通过单细胞分析从肿瘤分离T细胞和T细胞受体以用于免疫疗法的方法与流程

通过单细胞分析从肿瘤分离t细胞和t细胞受体以用于免疫疗法的方法
相关申请的交叉引用
1.本专利申请要求2020年3月20日提交的美国临时专利申请号62/992,701的权益，其通过引用整体并入本文。关于联邦资助的研究或开发的声明
2.本发明是由国立卫生研究院，国家癌症研究所(national institutes of health，national cancer institute)在项目号zia bc 010984的政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。通过引用并入以电子方式递交的材料
3.在此通过引用全文并入的是与此同时提交的，并如下鉴定的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列列表：2021年3月18日提交的名为“753067_st25.txt”的一个553字节的ascii(文本)文件。发明背景
4.使用靶向由癌症特异性突变编码的新抗原的t细胞的过继细胞疗法(act)可在一些患者中产生阳性临床反应。然而，act成功用于治疗癌症和其它病症的几个障碍仍然存在。例如，目前用于产生癌症反应性t细胞的方法需要大量的时间并且可能不容易鉴定结合癌症靶标的所需t细胞受体。因此，对获得用于act的分离细胞群的改进方法仍存在需求。


技术实现要素：

5.本发明的一方面提供了制备对靶抗原具有抗原特异性的富集的t细胞群的方法，所述方法包括：从患者的肿瘤样品中分离t细胞；选择具有基因表达谱的分离的t细胞；将所选择的t细胞与未选择的细胞分离，其中分离的选择的t细胞提供对靶抗原具有抗原特异性的富集的t细胞群，其中所述靶抗原是由癌症特异性突变编码的新抗原、癌症抗原或癌症相关的病毒抗原，并且所述基因表达谱包括：(a)(i)cd4
+
和cd8
+
中的一种或两种，以及(ii)afap1il2
+
、asb2
+
、cxcl13
+
、hmox1
+
、itm2a
+
、klrb1
+
、pdlim4
+
、tigit
+
、ltb-、lyar-、rgcc-和s100a10-中的一种或多种；(b)cd4
+
以及batf
+
、cd247
+
、cxcl13
+
、dnph1
+
、dusp4
+
、gypc
+
、ifitm1
+
、igflr1
+
、itm2a
+
、klrb1
+
、lims1
+
、nmb
+
、nr3c1
+
、sh2d1a
+
、spock2
+
、supt3h
+
、tigit
+
、tnfrsf18
+
、ccl5-、cd52-、gstp1-、jun-、lgals1-、ltb-、lyar-、plp2-、rgcc-、s100a10-、vim-和zfp36-中的一种或多种；(c)cd8
+
以及afap1il2
+
、alox5ap
+
、arhgap9
+
、asb2
+
、card16
+
、cd3g
+
、cd8a
+
、cd8b
+
、clic3
+
、ctsw
+
、cxcl13
+
、cxcr6
+
、galnt2
+
、gzmb
+
、hla-dpa1
+
、hla-dpb1
+
、hla-drb1
+
、hla-drb5
+
、hmgn3
+
、hmox1
+
、itgae
+
、itm2a
+
、klrb1
+
、mpst
+
、nap1l4
+
、nell2
+
、nsmce1
+
、pdlim4
+
、ptms
+
、rab27a
+
、rarres3
+
、rbpj
+
、tigit
+
、anxa1-、eef1b2-、emp3-、il7r-、lgals3-、ltb-、lyar-、rgcc-、rpl36a-和s100a10-中的一种或多种；(d)cd8
+
以及cd39
+
、cd74
+
、cd103
+
、cd106
+
、cd137
+
、hla-dr
+
、tigit
+
、ccr7-、cd8a-、cd16-、cd45ra-、cd62l-和il7r-中的一种或多种；(e)abi3
+
、ac243960.1
+
、acp5
+
、adgrg1
+
、ahi1
+
、asb2
+
、bst2
+
、cars
+
、ccl4
+
、cd27
+
、cd2bp2
+
、cd82
+
、ctsw
+
、cxcl13
+
、cxcr6
+
、dusp4
+
、entpd1
+
、galnt2
+
、gata3
+
、gpr25
+
、gzmb
+
、hdlbp
+
、
hla-dpa1
+
、hla-drb1
+
、hmox1
+
、id2
+
、igflr1
+
、itgal
+
、linc01871
+
、linc01943
+
、mis18bp1
+
、mpst
+
、ncf4
+
、nsmce1
+
、pced1b
+
、pdcd1
+
、phpt1
+
、plekhf1
+
、prf1
+
、ptms
+
、slc1a4
+
、slf1
+
、smc4
+
、supt3h
+
、tigit
+
、tnfrsf18
+
、tox
+
、traf3ip3
+
和ypel2
+
中的一种或多种；(f)cd4
+
以及adi1
+
、ahi1
+
、arid5b+、batf
+
、cmtm7
+
、cpm
+
、cxcl13
+
、cyth1
+
、elmo1
+
、etv7
+
、fabp5
+
、fbln7
+
、fkbp5
+
、gramd1a
+
、hif1a
+
、il6st
+
、itga4
+
、itk
+
、jak3
+
、klrb1
+
、lef1
+
、lims1
+
、maf
+
、mal
+
、mir4435-2hg
+
、myl6b
+
、nap1l4
+
、nmb
+
、nr3c1
+
、pask
+
、pgm2l1
+
、pim2
+
、ppp1cc
+
、sesn3
+
、sh2d1a
+
、socs1
+
、stat1
+
、syne2
+
、tbc1d4
+
、tigit
+
、tlk1
+
、tmem123
+
、tmem70
+
、tnik
+
、tox
+
、tshz2
+
、ucp2
+
、vopp1
+
和ypel2
+
中的一种或多种；(g)cd8
+
以及ac243829.4
+
、acp5
+
、apobec3c
+
、apobec3g
+
、ccl3
+
、ccl4
+
、ccl4l2
+
、ccl5
+
、cd27
+
、cd8a
+
、cd8b
+
、cst7
+
、ctsw
+
、cxcl13
+
、dusp4
+
、entpd1
+
、fabp5
+
、galnt2
+
、gnly
+
、gzm[a
+
、gzmb
+
、gzmh
+
、gzmk
+
、havcr2
+
、hcst
+
、hla-dma
+
、hla-dpa1
+
、hla-dpb1
+
、hla-dra
+
、hla-drb1
+
、hla-drb5
+
、hmox1
+
、ifng
+
、igflr1
+
、itgal
+
、jaml
+
、linc01871
+
、lyst
+
、mir155hg
+
、nkg7
+
、plekhf1
+
、prf1
+
、ptms
+
、rgs1
+
、slf1
+
、smc4
+
、supt3h
+
、tigit
+
和tox
+
中的一种或多种；(h)ahi1
+
、cxcl13
+
、fabp5
+
、nap1l4
+
、ormdl3
+
、ppp1r16b
+
、sh2d1a
+
、tigit
+
和tox
+
；或者(i)tigit
+
、cd39+和pd-1
+
中的一种或多种。
[0006]
本发明的另一方面提供了分离对靶抗原具有抗原特异性的t细胞受体(tcr)或其抗原结合部分的方法，所述方法包括：根据本文结合本发明的其它方面所述的任何一种方法制备对所述靶抗原具有抗原特异性的富集的t细胞群；将富集的群体中的t细胞分选为单独的单个t细胞的样品；对一个或多个所述单独的单个t细胞的样品中的tcr互补决定区3(cdr3)进行测序；将由所述单独的单个t细胞的样品的核酸编码的包含cdr3的α链可变区与包含cdr3的β链可变区配对；将编码配对的α链可变区和β链可变区的核苷酸序列导入宿主细胞，并由所述宿主细胞表达配对的α链可变区和β链可变区；筛选表达对所述靶抗原具有抗原特异性的配对的α链可变区和β链可变区的宿主细胞；和选择对所述靶抗原具有抗原特异性的配对的α链可变区和β链可变区，其中分离对所述靶抗原具有抗原特异性的tcr或其抗原结合部分。
[0007]
