介质或作用剂与活性成分不相容的情况之外，考虑其在治疗组合物中的用途。
[0241]
在其他实施方案中，根据本发明的药物组合物还包含附加的治疗剂。附加的治疗剂的非限制性示例包括抗muc1抗体、抗cd22抗体、抗cd30抗体、抗her2受体抗体、抗vegf抗体、抗egfr抗体、抗taa抗体和检查点抑制剂。
[0242]
本发明还提供治疗或改善与muc1的过表达相关联的疾病或疾患(例如癌症)的方法，包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段、或者包含本发明的抗体或其抗原结合片段的免疫偶联物，或者包含本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段或者免疫偶联物的药物组合物。
[0243]
术语“受试者”或“患者”可互换使用，是指可以受益于本发明的受试者，诸如哺乳动物(例如犬、猫、羊、猪、马、牛或人类)。在一个具体实施方案中，患者是人类。与muc1的过表达相关联的疾病或疾患的诊断可以由熟练的医师通过本领域已知的方法进行。
[0244]
在本发明的上下文中，术语“对其有需要的受试者”尤其是指患有如本文所定义的与muc1的过表达相关联的疾病或疾患的哺乳动物，特别是人类受试者。
[0245]
应当理解，如本文所用，术语“治疗”、“处理”或其变型意味着减轻、预防、治愈、逆转、改善、减弱、缓解、最小化、抑制或停止疾病或病症的有害作用，或者延迟如本文所定义的与muc1的过表达相关联的疾病或疾患(例如癌症)的一种或多种临床适应症的发作。在根据本发明的方法的一些实施方案中，其中所述方法还包括向对其有需要的受试者施用如本文所定义的附加的治疗剂。
[0246]
根据本发明的施用可以通过以下途径中的任一种进行：口服施用；静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、鞘内注射或皮下注射；直肠内施用；鼻内施用、眼部施用或局部施用。
[0247]
在具体实施方案中，根据本发明的施用以静脉内方式进行。
[0248]
如本文所定义的抗体或抗体片段、包含所述抗体或抗体片段的任何药物组合物或者包含所述抗体或抗体片段的任何偶联物能够以单剂量或多剂量施用于受试者。
[0249]
用于本文所定义的目的的根据本发明的分离的单克隆抗体或其任何抗原结合片
段，或者根据本发明的药物组合物的“治疗有效量”是由本领域已知的用于治愈、阻止或者至少减轻或改善医学病症的考虑因素决定的。对于本发明方法中所使用的任何制备物，剂量或治疗有效量可以最初从体外细胞培养测定法或基于合适的动物模型来估计。
[0250]
在一些实施方案中，根据本发明的治疗有效量在10μg/kg至约50mg/kg的范围内。
[0251]
在其他实施方案中，根据本发明的治疗有效量在0.1mg/kg至40mg/kg、1mg/kg至10mg/kg或5mg/kg至10mg/kg的范围内。
[0252]
具体的示例性剂量包括但不限于0.25mg/kg、或0.75mg/kg、或2.5mg/kg、或5mg/kg、或10mg/kg，根据医师的判断，这些剂量作为日剂量、或每三天一次、或每周一次给予。在一个实施方案中，所述剂量静脉内给予。
[0253]
本发明还提供了根据本发明的分离的抗muc1 sea抗体或其任何抗原结合片段、或者根据本发明的免疫复合物、或者根据本发明的药物组合物，其在如本文所定义的治疗或改善与muc1的过表达相关联的疾病或疾患(例如癌症)的方法中使用。
[0254]
更进一步，本发明提供本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段、免疫复合物或药物组合物在制备用于治疗或改善如本文所定义的与muc1的过表达相关联的疾病或疾患(例如癌症)的药物中的用途。
[0255]
应当理解，术语“纯化的”或“分离的”是指从其天然环境中取出、分离或分开的分子，诸如氨基酸或核酸序列、肽、多肽或抗体。因此，“分离的抗体”是纯化的抗体。如本文所用，术语“纯化的”或“纯化”还指从样品中除去污染物。
[0256]
在另一方面，本发明提供在获自受试者的活检组织中诊断疾病或疾患(例如，癌症)的方法，所述方法包括：
[0257]
a.使所述活检组织与至少一种本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；以及
[0258]
b.检测所述分离的单克隆抗体或其任何抗原结合片段；
[0259]
其中在所述活检组织中检测到过表达muc1 sea的细胞用作所述疾病或疾患(例如癌症)的指征。
[0260]
对本发明的分离的抗体检测muc1-sea表达的能力的评估可以通过本领域已知的任何方法进行，例如通过免疫组织化学实验或流式细胞术进行。免疫组织化学实验可以在来自新鲜冷冻(ff)组织的甲醛固定切片上以及在石蜡包埋甲醛固定(peff)组织上进行。例如，如以下实施例2所示，抗体dmb5f3染色的表达muc1的细胞在ff切片和peff切片中都存在。在使用流式细胞术的情况下，该抗体还能够识别表达muc1的细胞。在各种实施方案中，根据本发明的分离的抗体可以根据本领域已知的任何方法进行标记。在其他实施方案中，检测可以基于使用二级抗体鉴定所述抗体。
[0261]
术语“活检组织”在本文中以其最广泛的含义使用，是指取自如本文所定义的其中可以检测到过表达muc1 sea的细胞的受试者的任何活检组织。活检组织可以从哺乳动物(包括人类)获得，并且涵盖含有细胞的流体样品，和组织样品。在一些实施方案中，流体样品是血液、血浆、血清、淋巴液或尿液。在一些实施方案中，活检组织是怀疑含有癌细胞的组织样品。
[0262]
在另一方面，本发明提供疾病或疾患的成像方法，所述方法包括：
[0263]
a.将本发明的至少一种分离的抗muc1 sea单克隆抗体或其抗原结合片段引入受
试者体内，其中所述抗体或其抗原结合片段用放射性同位素或用可视化剂(即，可以例如通过扫描而可视化的作用剂)可检测地标记；以及
[0264]
b.使所述可检测地标记的分离的抗muc1 sea单克隆抗体或其任何抗原结合片段可视化；
[0265]
其中检测到用所述同位素或用所述可视化剂标记的细胞和/或组织指示所述受试者中所述疾病或疾患的存在和/或定位，以及/或者所述疾病或疾患的转移的程度和/或存在。
[0266]
如本文所用，术语“约”表示值可以相比所提及的值偏离高达1％、更具体地5％、更具体地10％、更具体地15％，并且在一些情况下高达比20％高或低的百分比，所述偏离范围包括整数值，并且如果适用，还包括构成连续范围的非整数值。尽管公开和描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于本文所公开的具体实施例、方法步骤和组合物，因为这些方法步骤和组合物可以稍微变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而非旨在进行限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求及其等同技术来限定。
[0267]
必须指出，如本说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”均包括多个指代物，除非上下文另有明确说明。
[0268]
在说明书和随后的实施例和权利要求书中的各处，除非上下文另有要求，否则词语“包括”及其变型形式诸如“包含”和“含有”应当被理解为暗示包括所提到的整体或步骤，或者整体或步骤的组，但不排除任何其他的整体或步骤，或者整体或步骤的组。
[0269]
实施例
[0270]
材料和方法
[0271]
试剂和抗体
[0272]
除非另外指明，否则所有试剂和化学品均购自sigma(st.louis,mo)。用于细胞复染或免疫组织化学显影的二级抗体购自jackson immunoresearch laboratories(bar harbor,me)。
[0273]
小鼠的免疫和杂交瘤的生成
[0274]