本发明的另一方面提供了制备表达对靶抗原具有抗原特异性的tcr或其抗原结合部分的汇集的细胞群的方法，所述方法包括：(a)根据本文结合本发明的其它方面所述的任何一种方法制备对所述靶抗原具有抗原特异性的富集的t细胞群；(b)将富集的群体中的t细胞分选为单独的单个t细胞的样品；(c)对单独的单个t细胞的样品中的tcr cdr3进行测序；(d)将由所述单独的单个t细胞的样品的核酸编码的包含cdr3的α链可变区与包含cdr3的β链可变区配对；(e)将编码所述配对的α链可变区和β链可变区的核苷酸序列导入pbmc中，并由所述pbmc表达所述配对的α链可变区和β链可变区；和(f)对根据(a)制备的对所述靶抗原具有抗原特异性的富集的t细胞群的多个单独的单个t细胞的样品进行(c)、(d)和(e)，从而提供表达对靶抗原具有抗原特异性的tcr或其抗原结合部分的汇集的细胞群。
[0008]
本发明的另一方面提供了分离对靶抗原具有抗原特异性的tcr或其抗原结合部分的方法，所述方法包括：从患者的肿瘤样品中分离t细胞；将富集的群体中的t细胞分选为单独的单个t细胞的样品；对单独的单个t细胞的样品中的tcr cdr3进行测序；选择具有基因表达谱的单独的单个t细胞的样品；将由所述具有基因表达谱的单独的单个t细胞的样品的核酸编码的包含cdr3的α链可变区与包含cdr3的β链可变区配对；将编码配对的α链可变区和β链可变区的核苷酸序列导入宿主细胞，并由所述宿主细胞表达配对的α链可变区和β链
可变区；筛选表达对所述靶抗原具有抗原特异性的配对的α链可变区和β链可变区的宿主细胞；和选择对所述靶抗原具有抗原特异性的配对的α链可变区和β链可变区，其中分离对所述靶抗原具有抗原特异性的tcr或其抗原结合部分，其中所述基因表达谱包括：(a)(i)cd4
+
和cd8
+
中的一种或两种，以及(ii)afap1il2
+
、asb2
+
、cxcl13
+
、hmox1
+
、itm2a
+
、klrb1
+
、pdlim4
+
、tigit
+
、ltb-、lyar-、rgcc-和s100a10-中的一种或多种；(b)cd4
+
以及batf
+
、cd247
+
、cxcl13
+
、dnph1
+
、dusp4
+
、gypc
+
、ifitm1
+
、igflr1
+
、itm2a
+
、klrb1
+
、lims1
+
、nmb
+
、nr3c1
+
、sh2d1a
+
、spock2
+
、supt3h
+
、tigit
+
、tnfrsf18
+
、ccl5-、cd52-、gstp1-、jun-、lgals1-、ltb-、lyar-、plp2-、rgcc-、s100a10-、vim-和zfp36-中的一种或多种；(c)cd8
+
以及afap1il2
+
、alox5ap
+
、arhgap9
+
、asb2
+
、card16
+
、cd3g
+
、cd8a
+
、cd8b
+
、clic3
+
、ctsw
+
、cxcl13
+
、cxcr6
+
、galnt2
+
、gzmb
+
、hla-dpa1
+
、hla-dpb1
+
、hla-drb1
+
、hla-drb5
+
、hmgn3
+
、hmox1
+
、itgae
+
、itm2a
+
、klrb1
+
、mpst
+
、nap1l4
+
、nell2
+
、nsmce1
+
、pdlim4
+
、ptms
+
、rab27a
+
、rarres3
+
、rbpj
+
、tigit
+
、anxa1-、eef1b2-、emp3-、il7r-、lgals3-、ltb-、lyar-、rgcc-、rpl36a-和s100a10-中的一种或多种；(d)cd8
+
以及cd39
+
、cd74
+
、cd103
+
、cd106
+
、cd137
+
、hla-dr
+
、tigit
+
、ccr7-、cd8a-、cd16-、cd45ra-、cd62l-和il7r-中的一种或多种；(e)abi3
+
、ac243960.1
+
、acp5
+
、adgrg1
+
、ahi1
+
、asb2
+
、bst2
+
、cars
+
、ccl4
+
、cd27
+
、cd2bp2
+
、cd82
+
、ctsw
+
、cxcl13
+
、cxcr6
+
、dusp4
+
、entpd1
+
、galnt2
+
、gata3
+
、gpr25
+
、gzmb
+
、hdlbp
+
、hla-dpa1
+
、hla-drb1
+
、hmox1
+
、id2
+
、igflr1
+
、itgal
+
、linc01871
+
、linc01943
+
、mis18bp1
+
、mpst
+
、ncf4
+
、nsmce1
+
、pced1b
+
、pdcd1
+
、phpt1
+
、plekhf1
+
、prf1
+
、ptms
+
、slc1a4
+
、slf1
+
、smc4
+
、supt3h
+
、tigit
+
、tnfrsf18
+
、tox
+
、traf3ip3
+
和ypel2
+
中的一种或多种；(f)cd4
+
以及adi1
+
、ahi1
+
、arid5b
+
、batf
+
、cmtm7
+
、cpm
+
、cxcl13
+
、cyth1
+
、elmo1
+
、etv7
+
、fabp5
+
、fbln7
+
、fkbp5
+
、gramd1a
+
、hif1a
+
、il6st
+
、itga4
+
、itk
+
、jak3
+
、klrb1
+
、lef1
+
、lims1
+
、maf
+
、mal
+
、mir4435-2hg
+
、myl6b
+
、nap1l4
+
、nmb
+
、nr3c1
+
、pask
+
、pgm2l1
+
、pim2
+
、ppp1cc
+
、sesn3
+
、sh2d1a
+
、socs1
+
、stat1
+
、syne2
+
、tbc1d4
+
、tigit
+
、tlk1
+
、tmem123
+
、tmem70
+
、tnik
+
、tox
+
、tshz2
+
、ucp2
+
、vopp1
+
和ypel2
+
中的一种或多种；(g)cd8
+
以及ac243829.4
+
、acp5
+
、apobec3c
+
、apobec3g
+
、ccl3
+
、ccl4
+
、ccl4l2
+
、ccl5
+
、cd27
+
、cd8a
+
、cd8b
+
、cst7
+
、ctsw
+
、cxcl13
+
、dusp4
+
、entpd1
+
、fabp5
+
、galnt2
+
、gnly
+
、gzma
+
、gzmb
+
、gzmh
+
、gzmk
+
、havcr2
+
、hcst
+
、hla-dma
+
、hla-dpa1
+
、hla-dpb1
+
、hla-dra
+
、hla-drb1
+
、hla-drb5
+
、hmox1
+
、ifng
+
、igflr1
+
、itgal
+
、jaml
+
、linc01871
+
、lyst
+
、mir155hg
+
、nkg7
+
、plekhf1
+
、prf1
+
、ptms
+
、rgs1
+
、slf1
+
、smc4
+
、supt3h
+
、tigit
+
和tox
+
中的一种或多种；(h)ahi1
+
、cxcl13
+
、fabp5
+
、nap1l4
+
、ormdl3
+
、ppp1r16b
+
、sh2d1a
+
、tigit
+
和tox
+
中的一种或多种；或者(i)tigit
+
、cd39
+
和pd-1
+
中的一种或多种。
[0009]
本发明的另一方面提供了制备表达对靶抗原具有抗原特异性的tcr或其抗原结合部分的细胞群的方法，所述方法包括：根据本文结合本发明的其它方面所述的任何一种方法分离tcr或其抗原结合部分，和将编码分离的tcr或其抗原结合部分的核苷酸序列导入外周血单核细胞(pbmc)，以获得表达所述tcr或其抗原结合部分的细胞。
[0010]
本发明的其它方面提供了根据本发明方法中的任一种制备的相关的tcr或其抗原结合部分，分离的细胞群和药物组合物。
[0011]
本发明的其它方面提供了治疗或预防哺乳动物中病症的相关方法和制备用于治疗或预防哺乳动物中病症的药物的相关方法，其中所述病症是癌症或病毒病症。附图的几个视图的简要说明
[0012]
图1a显示了来自结肠直肠癌患者4323的t细胞的t-sne分析结果(t-sne图谱)。集簇编号为0-7。
[0013]
图1b显示了投影到图1a的t-sne图谱上的已知新抗原反应性tcr。已知的新抗原反应性tcr定位于集簇5(框区)。
[0014]
图1c显示了图1a的集簇5中的4323t细胞对所选基因的表达。
[0015]
图2a是患者4323的til的t-sne图谱，显示了基于集簇转录物组谱前瞻性重建的所有新抗原反应性tcr位于集簇5(框区)中。
[0016]
图2b是患者4323的til的t-sne图谱，显示了所有测试的非反应性tcr位于所有表明特异性的8个集簇(黑圈)中。