最初用间隔21天的5次连续皮内dna免疫接种对小鼠进行免疫。该免疫dna由编码muc1-tm蛋白的pcl-muc1-tm表达载体质粒组成。然后用muc1-x蛋白(重组细菌muc1-xex)的细胞外结构域连同不完全弗氏佐剂一起对小鼠进行加强免疫。用于这些免疫接种的细菌合成的重组muc1-xex蛋白自发地自切割，产生muc1-x a亚基和b亚基，这些亚基强烈而非共价地彼此相互作用，从而形成非常稳定的异二聚体切割的muc1-xex蛋白。通过将非分泌性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞融合来制备杂交瘤，然后通过elisa测定法进行筛选。
[0275]
用于确定抗muc1多克隆和单克隆抗体与muc1-x蛋白的细胞外结构域的结合的elisa
[0276]
用重组muc1蛋白包被elisa免疫测定板(costar)，然后封闭。接着将来自初始杂交瘤的用过的培养基施加到孔中。温育后，取出样品，用pbs/tween洗涤孔。用辣根过氧化物酶(hrp)偶联的抗小鼠抗体对结合抗体进行检测。
[0277]
用于选择抗muc1单克隆抗体的两层筛选
[0278]
如上文的elisa测定法中所述，通过评估抗体与muc1-x(muc1-xex)的细胞外结构域的结合进行杂交瘤的初步筛选。为了选择分泌不仅识别muc1-xex而且还识别完整细胞表
面muc1-tm蛋白的抗体的杂交瘤，对在第一次筛选中呈现阳性信号的那些杂交瘤进行第二层筛选。这包括使用表达人muc1-tm的小鼠细胞转染子(称为da3-tm细胞)并且平行地使用不表达人muc1的相同亲代细胞(称为da3-par细胞)的流式细胞术分析。该程序确保选择不仅结合muc1-x和muc1-tm所共有的muc1部分，而且当由哺乳动物细胞表达时还识别细胞表面的人muc1-tm分子的抗体。
[0279]
细胞系和细胞培养物
[0280]
da3-par亲代小鼠乳腺细胞(不表达人muc1)、用cdna(编码全长人muc1-tm)稳定转染的da3-tm小鼠乳腺细胞、细胞系t47d和zr75(人乳腺癌)，细胞系kb(人表皮样癌)、colo357(人胰腺癌)、n87(人胃癌)和cho-k1(中国仓鼠卵巢细胞)都在杜氏改良伊格尔培养基(dmem)、rpmi和dmem:f12(1:1)培养基中生长[12]。
[0281]
动物
[0282]
遵照以色列卫生部的法规和标准，饲养七周龄无胸腺(裸)和scid小鼠(harlan laboratories,madison,wi)，直到在由以色列特拉维夫大学(tau)实验动物护理认证机构伦理委员会批准的设施中处死。
[0283]
流式细胞术分析
[0284]
胰蛋白酶消化后，洗涤表达muc1的肿瘤细胞并且与dmb5f3(0.5μg/ml)在有或没有muc1-xex竞争剂(100μg/ml)的情况下在4℃下温育1小时。用facs缓冲液洗涤后，在4℃下添加荧光素标记的山羊抗小鼠igg，维持45分钟。在facscalibur
tm
(becton dickinson)上通过流式细胞术检测结合的igg。
[0285]
免疫组织化学(ihc)染色
[0286]
正常和恶性的胰腺组织和乳腺组织的微阵列购自us biomax(derwood,md)。根据制造商的说明书，使用dako autostainer link 48(dako,santa clara,ca)获得自动化免疫染色。用柠檬酸盐缓冲液在室温下进行30分钟抗原修复。通过添加envision flex过氧化物酶阻断试剂(dako)维持30分钟，之后与dmb5f3(5μg/ml)一起温育2小时，来阻断内源性过氧化物酶活性。通过添加与过氧化物酶和二级抗体偶联的聚合物葡聚糖维持15分钟(envision-flex/hrp，dako)以及添加二氨基联苯胺维持10分钟(dakocytomation)，来检测免疫组织化学反应。随后用苏木精复染10分钟。
[0287]
抗muc1-sea模块单克隆抗体的序列测定
[0288]
用试剂l，根据该试剂的技术手册(ambion inc.,foster city,ca)从dmb杂交瘤系列中分离rna。如下测定rna序列：根据primescripttm第一链cdna合成试剂盒(takara bio inc.,mountain view,ca)的技术手册，使用通用或同种型特异性反义引物，通过逆转录总rna来生成cdna。根据涉及cdna末端的快速扩增的标准操作程序(genscript,nj,usa)进行vh抗体片段和vl抗体片段的扩增，之后将这些抗体片段单独克隆到标准克隆载体中。通过菌落pcr对具有正确大小的插入片段的克隆进行测序，并且对每个片段的至少五个具有此类插入片段的菌落进行测序，其中共有序列通过不同克隆的比对而得到。
[0289]
用于在中国仓鼠卵巢细胞中进行哺乳动物表达的嵌合chdmb5f3的构建
[0290]
人嵌合dmb5f3(chdmb5f3)由小鼠dmb5f3产生。哺乳动物载体pmaz-igh和pmaz-igl用作表达分别编码与人γ1重链和人κ轻链融合的dmb5f3的vh区和vl区的cdna的主链[mazor等人，j immunol methods,321(2007)41-59；mazor等人，cancer lett,257(2007)
124-135]。将生成的pmaz igh-chdmb5f3载体和pmaz igl-chdmb5f3载体用于转染，并且在cho细胞中表达所得的嵌合抗体chdmb5f3。稳定转染的cho细胞分泌chdmb5f3，其通过蛋白a亲和层析法纯化。
[0291]
制备chdmb5f3:zz-pe38免疫复合物
[0292]
chdmb5f3:zz-pe38免疫复合物的生成如pichinuk等人[11]中所述进行。简言之，将chdmb5f3与纯化的重组zz-pe38蛋白在20mm hepes缓冲液中以2倍摩尔过量的zz-pe38混合，然后在4℃下温育2小时。过量的zz-pe38和未偶联的chdmb5f3抗体通过流过sephadex g200分级柱而除去。
[0293]
体外细胞存活率测定
[0294]
将t47d、kb、a431和n87癌细胞(20,000个细胞/孔)接种在96孔细胞培养板中，使其在37℃下在5％co2中生长。接种后，将chdmb5f3:zz-pe38免疫复合物以100ng/ml的浓度直接施加于细胞。阴性对照由仅与zz-pe38毒素反应且未偶联至chdmb5f3抗体或者仅与chdmb5f3单克隆抗体反应且缺乏zz-pe38毒素的靶细胞组成。根据每孔的碱性磷酸酶活性评估细胞存活率。结果计算为2至3次实验的平均值，一式三份地进行。
[0295]
用于确定chdmb5f3:zz-pe38免疫复合物与muc1-xex蛋白的结合的elisa
[0296]
为了定量小鼠血清中的chdmb5f3水平，用重组muc1-xex蛋白包被elisa免疫测定板(参见图1c，其中示出了示意性结构)，然后封闭。在应用单剂量5μg chdmb5f3:zz-pe38免疫复合物后的第1、7、15和28天，将小鼠血清以两倍稀释度施加到elisa孔中，并且用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗人fc抗体检测结合的抗体。结果计算为2至3次实验的平均值，一式三份地进行。
[0297]
体内细胞毒性测定法
[0298]
通过使用colo357(一种muc1
+
人胰腺癌细胞系)建立两种可定量测量的人肿瘤异种移植物模型：一种在7周龄雌性无胸腺裸鼠中建立，另一种在7周龄scid小鼠中建立。将悬浮在小体积(100μl)hepes缓冲液中的总共3 106个colo357细胞皮下注射到小鼠的右胁腹中。在裸鼠研究和scid小鼠研究中，将这些小鼠分成三组(5只小鼠/组)：组1接受5μg chdmb5f3:zz-pe38(0.25mg/kg)，组2接受5μg非特异性人ig:zz-pe38(0.25mg/kg)，组3仅接受等体积的hepes缓冲液。在无胸腺裸鼠(7周龄雌性小鼠)中，在注射colo357细胞后24小时开始在这三个实验组中施用抗muc1免疫毒素、非特异性免疫毒素或hepes。注射方案包括在每个实验组中，在第1、6、9、15、22和29天进行总共六次静脉内(iv)施用(参见沿x轴的黑色箭头，图6)。在scid小鼠(7周龄雌性小鼠)中，在这三组中的每个组中，在注射胰腺肿瘤细胞后24小时开始类似地施用chdmb5f3:zz-pe38、非特异性人ig:zz-pe38和hepes。总体施用方案包括在这三组中的每个组中，在第1、4、8、11、16、24、31和38天进行八次iv注射。用数显卡尺在每个实验组中连续地评估肿瘤生长。根据公式0.5