[0017]
图3a显示了来自结肠直肠癌患者4324的t细胞的t-sne分析结果(t-sne图谱)。集簇编号为0-6。
[0018]
图3b显示了投影到图3a的t-sne图谱上的已知新抗原反应性tcr。已知的新抗原反应性tcr定位于集簇6(框区)。
[0019]
图3c显示了图3a的集簇6中的4324t细胞对所选基因的表达。
[0020]
图4a显示了来自乳腺癌患者4322的t细胞的t-sne分析结果(t-sne图谱)。集簇编号为0-8。
[0021]
图4b显示了投影到图4a的t-sne图谱上的已知新抗原反应性tcr。已知的新抗原反应性tcr定位于集簇3(框区)。
[0022]
图4c显示了图4a的集簇3中的4322t细胞对所选基因的表达。
[0023]
图5a显示了来自先前的结肠直肠癌患者4323以及肺癌患者4234和4237的cd8
+ t细胞的联合t-sne分析的结果(t-sne图谱)。集簇编号为0-6。
[0024]
图5b显示了投影到图5a的t-sne图谱上的已知新抗原反应性tcr以及用4234和4237对4323 cd8+集簇的再聚类。已知的新抗原反应性tcr定位于集簇4(框区)。
[0025]
图5c显示了由图5a的集簇4中的cd8
+ 4323、4234和4237 t细胞对所选基因的表达。
[0026]
图6是显示患者4323的新抗原反应性t细胞(n＝236个细胞)和患者4323的新抗原反应性t细胞以外的细胞(n＝2597)的neotcr标签得分的图。
[0027]
图7a显示了来自结肠直肠癌患者4283的t细胞的t-sne分析结果(t-sne图谱)。集簇编号为0-4。
[0028]
图7b显示了投影到图7a的t-sne图谱上的已知新抗原反应性tcr。已知的cd4
+
新抗原反应性tcr定位于集簇2(框区)。
[0029]
图7c显示了图7a的集簇2中的4283t细胞对所选基因的表达。
[0030]
图8a显示了投影到其它患者的原始tsne图上的表达来自pt.4323(黑点)的neotcr集簇转录物组谱的neotcr标签的第95个百分位数的细胞。
[0031]
图8b显示了投影到其它患者的原始tsne图上的表达来自pt.4322(黑点)的neotcr标签的第95个百分位数的细胞。
[0032]
图8c显示了投影到其它患者的原始tsne图上的表达来自pt.4323、4234和4237(黑点)的neotcr标签的第95个百分位数的细胞。
[0033]
图9显示了通过基于抗体的tsne和基于转录物组的tsne分析的t细胞的聚类的比
较图。t细胞对来自三名nsclc患者(4234、4237和4369)的6种新抗原(dopey2、u2af1、slfn11、bpnt1和mllt4)具有反应性。新抗原反应性cd8
+ t细胞用黑点表示。
[0034]
图10显示了患者4234的tsne图。方框中的两幅tsne图分别显示了患者4234的til中cd8
+
细胞和新抗原反应性cd8
+ t细胞的分布。方框外的十幅tsne图显示了表达与新抗原反应性t细胞相关的指定分子的细胞的分布。显示了代表性的10个分子的结果，并且在所有的图中，黑点代表与上面每幅图所示的特征相关的细胞。
[0035]
图11a-11d显示了通过fbc抗体检测的细胞表面蛋白的表达。黑点代表新抗原反应性t细胞，灰点代表患者4234的til中的其它非抗原反应性t细胞。图11a：cd8a表达在新抗原反应性t细胞上是低的(dim)。图11b：ccr7和cd45ra表达均低，表明新抗原反应性细胞是效应子记忆t细胞。图11c：新抗原反应性细胞具有低(dim阳性)cd103表达并且是cd39阳性的。图11d：大多数新抗原反应性cd8 t细胞表达pd-1和tim-3。
[0036]
图12是说明根据本发明的方面使用单细胞分析从肿瘤中快速分离新抗原tcr的工作流程的示意图。本发明的方面可提供例如获得用于免疫治疗的抗肿瘤突变特异性新抗原反应性tcr的两种方式：(1)单细胞rna测序和随后应用neotcr基因标签以电脑模拟重建tcr以及(2)通过基于流式细胞术的分选，使用最小标志物，接着进行tcr重建，直接分离肿瘤新抗原反应性tcr。
[0037]
图13呈现了facs数据，其显示了在与用dmso处理的靶细胞(对照)(左图)或呈现hpv16 e4的靶细胞(右图)共培养后，用4397 tcr1转导的效应细胞对4-1bb的表达。发明的详细描述
[0038]
尽管许多肿瘤可能含有肿瘤浸润性淋巴细胞(til)，但这些当中只有一部分实际上可能与癌症突变编码的新抗原反应。存在于给定肿瘤内的许多til可以是不直接参与肿瘤的靶向免疫排斥的旁观者t细胞。以前鉴定将肿瘤靶向t细胞从混合群体中富集出来的标志物的努力已经实现了不同的成功和很少的共识。以前治疗具有基于体外新抗原反应性选择的til片段培养物的患者的努力已经显示til介导晚期转移性癌症患者中长期消退的能力。然而，til片段筛选可能是缓慢且劳动密集型的过程，其可能不会导致用纯的肿瘤反应性til群治疗患者的能力。相反，til片段筛选只能选择具有最高程度的体外反应性的用于扩增的til片段。这样的技术可以是随机过程，其中肿瘤反应性til可以由肿瘤无关的竞争者生长，导致反应性降低的治疗产物。对自体肿瘤反应性t细胞的标志物的搜寻表明，一些标志物，例如pd-1和cd39，可以富集肿瘤反应性t细胞，但不清楚这种富集是否足以允许鉴定可用于工程化t细胞治疗的tcr序列。在鉴定与癌症相关的病毒抗原反应的t细胞方面存在类似的挑战。
[0039]
本发明的方法可以通过快速鉴定与抗原(例如癌症特异性抗原和癌症相关的病毒抗原)反应的t细胞的tcr序列来改善这些和其它缺点，所述tcr序列可用于工程化用于治疗的t细胞。本发明的方法可有利地避免与发现，培养和施用含有较低频率的这种细胞的天然til群相关的不确定性。
[0040]
已经发现，对从肿瘤样本中分离的t细胞的单细胞分析揭示了存在于多种常见上皮癌中的细胞群，其包括大多数先前鉴定的与靶抗原反应的tcr。该群体可以通过本文所述的基因表达谱来定义。例如，使用靶向来自患者肿瘤的独特的体细胞个性化突变的克隆限定的t细胞受体，重构了由具有本文所述的基因表达谱的细胞表达的新的未知tcr，并且发
现它们是癌症新抗原反应性的。本发明的方面还提供了使用对基因表达谱的cite-seq分析的独立方法，其选择和鉴定癌症新抗原反应性t细胞。本发明的方法极大地增加了快速分离t细胞和tcr用于普通癌症的基于细胞的免疫治疗的可能性，而不需要培养肿瘤浸润性t细胞和昂贵且耗时的筛选。本文所述的基因表达谱也可有利地鉴定与癌症相关的病毒抗原反应的t细胞和tcr。
[0041]
还已经发现，在多种组织学的肿瘤中存在明确的癌症新抗原反应性til群，并且该群体的标签足够稳固以从混合群体中前瞻性地鉴定癌症新抗原反应性til。利用通过本文所述的本发明方法鉴定的基因表达谱，可以准确分析来自肿瘤的单个t细胞，并利用tcr信息来前瞻性地合成癌症新抗原反应性tcr用于患者治疗。
[0042]
本发明的一方面提供了制备对靶抗原具有抗原特异性的富集的t细胞群的方法。本文所用的短语“抗原特异性的”和“抗原特异性”是指t细胞可特异性结合并免疫识别抗原或其表位，从而t细胞与抗原或其表位的结合引起免疫应答。在这方面，与不是通过本发明方法获得的细胞群相比，通过本发明方法获得的t细胞群可包含较高比例的对靶抗原具有抗原特异性的t细胞。
[0043]
在本发明的一方面中，靶抗原是癌症抗原。本文所用的术语“癌症抗原”是指任何分子(例如蛋白质、多肽、肽、脂质、碳水化合物等)，其仅或主要由肿瘤细胞或癌细胞表达或过度表达，使得抗原与肿瘤或癌症相关。癌症抗原可另外由正常细胞，非肿瘤细胞或非癌细胞表达。然而，在这种情况下，正常细胞，非肿瘤细胞或非癌细胞的癌症抗原表达不如肿瘤细胞或癌细胞的表达稳固。在这点上，与正常，非肿瘤或非癌细胞表达抗原相比，肿瘤或癌细胞可以过表达抗原或以显著更高的水平表达抗原。此外，癌症抗原可以另外由不同发育或成熟状态的细胞表达。例如，癌症抗原可以另外由胚胎或胎儿期的细胞表达，这些细胞通常在成体宿主中不存在。或者，癌症抗原可以另外由干细胞或前体细胞表达，这些细胞通常在成体宿主中不存在。癌症抗原是本领域已知的，并且包括例如间皮素、cd19、cd22、cd276(b7h3)、gp100、mart-1、表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)、trp-1、trp-2、酪氨酸酶、ny-eso-1(也称为cag-3)、mage-1、mage-3等。
[0044]
在本发明的一方面中，靶抗原是由癌症特异性突变编码的新抗原。新抗原是一类在表达的蛋白质中由癌症特异性突变产生的癌症抗原。术语“新抗原”涉及由癌细胞表达的肽或蛋白质，其包括与由正常(非癌)细胞表达的相应野生型(非突变)肽或蛋白质相比的一个或多个氨基酸修饰。新抗原可以是患者特异性的。“癌症特异性突变”是存在于肿瘤或癌细胞的核酸中但不存在于相应的正常(即非肿瘤或非癌)细胞的核酸中的体细胞突变。
[0045]
在本发明的一方面中，靶抗原是病毒特异性抗原。病毒特异性抗原是本领域已知的，并且包括，例如，由病毒感染的细胞(apc)表达或呈递的任何病毒蛋白或肽，其不由未被病毒感染的细胞表达或呈递，例如env、gag、pol、gp120、胸苷激酶等。在本发明的一方面中，病毒特异性抗原是癌症相关的病毒抗原，例如人乳头瘤病毒(hpv)16 e4、hpv 16 e6、hpv 16 e7、hpv 18 e6、hpv 18 e7等。病毒特异性抗原可以是，例如，疱疹病毒抗原、痘病毒抗原、嗜肝dna病毒抗原、乳头瘤病毒抗原、腺病毒抗原、冠状病毒抗原、正粘病毒抗原、副粘病毒抗原、黄病毒抗原和杯状病毒抗原。例如，病毒特异性抗原可以选自呼吸道合胞病毒(rsv)抗原、流感病毒抗原、单纯疱疹病毒抗原、eb病毒(ebv)抗原、hpv抗原、水痘病毒抗原、巨细胞病毒抗原、甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、人免疫缺陷
病毒(hiv)抗原、人t淋巴细胞病毒抗原、杯状病毒抗原、腺病毒抗原和arena病毒抗原。在本发明的一方面中，癌症相关的病毒抗原是hpv抗原。
[0046]
所述方法可以包括从患者的肿瘤样品中分离t细胞。肿瘤样品可以是例如来自原发肿瘤的组织或来自转移性肿瘤部位的组织。这样，肿瘤样品可以通过任何合适的方法获得，包括但不限于抽吸，活组织检查或切除。在本发明的一方面中，患者是癌症患者。在本发明的另一方面，患者是患有病毒病症的患者。
[0047]
所述方法还可以包括选择具有基因表达谱的分离的t细胞。选择具有基因表达谱的分离的t细胞可以包括将t细胞分选成单独的单个t细胞的样品，并分别检测一个或多个单个t细胞对一种或多种基因的表达和/或非表达。在本发明的一方面中，选择具有基因表达谱的分离的t细胞包括进行单细胞转录物组分析。
[0048]
可以使用例如chromium单细胞基因表达溶液系统(10x genomics，pleasanton，ca)(“chromium系统”)检测一个或多个单t细胞对一种或多种基因的表达和/或非表达。chromium系统在逐个细胞的基础上以高通量数字基因表达对复杂细胞群进行深度剖析。chromium系统对单个细胞的cdna加条形码，用于5’转录或tcr分析。例如，样品可以从10,000个细胞的输入开始，并且产生约3000个细胞/样品的数据，平均约500个基因/细胞。
[0049]
在本发明的一方面中，选择具有基因表达谱的分离的t细胞包括通过测序(cite-seq)分析进行对转录物组和表位的细胞编索引。在例如stoeckius等人，nat.methods，14(9)：865-868(2017)描述了cite-seq。简言之，cite-seq将蛋白质标志物的基于抗体的检测与许多单细胞的转录物组并行分析组合起来。寡核苷酸标记的抗体用于将细胞蛋白和转录物组测量整合到有效的单细胞读出中。
[0050]
由于通过单细胞转录物组分析产生的数据的高维性(例如，约3000个细胞/样品和约500个基因/细胞)，可以进行维性降低以分析基因表达数据。因此，在本发明的一方面中，选择具有基因表达谱的分离的t细胞包括进行一种或多种单细胞降维方法。单细胞降维方法的一个例子是t分布随机邻居嵌入(t-sne)分析。t-sne通过在二维或三维图谱中给每个数据点一个位置来可视化高维数据。t-sne在例如van der maaten和hinton，j.machine learning res.，9：2579-2605(2008)中描述。简言之，在两个步骤中进行t-sne。在步骤1中，在指示各相邻点之间的关系的高维空间中创建概率分布。在步骤2中，重新创建尽可能地遵循该概率分布的低维空间。t-sne中的“t”来自t分布，其是在步骤2中使用的分布。“s”和“n”(“随机的”和“相邻的”)来自跨越相邻点的概率分布的使用。单细胞降维方法的另一个例子是统一流形逼近与投影(uniform manifold approximation and projection)(umap)。
[0051]
基因表达谱可包括(i)一种或多种基因的阳性表达，(ii)一种或多种基因的阴性表达，或(iii)一种或多种基因的阳性表达与一种或多种基因的阴性表达相结合。本文所用的术语“阳性”(其可缩写为“+”)，在所示基因的表达方面，是指与患者肿瘤样品中的其它t细胞相比，t细胞上调所示基因的表达。上调的表达可包括，例如，所示基因表达的定量增加，其平均对数倍数变化(以2为底)为约0.2、约0.5、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、或前述值中任两个的范围或更多。本文所用的术语“阴性”(可缩写为
“‑”
)，在所示基因的表达方面，是指与患者肿瘤样品中的其它t细胞相比，t细胞下调所示基因的表达。下调的表达可包括，例如，所示
基因表达的定量降低，其平均对数倍数变化(以2为底)为约-0.2、约-0.5、约-1、约-2、约-3、约-4、约-5、约-6、约-7、约-8、约-9、约-10、约-11、约-12、约-13、大约-14、大约-15、大约-16、大约-17、大约-18、大约-19、大约-20、大约-21、大约-22、大约-23、大约-24、大约-25、大约-26、大约-27、大约-28、大约-29、大约-30、大约-31、大约-32、大约-33、大约-34、大约-35、或前述值中任两个的范围或更多。尽管下调的表达可包括所示基因表达的缺失，但下调也包括所示基因表达的存在，尽管与患者肿瘤样品中的其它t细胞相比处于较低水平。
[0052]
在本发明的一方面中，基因表达谱包括：(i)cd4
+
和cd8
+
中的一种或两种，以及(ii)afap1il2
+
、asb2
+
、cxcl13
+
、hmox1
+
、itm2a
+
、klrb1
+
、pdlim4
+
、tigit
+
、ltb-、lyar-、rgcc-和s100a10-中的一种或多种。例如，基因表达谱可以包括：(i)cd4
+
和cd8
+
中的一种或两种，以及(ii)afap1il2
+
、asb2
+
、cxcl13
+
、hmox1
+
、itm2a
+
、klrb1
+
、pdlim4
+
、tigit
+
、ltb-、lyar-、rgcc-和s100a10-中的任意1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11种或更多种(或前述值中任意两个之间的范围)。在本发明的一方面中，基因表达谱包括(i)cd4
+
和cd8
+
中的一种或两种，以及(ii)afap1il2
+
、asb2
+
、cxcl13
+
、hmox1
+
、itm2a
+
、klrb1
+
、pdlim4
+
、tigit
+
、ltb-、lyar-、rgcc-和s100a10-的全部。
[0053]
在本发明的另一方面，基因表达谱包括：cd4
+
以及batf
+
、cd247
+
、cxcl13
+
、dnph1
+
、dusp4
+
、gypc
+
、ifitm1
+
、igflr1
+
、itm2a
+
、klrb1
+
、lims1
+
、nmb
+
、nr3c1
+
、sh2d1a
+
、spock2
+
、supt3h
+
、tigit
+
、tnfrsf18
+
、ccl5-、cd52-、gstp1-、jun-、lgals1-、ltb-、lyar-、plp2-、rgcc-、s100a10-、vim-和zfp36-中的一种或多种。基因表达谱可以包括，例如，(i)cd4
+
和cxcl13
+
；(ii)cd4
+
、cxcl13
+
，以及cd39
+
、tigit
+
和pd-1-中的一种或多种；或(iii)cd4
+
、cxcl13
+
、cd39
+
、tigit
+
和pd-1-。基因表达谱可以包括：cd4
+
以及batf
+
、cd247
+
、cxcl13
+
、dnph1
+
、dusp4
+
、gypc
+
、ifitm1
+
、igflr1
+
、itm2a
+
、klrb1
+
、lims1
+
、nmb
+
、nr3c1
+
、sh2d1a
+
、spock2
+
、supt3h
+
、tigit
+
、tnfrsf18
+
、ccl5-、cd52-、gstp1-、jun-、lgals1-、ltb-、lyar-、plp2-、rgcc-、s100a10-、vim-和zfp36-中的任意1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29种或更多种(或前述值中任意两个之间的范围)。在本发明的一方面中，基因表达谱包括cd4+以及batf