×
l
×
w2计算肿瘤体积，其中l是肿瘤长度并且w是肿瘤宽度，如tomayko和reynolds(cancer chemother pharmacol,24(1989)148-154)中所述。所有的动物实验都得到tau机构审查委员会的批准。
[0299]
统计数据
[0300]
根据简单的配对单尾t检验进行体内肿瘤生长的统计分析。小于0.05的p值被认为具有统计学意义。
[0301]
结果
[0302]
实施例1：与细胞结合的muc1α-β连接部结合的dmb mab的生成和测序，以及dmb5f3 mab的表征
[0303]
由用脾细胞产生的杂交瘤生成抗muc1单克隆igg，这些脾细胞分离自具有高滴度的多克隆抗muc1-xex抗体的接种小鼠。用于免疫接种的muc1-xex重组蛋白，及其与跨膜muc1-tm蛋白和muc1-xex蛋白的关系示于图1(将图1c与图1b和图1a进行比较)中。因此总共生成了七种dmb mab。
[0304]
所有抗muc1 seaα-β连接部单克隆抗体的可变区的核苷酸序列均如上文在“材料和方法”中所述进行测定，并且这些mab的推导的氨基酸序列在图2中呈现。所得mab的测序显示它们被聚类为4个组，命名为[i]dmb5f3
[i]
、[ii]dmb7f3
[ii]
、[iii]dmb4b4
[iii-a]
和dmb10f10
[iii-b]
，以及[iv]dmb4f4
[iv-a]
、dmb10b7
[iv-b]
和dmb13d11
[iv-c]
(参见图2以及表1和表2的完整核苷酸序列和氨基酸序列)。每组中的序列揭示了就dmb5f3
[i]
和dmb7f3
[ii]
而言的独特mab序列，或者揭示了就组[iii]和组[iv]而言的具有相同vh序列和v
l
序列的mab。
[0305]
所有抗体的可变结构域都是亲和力成熟的典型结构域，如由初免-加强生成的抗体所预期的。除了组[iv]mab dmb10b7
[iv-b]
和dmb13d11
[iv-c]
之外的所有mab都是ig-γ1。组[iv]包含三个具有相同vh序列和v
l
序列的mab：一个mab(dmb4f4
[iv-a]
)是ig-γ1亚型，而其余两个mab(dmb10b7
[iv-b]
和dmb13d11
[iv-c]
)是iga。
[0306]
所有七种抗muc1α-β连接部mab均牢固地结合到表达跨膜muc1-tm蛋白的细胞，如通过流式细胞术评估的(图1d至图1k)。还通过在来自新鲜冷冻(ff)组织的甲醛固定切片上以及在石蜡包埋甲醛固定(peff)组织上进行的免疫组织化学实验，评估了来自这四个mab组中的每个组的代表性mab检测muc1-tm表达的能力。抗体dmb5f3
[i]
将ff切片和peff切片两者中存在的表达muc1的细胞染色(参见下文)，而dmb7f3
[ii]
和来自组[iv]的mab仅在ff切片上染色，与之相比，组[iii]mab尽管与表达muc1的细胞良好结合(如通过流式细胞术评估的)，但是与ff切片和peff切片两者均不反应(数据未示出)。
[0307]
vh结构域来源于具有9个体细胞突变的小鼠种系v基因ighv3-1*02。它与ncbi blastp搜索中得分最高的相同序列105/122(86％)相同。vl结构域(v-k)来源于具有3个体细胞突变的小鼠种系v基因igkv5-48*01。它与ncbi blastp搜索中得分最高的相同序列101/107(94％)相同。
[0308]