+
、cd247
+
、cxcl13
+
、dnph1
+
、dusp4
+
、gypc
+
、ifitm1
+
、igflr1
+
、itm2a
+
、klrb1
+
、lims1
+
、nmb
+
、nr3c1
+
、sh2d1a
+
、spock2
+
、supt3h
+
、tigit
+
、tnfrsf18
+
、ccl5-、cd52-、gstp1-、jun-、lgals1-、ltb-、lyar-、plp2-、rgcc-、s100a10-、vim-和zfp36-的全部。
[0054]
在本发明的另一方面，基因表达谱包括：cd8
+
以及afap1il2
+
、alox5ap
+
、arhgap9
+
、asb2
+
、card16
+
、cd3g
+
、cd8a
+
、cd8b
+
、clic3
+
、ctsw
+
、cxcl13
+
、cxcr6
+
、galnt2
+
、gzmb
+
、hla-dpa1
+
、hla-dpb1
+
、hla-drb1
+
、hla-drb5
+
、hmgn3
+
、hmox1
+
、itgae
+
、itm2a
+
、klrb1
+
、mpst
+
、nap1l4
+
、nell2
+
、nsmce1
+
、pdlim4
+
、ptms
+
、rab27a
+
、rarres3
+
、rbpj
+
、tigit
+
、anxa1-、eef1b2-、emp3-、il7r-、lgals3-、ltb-、lyar-、rgcc-、rpl36a-和s100a10中的一种或多种。基因表达谱可以包括，例如，(i)cd8
+
和cxcl13
+
；(ii)cd8
+
、tigit
+
，以及cd39
+
和pd-1
+
中的一种或两种；(iii)cd8
+
、tigit
+
、cd39
+
和pd-1
+
；(iv)cd8
+
、cxcl13
+
以及cd39
+
、tigit
+
和pd-1
+
中的一种或多种；或(v)cd8
+
、cxcl13
+
、cd39
+
、tigit
+
和pd-1+。例如，基因表达谱可以包括：cd8
+
以及afap1il2
+
、alox5ap
+
、arhgap9
+
、asb2
+
、card16
+
、cd3g
+
、cd8a
+
、cd8b
+
、clic3
+
、ctsw
+
、cxcl13
+
、cxcr6
+
、galnt2
+
、gzmb
+
、hla-dpa1
+
、hla-dpb1
+
、hla-drb1
+
、hla-drb5
+
、hmgn3
+
、hmox1
+
、itgae
+
、itm2a
+
、klrb1
+
、mpst
+
、nap1l4
+
、nell2
+
、nsmce1
+
、pdlim4
+
、ptms
+
、rab27a
+
、rarres3
+
、rbpj
+
、tigit
+
、anxa1-、eef1b2-、emp3-、il7r-、lgals3-、ltb-、lyar-、rgcc-、rpl36a-和s100a10-中的任意1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42种或更多种(或前述值中任意两个之间的范围)。在本发明的一方面中，基因表达谱包括cd8+以及afap1il2
+
、alox5ap
+
、arhgap9
+
、asb2
+
、card16
+
、cd3g
+
、cd8a
+
、cd8b
+
、clic3
+
、ctsw
+
、cxcl13
+
、cxcr6
+
、galnt2
+
、gzmb
+
、hla-dpa1
+
、hla-dpb1
+
、hla-drb1
+
、hla-drb5
+
、hmgn3
+
、hmox1
+
、itgae
+
、itm2a
+
、klrb1
+
、mpst
+
、nap1l4
+
、nell2
+
、nsmce1
+
、pdlim4
+
、ptms
+
、rab27a
+
、rarres3
+
、rbpj
+
、tigit
+
、anxa1-、eef1b2-、emp3-、il7r-、lgals3-、ltb-、lyar-、rgcc-、rpl36a-和s100a10-的全部。
[0055]
在本发明的一方面中，基因表达谱包括abi3
+
、ac243960.1
+
、acp5
+
、adgrg1
+
、ahi1
+
、asb2
+
、bst2
+
、cars
+
、ccl4
+
、cd27
+
、cd2bp2
+
、cd82
+
、ctsw
+
、cxcl13
+
、cxcr6
+
、dusp4
+
、entpd1
+
、galnt2
+
、gata3
+
、gpr25
+
、gzmb
+
、hdlbp
+
、hla-dpa1
+
，hla-drb1
+
、hmox1
+
、id2
+
、igflr1
+
、itgal
+
、lag3
+
、linc01871
+
、linc01943
+
、mis18bp1
+
、mpst
+
、ncf4
+
、nsmce1
+
、pced1b
+
、pdcd1
+
、phpt1
+
、plekhf1
+
、prf1
+
、ptms
+
、slc1a4
+
、slf1
+
、smc4
+
、supt3h
+
、tigit
+
、tnfrsf18
+
、tox
+
、traf3ip3
+
和ypel2
+
中的一种或多种。例如，基因表达谱可以包括：abi3
+
、ac243960.1
+
、acp5
+
、adgrg1
+
、ahi1
+
、asb2
+
、bst2
+
、cars
+
、ccl4
+
、cd27
+
、cd2bp2
+
、cd82
+
、ctsw
+
、cxcl13
+
、cxcr6
+
、dusp4
+
、entpd1
+
、galnt2
+
、gata3
+
、gpr25
+
、gzmb
+
、hdlbp
+
、hla-dpa1
+
、hla-drb1
+
、hmox1
+
、id2
+
、igflr1
+
、itgal
+
、lag3
+
、linc01871
+
、linc01943
+
、mis18bp1
+
、mpst
+
、ncf4
+
、nsmce1
+
、pced1b
+
、pdcd1
+
、phpt1
+
、plekhf1
+
、prf1
+
、ptms
+
、slc1a4
+
、slf1
+
、smc4
+
、supt3h
+
、tigit
+
、tnfrsf18
+
、tox
+
、traf3ip3
+
和ypel2
+
中的任意1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49种或更多种。在本发明的一方面中，基因表达谱包括abi3
+
、ac243960.1
+
、acp5
+
、adgrg1
+
、ahi1
+
、asb2
+
、bst2
+
、cars
+
、ccl4
+
、cd27
+
、cd2bp2
+
、cd82
+
、ctsw
+
、cxcl13
+
、cxcr6
+
、dusp4
+
、entpd1
+
、galnt2
+
、gata3
+
、gpr25
+
、gzmb
+
、hdlbp
+
、hla-dpa1
+
、hla-drb1
+
、hmox1
+
、id2
+
、igflr1
+
、itgal
+
、lag3
+
、linc01871
+
、linc01943
+
、mis18bp1
+
、mpst
+
、ncf4
+
、nsmce1
+
、pced1b
+
、pdcd1
+
、phpt1
+
、plekhf1
+
、prf1
+
、ptms
+
、slc1a4
+
、slf1
+
、smc4
+
、supt3h
+
、tigit
+
、tnfrsf18
+
、tox
+
、traf3ip3
+
和ypel2
+
的全部。在本发明的一方面中，基因表达谱还包括lag3
+
。
[0056]
在本发明的一方面中，基因表达谱包括cd4
+
以及adi1
+
、ahi1
+
、arid5b
+
、batf
+
、cmtm7
+
、cpm
+
、cxcl13
+
、cyth1
+
、elmo1
+
、etv7
+
、fabp5
+
、fbln7
+
、fkbp5
+
、gramd1a
+
、hif1a
+
、il6st
+
、itga4
+
、itk
+
、jak3
+
、klrb1
+
、lef1
+
、lims1
+
、maf
+
、mal
+
、mir4435-2hg
+
、myl6b
+
、nap1l4
+
、nmb
+
、nr3c1
+
、pask
+
、pgm2l1
+
、pim2
+
、ppp1cc
+
、sesn3
+
、sh2d1a
+
、socs1
+
、stat1
+
、syne2
+
、tbc1d4
+
、tigit
+
、tlk1
+
、tmem123
+
、tmem70
+
、tnik
+
、tox
+
、tshz2
+
、ucp2
+
、vopp1
+
和ypel2
+
中的一种或多种。例如，基因表达谱可以包括：adi1
+
、ahi1
+
、arid5b
+
、batf
+
、cmtm7
+
、cpm
+
、cxcl13
+
、cyth1
+
、elmo1
+
、etv7
+
、fabp5
+
、fbln7
+
、fkbp5
+
、gramd1a
+
、hif1a
+
、il6st
+
、itga4
+
、itk
+
、jak3
+
、klrb1
+
、lef1
+
、lims1
+
、maf
+
、mal
+
、mir4435-2hg
+
、myl6b
+
、nap1l4
+
、nmb
+
、nr3c1
+
、pask
+
、pgm2l1
+
、pim2
+
、ppp1cc
+
、sesn3
+
、sh2d1a
+
、socs1
+
、stat1
+
、syne2
+
、tbc1d4
+
、tigit
+
、tlk1
+
、tmem123
+
、tmem70
+
、tnik
+
、tox
+
、tshz2
+
、ucp2
+
、vopp1
+
和ypel2
+
中的任意1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48种或更多种。在本发明的一方面中，基因表
达谱包括cd4+以及adi1
+
、ahi1
+
、arid5b
+
、batf
+
、cmtm7
+
、cpm
+
、cxcl13
+
、cyth1
+
、elmo1
+
、etv7
+
、fabp5
+
、fbln7
+
、fkbp5
+
、gramd1a
+
、hif1a
+
、il6st
+
、itga4
+
、itk
+
、jak3
+
、klrb1
+
、lef1
+
、lims1
+
、maf
+
、mal
+
、mir4435-2hg
+
、myl6b
+
、nap1l4
+
、nmb
+
、nr3c1
+
、pask
+
、pgm2l1
+
、pim2
+
、ppp1cc
+
、sesn3
+
、sh2d1a
+
、socs1
+
、stat1
+
、syne2
+
、tbc1d4
+
、tigit
+
、tlk1
+
、tmem123
+
、tmem70
+
、tnik
+
、tox
+
、tshz2
+
、ucp2
+
、vopp1
+
和ypel2
+
的全部。
[0057]
在本发明的一方面中，基因表达谱包括cd8
+
以及ac243829.4
+
、acp5
+
、apobec3c
+
、apobec3g
+
、ccl3
+
、ccl4
+
、ccl4l2
+
、ccl5
+
、cd27
+
、cd8a
+
、cd8b
+
、cst7
+
、ctsw
+
、cxcl13
+
、dusp4
+
、entpd1
+
、fabp5
+
、galnt2
+
、gnly
+
、gzma
+
、gzmb
+
、gzmh
+
、gzmk
+
、havcr2
+
、hcst
+
、hla-dm[a
+
、hla-dpa1
+
、hla-dpb1
+
、hla-dra
+
、hla-drb1
+
、hla-drb5
+
、hmox1
+
、ifng
+
、igflr1
+
、itgal
+
、jaml
+
、linc01871
+
、lyst
+
、mir155hg
+
、nkg7
+
、plekhf1
+
、prf1
+
、ptms
+
、rgs1
+
、slf1
+
、smc4
+
、supt3h
+
、tigit
+
和tox
+
中的一种或多种。例如，基因表达谱可以包括：ac243829.4
+
、acp5
+
、apobec3c
+
、apobec3g
+
、ccl3
+
、ccl4
+
、ccl4l2
+
、ccl5
+
、cd27
+
、cd8a
+
、cd8b
+
、cst7
+
、ctsw
+
、cxcl13
+
、dusp4
+
、entpd1
+
、fabp5
+
、galnt2
+
、gnly
+
、gzma
+
、gzmb
+
、gzmh
+
、gzmk
+
、havcr2
+
、hcst
+
、hla-dma
+
、hla-dpa1
+
、hla-dpb1
+
、hla-dra
+
、hla-drb1
+
、hla-drb5
+
、hmox1
+
、ifng
+
、igflr1
+
、itgal
+
、jaml
+
、linc01871
+
、lyst
+
、mir155hg
+
、nkg7
+
、plekhf1
+
、prf1
+
、ptms
+
、rgs1
+
、slf1
+
、smc4
+
、supt3h
+
、tigit
+
和tox
+
中的任意1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48种或更多种。在本发明的一方面中，基因表达谱包括cd8
+
以及ac243829.4
+
、acp5
+
、apobec3c
+
、apobec3g
+
、ccl3
+
、ccl4
+
、ccl4l2
+
、ccl5
+
、cd27
+
、cd8a
+
、cd8b
+
、cst7
+
、ctsw
+
、cxcl13
+
、dusp4
+
、entpd1
+
、fabp5
+
、galnt2
+
、gnly
+
、gzma
+
、gzmb
+
、gzmh
+
、gzmk
+
、havcr2
+
、hcst
+
、hla-dma
+
、hla-dpa1
+
、hla-dpb1
+
、hla-dra
+
、hla-drb1
+
、hla-drb5
+
、hmox1
+
、ifng
+
、igflr1
+
、itgal
+
、jaml
+
、linc01871
+
、lyst
+
、mir155hg
+
、nkg7
+
、plekhf1
+
、prf1
+
、ptms
+
、rgs1
+
、slf1
+
、smc4
+
、supt3h
+
、tigit
+
和tox
+
的全部。在本发明的一方面中，基因表达谱还包括lag3
+
。
[0058]
在本发明的一方面中，基因表达谱包括ahi1
+
、cxcl13
+
、fabp5
+
、nap1l4
+
、ormdl3
+
、ppp1r16b
+
、sh2d1a
+
、tigit
+
和tox
+
中的一种或多种。例如，基因表达谱可以包括：ahi1
+
、cxcl13
+
、fabp5
+
、nap1l4
+
、ormdl3
+
、ppp1r16b
+
、sh2d1a
+
、tigit
+
和tox
+
中的任意1、2、3、4、5、6、7、8种或更多种。在本发明的一方面中，基因表达谱包括ahi1
+
、cxcl13
+
、fabp5
+
、nap1l4
+
、ormdl3
+
、ppp1r16b
+
、sh2d1a
+
、tigit
+
和tox
+
的全部。
[0059]
在本发明的一方面中，基因表达谱包括tigit
+
、cd39
+
和pd-1
+
中的一种或多种。例如，基因表达谱可以包括：tigit
+
、cd39
+
和pd-1
+
中的任意1、2种或更多种。在本发明的一方面中，基因表达谱包括tigit
+
、cd39
+
和pd-1
+
的全部。
[0060]
在本发明的另一方面，基因表达谱包括：cd8
+
以及cd39
+
、cd74
+
、cd103
+
、cd106
+
、cd137
+
、hla-dr
+
、tigit
+
、ccr7-、cd8a-、cd16-、cd45ra-、cd62l-和il7r-中的一种或多种。在本发明的一方面中，基因表达谱还包括pd-1
+
和tim-3
+
中的一种或两种。例如，基因表达谱可以包括：cd8
+
以及cd39
+
、cd74
+
、cd103
+
、cd106
+
、cd137
+
、hla-dr
+
、tigit
+
、ccr7-、cd8a-、cd16-、cd45ra-、cd62l-和il7r-中的任意1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或更多种(或前述值中任意两个之间的范围)。在本发明的一方面中，基因表达谱包括：cd8
+
以及cd39
+
、cd74
+
、cd103
+
、cd106
+
、cd137
+
、hla-dr
+
、tigit
+
、ccr7-、cd8a-、cd16-、cd45ra-、cd62l-和il7r-的全部。在本发明的一方面中，基因表达谱包括以下的一种或多种(与肿瘤中的其它cd8