流式细胞术分析显示，dmb5f3与用全长muc1(da3-tm)稳定转染的da3细胞强烈结合(图1d)，而不表达muc1的未转染da3-par细胞始终为阴性(图1e)。colo357(一种muc1阳性人胰腺癌细胞系)，以及muc1阳性乳腺癌细胞系t47d和zr75，表现出与dmb5f3的强反应性(图1d、图1f、图1h和图1j)。添加竞争性可溶性重组muc1-xex蛋白(参见图1c的重组muc1-xex的结构)消除了所有dmb5f3细胞结合(图1g、图1i和图1k)，从而证实抗体特异性。
[0309]
实施例2：用dmb5f3对人胰腺组织切片和乳腺组织切片进行ihc染色
[0310]
为了确定单克隆dmb5f3结合恶性组织和正常组织的程度，对组织微阵列中的多种恶性肿瘤(包括乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌和结肠癌)进行免疫组织化学染色(示例性结果示于图3和图4中)。尽管以前的报道证明muc1在恶性肿瘤中过表达，但是对muc1表达进行大量分析的基本原理在于以下重大事实，即本文所述的抗muc1 mab识别muc1 sea模块，并且是通过用重组muc1-xex蛋白(参见图1c)而非用muc1-tm蛋白(参见图1a)进行免疫接种而生成的。迄今为止，对muc1表达的分析几乎完全是用识别链vntr部分内的表位的抗体进
行的。因此，首次分析抗muc1-sea结构域抗体的细胞识别模式激起了人们浓厚的兴趣。用于这些分析的组织微阵列包括以下各项(括号中为biomax微阵列名称)：6例具有相邻非肿瘤组织的胰腺肿瘤(pa241)；40例不同的胰腺肿瘤和8例正常胰腺组织(pa483)；乳腺浆细胞性乳腺炎、腺病和纤维腺瘤各3个样品，和36例侵袭性乳腺导管癌加上2例侵袭性乳腺小叶癌(br963a)；以及结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌各10例，此外两个切片各自来自对应的正常组织(tp481)。用dmb5f3免疫组织化学染色的正常组织和恶性组织的代表性复合阵列示于图3中。在(微阵列pa241和pa483中的)46例胰腺肿瘤中，44例表现出与dmb5f3的强反应性；肿瘤细胞以近似圆周的模式染色(例如参见图3c和图3d)。相比之下，正常胰腺组织dmb5f3反应性限于胰腺导管上皮细胞的腔表面(图3a)。
[0311]
在br963a微阵列上分析的乳腺组织样品中，在包括正常乳腺组织、浆细胞性乳腺炎、腺病和纤维腺瘤的非恶性组织中观察到最低限度的染色至未观察到染色。相比之下，36例侵袭性乳腺导管癌中有21例示出极高的dmb5f3反应性，4例示出低水平表达，11例样品示出很少的表达至未示出表达。检查的胰腺组织既包括腺泡腺癌(图3d)，又包括导管腺癌(图3c以及图4n和图4o)，并且该微阵列中的恶性乳腺组织由侵袭性导管癌(图3g和图3h)组成。来自胰腺癌(图3c和图3d以及图4n和图4o)、乳腺癌(图3g和图3h，以及图3i至图3n，患者1至6)以及肺癌、前列腺癌和结肠癌(图4a、图4d和图4g分别是图4b、图4e和图4h在更高的放大倍数下的视图)的恶性细胞与dmb5f3强烈反应，且具有近似圆周的细胞染色。相比之下，正常胰腺腺泡细胞仅显示弱顶端阳性(在图3a(i)中由黑色箭头指示；图3b和图4m中示出了更高的放大倍数)，这与先前的描述[13]一致。微阵列上的正常乳腺导管上皮细胞(图3e和图3f)和由邻近恶性肿瘤的非恶性上皮细胞形成的正常腺样结构表现出弱顶端阳性(图3i至图3n呈现了来自六名患者的活检组织切片；正常腺样结构由黑色箭头指示)。这与相同切片中的用dmb5f3抗muc1-sea抗体强烈染色的恶性细胞形成鲜明对比(图3i至图3n)。由于恶性物质和非恶性物质处于相同的微阵列样品上，从而被同时且均匀地染色，因此可以排除只凭处理和染色中的技术差异就能够解释这些发现的可能性。此外，可溶性muc1-xex将dmb5f3引起的细胞染色竞争掉的事实证实了dmb5f3的抗muc1特异性(分别比较图3a和图3b)。
[0312]