+ t细胞相比)：
cd8a低，cd45ra阴性，cd62l阴性至非常低，ccr7阴性至非常低，cd16阴性至非常低，和il7r阴性至非常低。在本发明的一方面中，基因表达谱包括：cd8
+
以及细胞表面蛋白cd39
+
、cd74
+
、cd103
+
、cd106
+
、cd137
+
、hla-dr
+
、tigit
+
、ccr7
lo
、cd8a
lo
、cd16
lo
、cd45ra
lo
、cd62l
lo
和il7r
lo
中的一种或多种。如本文所用的术语“低”(其可缩写为“lo”)，在所示基因的表达方面，是指使用免疫组织化学方法(例如，facs、流式细胞术、免疫荧光测定和显微镜检术)，比对于所示基因的表达呈阳性的其它细胞对所示表达的基因的染色较不明亮的细胞子集。例如，具有所示基因的“低”表达水平的细胞可以比对于所示基因的表达呈阳性的其它细胞约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，或约95％，或前述值中任意两个的范围更不明亮地染色。
[0061]
在本发明的一方面中，基因表达谱包括tigit
+
。在本发明的另一方面，基因表达谱包括cxcl13
+
。
[0062]
选择具有基因表达谱的分离的t细胞可以包括检测本文所述的基因表达谱中基因表达产物的存在或缺失，或测量本文所述的基因表达谱中基因表达产物的量。在这方面，选择具有基因表达谱的分离的t细胞可以包括检测由基因表达谱的阳性表达的基因编码的蛋白质的存在。或者或另外，选择具有基因表达谱的分离的t细胞可以包括检测基因表达谱中阴性表达的基因编码的蛋白质的缺失。或者或另外，选择具有基因表达谱的分离的t细胞可以包括测量基因表达谱中阴性表达的基因编码的蛋白质的量。或者或另外，选择具有基因表达谱的分离的t细胞可以包括测量基因表达谱中阳性表达的基因编码的蛋白质的量。或者或另外，选择具有基因表达谱的分离的t细胞可以包括检测由基因表达谱的阳性表达的基因编码的rna的存在。或者或另外，选择具有基因表达谱的分离的t细胞可以包括检测基因表达谱中阴性表达的基因编码的rna的缺失。或者或另外，选择具有基因表达谱的分离的t细胞可以包括测量由基因表达谱的阳性表达的基因编码的rna的量。或者或另外，选择具有基因表达谱的分离的t细胞可以包括测量由基因表达谱的阴性表达的基因编码的rna的量。在本发明的一方面中，选择具有基因表达谱的分离的t细胞包括检测基因表达谱中一种或多种基因的细胞表面表达的存在和/或缺失。在本发明的一方面中，选择具有基因表达谱的分离的t细胞包括测量基因表达谱中一种或多种基因的细胞表面表达的量。细胞表面表达可以通过任何合适的方法检测或测量，例如流式细胞术(例如荧光激活细胞分选(facs))。
[0063]
在本发明的一方面中，制备对靶抗原具有抗原特异性的富集的t细胞群的方法不包括扩增t细胞的数目。t细胞数目的扩增可通过本领域已知的许多方法中的任一种来实现，如例如美国专利8,034,334；美国专利8,383,099；美国专利申请公开号2012/0244133；dudley等人，j.immunother.，26：332-42(2003)；和riddell等人，j.immunol.methods，128：189-201(1990)中所描述的。例如，通过将t细胞与okt3抗体、il-2和饲养pbmc(例如，辐射过的同种异体pbmc)一起培养来进行t细胞数目的扩增。对靶抗原具有所需特异性的罕见的和/或易碎的t细胞在扩增t细胞数目的过程中可能丢失。本发明的方法在不扩增t细胞的数目的情况下可有利地通过实施本发明的方法制备对靶抗原具有抗原特异性的富集的t细胞群，包括这种罕见的和/或易碎的t细胞。
[0064]
所述方法还可以包括将选择的t细胞与未选择的细胞分离，其中分离的选择的t细胞提供了对靶抗原具有抗原特异性的富集的t细胞群。在这一点上，选择的细胞可以与未选择的细胞，即不具有基因表达谱的细胞物理分离。选择的细胞可以通过任何合适的方法例
如分选从未选择的细胞中分离出来。
[0065]
本发明的另一方面提供了分离对靶抗原具有抗原特异性的t细胞受体(tcr)或其抗原结合部分的方法。
[0066]
本文所用的tcr的“抗原结合部分”是指包含tcr的连续氨基酸的任何部分(所述tcr的连续氨基酸是所述tcr的一部分)，条件是所述抗原结合部分特异性结合本文结合本发明其它方面所述的靶抗原。术语“抗原结合部分”是指本发明tcr的任何部分或片段，该部分或片段保留其作为其一部分的tcr(亲本tcr)的生物活性。抗原结合部分包括，例如，tcr中保留特异性结合靶抗原的能力，或与亲本tcr相比，以相似的程度，相同的程度，或更高的程度检测，治疗或预防病症的那些部分。相对于亲本tcr，功能部分可包含例如约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多的亲本tcr。
[0067]
抗原结合部分可以包含本发明tcr的α链和β链之一或两者的抗原结合部分，例如包含本发明tcr的α链和/或β链的可变区的互补决定区(cdr)1、cdr2和cdr3中的一个或多个的部分。在本发明的一方面中，抗原结合部分可以包含α链的cdr1的氨基酸序列(cdr1α)、α链的cdr2的氨基酸序列(cdr2α)、α链的cdr3的氨基酸序列(cdr3α)、β链的cdr1的氨基酸序列(cdr1β)、β链的cdr2的氨基酸序列(cdr2β)、β链的cdr3的氨基酸序列(cdr3β)或其任何组合。优选地，抗原结合部分包含本发明tcr的cdr1α、cdr2α和cdr3α的氨基酸序列；cdr1β、cdr2β和cdr3β的氨基酸序列；或cdr1α、cdr2α、cdr3α、cdr1β、cdr2β及cdr3β的全部的氨基酸序列。
[0068]
在本发明的一方面中，抗原结合部分可以包含，例如，本发明tcr的可变区，其包含上述cdr区的组合。在这方面，抗原结合部分可以包含本发明tcr的α链可变区(vα)的氨基酸序列，β链可变区(vβ)的氨基酸序列，或vα和vβ两者的氨基酸序列。
[0069]
在本发明的一方面中，抗原结合部分可以包含可变区和恒定区的组合。在这点上，抗原结合部分可包含本发明tcr的α链或β链的全长，或α链和β链两者。
[0070]
所述方法可包括根据本文结合本发明的其它方面描述的任何本发明方法制备对靶抗原具有抗原特异性的富集的t细胞群。
[0071]
所述方法可包括将富集的群体中的t细胞分选成单独的单个t细胞的样品，并对一个或多个单独的单个t细胞的样品中的tcrα链cdr3和β链cdr3进行测序。在本发明的一方面中，tcrα链cdr3和β链cdr3的测序可以使用用于分析本文结合本发明的其它方面描述的基因表达谱的单细胞转录物组分析来进行。在例如us 2020/0056237和wo 2017/048614中描述了用于对tcrα链cdr3和β链cdr3进行测序的其它技术。
[0072]
所述方法还可以包括将由单独的单个t细胞的样品的核酸编码的包含cdr3的α链可变区与包含cdr3的β链可变区配对。在这点上，所述方法可以包括重新构建tcr，使得包含cdr3的α链可变区与包含cdr3的β链可变区的配对产生功能性tcr。在本发明的一方面中，tcr被电脑模拟重建。在例如us 2020/0056237和wo 2017/048614中描述了用电脑模拟重建tcr并将包含cdr3的α链可变区与包含cdr3的β链可变区配对的方法。
[0073]
所述方法可以包括从选择的t细胞中分离编码tcr或其抗原结合部分的核苷酸序列，其中所述tcr或其抗原结合部分对靶抗原具有抗原特异性。
[0074]
所述方法可包括将编码配对的α链可变区和β链可变区的核苷酸序列导入宿主细胞，并由所述宿主细胞表达配对的α链可变区和β链可变区。将编码分离的tcr或其抗原结合
部分的核苷酸序列(例如重组表达载体)导入宿主细胞可以以本领域已知的各种不同方式中的任一种进行，如例如green等人，molecular cloning：a laboratory manual，cold spring harbor laboratory press；第4版(2012)中所描述的。用于将核苷酸序列导入宿主细胞的技术的非限制性实例包括转化、转导、转染和电穿孔。
[0075]