为了将这些观察结果扩展到其他肿瘤类型，用dmb5f3对肺癌、前列腺癌和结肠癌进行了免疫组织化学检查(图4a、图4d和图4g)。结果显示muc1分布模式与在乳腺癌和胰腺癌中观察到的相似(图3)。除了在细胞水平上muc1表达的密度增加之外，还观察到muc1结构的区别：抗muc1-sea dmb5f3以近似圆周的模式结合恶性细胞。此处也一样，在竞争性可溶性muc1-xex蛋白的存在下，用dmb5f3产生的染色被消除，从而证明dmb5f3的特异性(数据未示出)，并且用非免疫小鼠免疫球蛋白未观察到染色(将图4a、图4d、图4g和图4j与图4c、图4f、图4i和图4l进行比较)。在微阵列中检查的接近50个肺腺癌组织、前列腺腺癌组织、结肠腺癌组织、乳腺腺癌组织和胰腺腺癌组织中的大多数显示相似的ihc染色模式，少数表达较低量的muc1，并且一些具有可忽略不计的muc1表达。这种不均匀性一般与肿瘤表型的异质性一致，特别是与muc1的异质性一致。因为选择胰腺癌(一种高死亡率的表达muc1的恶性肿瘤)用于体内研究(参见下文)，所以检查来自另一系列患者的胰腺肿瘤组织以证实muc1表达的肿瘤相关结构发生了改变(参见图4n和图4o中的代表性染色)。虽然这些分析揭示了在腺癌细胞的整个细胞表面上圆周dmb5f3免疫反应性增加，但是以下两点值得注意：(a)免疫
组织学分析仅仅是半定量的，以及(b)在一些情况下，muc1在细胞内强烈表达，使得难以对表面表达进行比较。尽管存在这两个限制性条件，但是来源于腺癌的癌细胞清楚地表现出与dmb5f3的高细胞表面免疫反应性。
[0313]
实施例3：chdmb5f3:zz-pe38免疫复合物的体外细胞毒性
[0314]
在细胞系中(图1d至图1k)和在活检组织微阵列中(图3和图4)证实dmb5f3与表达细胞表面muc1的癌细胞的反应性之后，检查了该抗体将细胞毒性部分运送到恶性细胞中的能力。zz-pe38融合蛋白由假单胞菌外毒素pe38和来源于蛋白a的igg结合zz结构域组成。因为zz结构域与人fc紧密结合，并且显示与小鼠igg1 fc的结合可忽略不计，所以生成了嵌合dmb5f3抗体，其中用小鼠igg1-fc来替代人fc，然后将zz-pe38添加到嵌合(ch)dm5f3以形成免疫毒素复合物，如“材料和方法”中所述。
[0315]
由于单独的zz-pe38毒素不能结合到细胞或内化到细胞中，所以由dmb5f3-zz-p38免疫复合物诱导的所有肿瘤细胞毒性仅仅是由于抗muc1dmb5f3免疫复合物的细胞结合与内化而产生的[mazor等人，j immunol methods,321(2007)41-59；mazor等人，cancer lett,257(2007)124-135]。用浓度为300ng/ml的chdmb5f3、爱必妥和赫赛汀对细胞系t47d、kb、a431和n87进行细胞计数分析。发现muc1
+
t47d细胞(乳腺癌)和kb细胞(表皮样肿瘤)对chdmb5f3:zz-pe38免疫复合物介导的细胞生长抑制敏感，在低至200pm的抗体浓度下观察到肿瘤细胞毒性(图5a和图5b)。相比之下，表达其水平虽然低但仍然能够清楚检测的egfr1的t47d乳腺癌细胞对zz-pe38不敏感(图5a，菱形描记线)，并且仅对zz-pe38部分敏感(图5a，矩形描记线)。表达其水平虽然低但仍然能够清楚检测的erbb2-egfr2的kb细胞对zz-pe38不敏感(图5b，矩形描记线)。表达明显较低水平的muc1的细胞(诸如n87)显示大约40％的细胞毒性，这与在t47d细胞和kb细胞中观察到的高muc1表达和高细胞毒性形成对比(将图5d与图5a和图5b进行比较)。a431(在所研究的全部细胞系中表达最低水平的muc1的细胞系)所含有的主要细胞群未显示muc1表达，仅有小得多的细胞亚群表达低水平muc1。与这种低水平的muc1表达一致，chdmb5f3:zz-pe38免疫复合物导致a431的细胞毒性极其有限。这些结果表明，细胞表面的muc1表达和密度的阈值水平是引发细胞毒性的必要条件。在以下复合物不存在细胞毒性的情况下观察到类似的现象，即：当赫赛汀-免疫毒素复合物应用于kb细胞时，这些细胞表达其水平虽然低但仍然能够检测的erbb2-egfr2(图5b)，而当爱必妥-免疫毒素复合物应用于t47d细胞时，这些细胞也表达其水平虽然低但仍然能够检测的egfr1(图5a)。
[0316]
实施例4：chdmb5f3在裸鼠中的药代动力学
[0317]
通过评估iv施用后第1、7、14和28天的血清水平来评价chdmb5f3的体内稳定性。结果显示，与第7天相比，第14天和第28天的抗体chdmb5f3的血清水平分别降至二分之一和四分之一(图6d)，这与先前报道的体外生成的嵌合igg和临床使用的抗体在小鼠中的半衰期一致。就毒素偶联物而言，已经显示假单胞菌外毒素的半衰期由于与igg连接而延长。
[0318]
实施例5：chdmb5f3:zz-pe38免疫复合物在异种移植的人肿瘤中的体内细胞毒性
[0319]
将chdmb5f3:zzpe38免疫复合物施用于异种移植有muc1
+
人胰腺colo357细胞的裸鼠产生显著的杀细胞作用，在第21天、第28天和第35天，与接受hepes缓冲液或非特异性的匹配同种型igg-zz:pe38的对照组(图6a)相比，肿瘤体积缩小。在完成chdmb5f3:zzpe38免疫复合物的施用之后，正如预期的那样，治疗组的肿瘤体积与对照组的肿瘤体积平行地逐
渐增加，并且到第40天为止(在处死动物时)，所有三组的肿瘤体积均达到200至400mm3(图6a)。这再次证实了所施用的chdmb5f3:zzpe38的肿瘤抑制效果。
[0320]
可以想到，在异种移植的裸鼠中限制chdmb5f3:zzpe38免疫复合物的细胞毒性功效的因素是内源性循环抗体，其通过与zz接头的相互作用可以至少部分地从chdmb5f3置换zz-pe38毒素。尽管zz不结合小鼠igg1，但它可以结合小鼠igg2。由于置换导致免疫毒素功效受限并不反映抗体chdmb5f3与肿瘤细胞表面muc1的结合有缺陷，而是由于zz-pe38与chdmb5f3抗体的zz介导的连接减少所导致的毒素损失而引起的。为了避免这种复杂因素，然后在缺乏可检测的内源性抗体的scid小鼠中进行了几乎相同的研究。像在裸鼠方案中那样，将移植的scid小鼠分成三组：第一组接受chdmb5f3:zzpe38免疫复合物，第二组接受匹配的同种型igg-zz:pe38，第三组接受单独的hepes缓冲液，每个组均在注射胰腺肿瘤后24小时开始实验。如材料方法部分所指出的，该方案由在第1、4、8、11、16、24、31和38天在每组中进行连续施用组成。chdmb5f3:zz-pe38免疫复合物表现出显著的抗肿瘤作用：在用chdmb5f3:zz-pe38治疗的scid小鼠中，异种移植的colo357人肿瘤的体积与对照组相比缩小了90％之多(图7)。治疗后肿瘤体积的实际值(以mm3为单位)如下：用chdmb5f3-免疫毒素治疗的组1小鼠：2、14、16、25和36mm3；用非特异性的匹配同种型igg-zz:pe38治疗的组2小鼠：180、225、258和270mm3(不包括该组中肿瘤移植失败的一只小鼠)；用单独的hepes缓冲液处理的组3小鼠：180、245、304、705和1008mm3。施用chdmb5f3:zz-pe38的时间表延长至第31天和第38天确保直到第49天也具有抗肿瘤效果。
[0321]
实施例6：对dmc209进行测序
[0322]
按照rneasy plus micro试剂盒(qiagen，目录号：74034)的技术手册从杂交瘤细胞分离总rna。然后按照smartscribe逆转录酶(takara，目录号：639536)的技术手册，使用同种型特异性反义引物或通用引物将总rna逆转录为cdna。根据genscript的cdna末端快速扩增(race)的标准操作程序(sop)扩增重链和轻链的抗体片段。将扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中。进行菌落pcr，以筛选具有正确大小的插入片段的克隆。共有序列在表1中提供(对于重链可变区为seq id no:11，对于轻链可变区为seq id no:12)。