在本发明的一方面中，所述方法可以包括使用已建立的分子克隆技术将编码tcr或其抗原结合部分的核苷酸序列克隆到重组表达载体中，如例如green等人(同上)所描述的。重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括为增殖和扩增或表达或两者而设计的那些载体，如质粒和病毒。载体可以选自转座子/转座酶、puc系列(fermentas life sciences)、pbluescript系列(stratagene，lajolla，ca)、pet系列(novagen，madison，wi)、pgex系列(pharmacia biotech，uppsala，sweden)以及pex系列(clontech，palo alto，ca)。也可以使用噬菌体载体，例如λgt10、λgt11、λzapli(straagene)、λembl4和λnm1149。植物表达载体的实例包括pbi01、pbi101.2、pbi101.3、pbi121和pbin19(clontech)。动物表达载体的实例包括peuk-c1、pmam和pmamneo(clontech)。优选地，重组表达载体是病毒载体，例如逆转录病毒载体。在其它方面，重组表达载体是慢病毒载体或转座子。
[0076]
宿主细胞可以是真核细胞，例如植物，动物，真菌或藻类，或者可以是原核细胞，例如细菌或原生动物。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即直接从生物体，例如人中分离的。宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞，即悬浮生长的细胞。合适的宿主细胞是本领域已知的，并且包括例如dh5α大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴vero细胞、cos细胞、hek293细胞等。为了扩增或复制编码tcr或其抗原结合部分的核苷酸序列的目的，宿主细胞优选为原核细胞，例如dh5α细胞。为了产生重组tcr的目的，宿主细胞优选为哺乳动物细胞。最优选地，宿主细胞是人细胞。尽管宿主细胞可以是任何细胞类型，可以源自任何类型的组织，并且可以是任何发育阶段，但是宿主细胞优选是外周血淋巴细胞(pbl)或外周血单核细胞(pbmc)。更优选地，宿主细胞是t细胞。
[0077]
出于本文的目的，t细胞可以是任何t细胞，例如培养的t细胞，例如原代t细胞，或来自培养的t细胞系例如jurkat、supt1等的t细胞，或从哺乳动物获得的t细胞。如果从哺乳动物获得，t细胞可以从多种来源获得，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或液体。t细胞也可以富集或纯化。优选地，t细胞是人t细胞。t细胞可以是任何类型的t细胞并且可以是任何发育阶段的，包括但不限于cd4
+
/cd8
+
双阳性t细胞、cd4
+
辅助t细胞，例如th1和th2细胞、cd4
+ t细胞、cd8
+ t细胞(例如细胞毒性t细胞)、肿瘤浸润性淋巴细胞(til)、记忆t细胞(例如中央记忆t细胞和效应记忆t细胞)、天然t细胞等。
[0078]
所述方法可包括筛选表达对靶抗原具有抗原特异性的配对的α链可变区和β链可变区的宿主细胞，并选择对靶抗原具有抗原特异性的配对的α链可变区和β链可变区，其中分离对靶抗原具有抗原特异性的tcr或其抗原结合部分。对抗原特异性的宿主细胞的筛选和选择具有抗原特异性的配对的α链可变区和β链可变区可以使用已知的技术进行，如例如在us2017/0218042和us2017/0224800中描述的技术。本发明的其它方面可以提供一种获得靶抗原特异性tcr的方法，其通过例如单细胞rna测序和随后应用基因表达谱来电脑模拟重建tcr。因此，本发明的一方面提供了分离对靶抗原具有抗原特异性的tcr或其抗原结合部分的方法，所述方法包括：从患者的肿瘤样品中分离t细胞；将富集的群体中的t细胞分选为
单独的单个t细胞的样品；对单独的单个t细胞的样品中的tcr cdr3进行测序；选择具有基因表达谱的单独的单个t细胞的样品；将由具有基因表达谱的单独的单个t细胞的样品的核酸编码的包含cdr3的α链可变区与包含cdr3的β链可变区配对；将编码配对的α链可变区和β链可变区的核苷酸序列导入宿主细胞，并通过宿主细胞表达配对的α链可变区和β链可变区；筛选表达对靶抗原具有抗原特异性的配对的α链可变区和β链可变区的宿主细胞；以及选择对靶抗原具有抗原特异性的配对的α链可变区和β链可变区，其中分离对靶抗原具有抗原特异性的tcr或其抗原结合部分。t细胞的分离，t细胞的分选，tcr cdr3的测序，单独的单个t细胞的样品的选择，α和β链可变区的配对，将核苷酸序列导入宿主细胞，宿主细胞的筛选，配对的α和β链可变区的选择，以及基因表达谱可以是本文结合本发明的其它方面描述的任何基因表达谱。
[0079]
通过本发明方法分离的tcr或其抗原结合部分可用于制备用于过继细胞治疗的细胞。在这方面，本发明的一方面提供了制备表达tcr或其抗原结合部分的细胞群的方法，所述tcr或其抗原结合部分对靶抗原具有抗原特异性，所述方法包括如本文结合本发明的其它方面所述分离tcr或其抗原结合部分，并将编码分离的tcr或其抗原结合部分的核苷酸序列导入pbmc，以获得表达tcr或其抗原结合部分的细胞。
[0080]
将编码分离的tcr或其抗原结合部分的核苷酸序列(例如重组表达载体)导入pbmc可以以本领域已知的各种不同方式中的任一种进行，如例如green等人(同上)中所描述的。用于将核苷酸序列导入pbmc的技术的非限制性实例包括转化、转导、转染和电穿孔。
[0081]
在本发明的一方面中，所述方法包括将编码分离的tcr或其抗原结合部分的核苷酸序列导入患者自体的pbmc中。在这点上，通过本发明方法鉴定和分离的tcr或其抗原结合部分可以是每位患者个性化的。然而，在另一方面，本发明的方法可以鉴定和分离对由复发(也称为“热点”)癌症特异性突变编码的突变氨基酸序列具有抗原特异性的tcr或其抗原结合部分。在这点上，所述方法可以包括将编码分离的tcr或其抗原结合部分的核苷酸序列导入患者同种异体的pbmc中。例如，所述方法可以包括将编码分离的tcr或其抗原结合部分的核苷酸序列导入另一位患者的pbmc，该患者的肿瘤在相同mhc分子的背景下表达相同的突变。
[0082]
在本发明的一方面中，pbmc包括t细胞。t细胞可以是任何类型的t细胞，例如，本文结合本发明的其它方面描述的那些中的任一种。不受特定理论或机制的束缚，据信较低分化的“较年轻的”t细胞可能与相比较高分化的“较老的”t细胞相比的更大的体内持久性，增殖和抗肿瘤活性中的任何一种或多种相关。因此，本发明的方法可有利地鉴定和分离对靶抗原具有抗原特异性的tcr或其抗原结合部分，并将tcr或其抗原结合部分导入“较年轻的”t细胞中，与从中可以分离tcr或其抗原结合部分的“较老的”t细胞(例如，患者肿瘤中的效应细胞)相比，所述“较年轻的”t细胞可提供更大的体内持久性，增殖和抗肿瘤活性中的任何一种或多种。
[0083]
本发明的方法可有利地收集被鉴定为具有本文所述的基因表达谱的一种以上或所有的tcr(例如通过单细胞转录组学)，汇集所有这些tcr并将其组合为临床t细胞治疗产品。在这点上，本发明的另一方面提供了一种制备表达对靶抗原具有抗原特异性的tcr或其抗原结合部分的细胞群的方法。所述方法可包括(a)根据本文所述的任何本发明的方法制备对靶抗原具有抗原特异性的富集的t细胞群；(b)将富集的群体中的t细胞分选成单独的
单个t细胞的样品；(c)对单独的单个t细胞的样品中的tcr互补决定区3(cdr3)进行测序；(d)将由单独的单个t细胞的样品的核酸编码的包含cdr3的α链可变区与包含cdr3的β链可变区配对；(e)将编码所述配对的α链可变区和β链可变区的核苷酸序列导入外周血单核细胞(pbmc)中，并由所述pbmc表达所述配对的α链可变区和β链可变区；以及针对根据本文所述的任何本发明的方法制备的对靶抗原具有抗原特异性的富集的t细胞群的多个单独的单个t细胞的样品，进行核苷酸序列的测序，配对和导入，从而提供表达对靶抗原具有抗原特异性的tcr或其抗原结合部分的汇集的细胞群。核苷酸序列的分选、测序、配对和导入可以如本文结合本发明的其它方面所述进行。
[0084]
在本发明的一方面中，制备表达tcr或其抗原结合部分的细胞群的方法还包括扩增表达tcr或其抗原结合部分的pbmc的数目。可以如本文结合本发明的其它方面所述，进行pbmc数目的扩增。在本发明的一方面中，制备表达tcr或其抗原结合部分的细胞群的方法包括扩增表达tcr或其抗原结合部分的pbmc的数目，而制备对靶抗原具有抗原特异性的富集的t细胞群的方法不包括扩增t细胞的数目。
[0085]
本发明的另一方面提供了tcr或其抗原结合部分，其通过本文结合本发明的其它方面所述的任何方法分离。本发明的一方面提供了包含两条多肽(即多肽链)，例如tcr的α链、tcr的β链、tcr的γ链、tcr的δ链或其组合的tcr。本发明的另一方面提供了如本文结合本发明的其它方面所述的tcr的抗原结合部分，其包含一个或多个cdr区，一个或多个可变区，或tcr的α链和β链中的一条或两条。本发明的tcr或其抗原结合部分的多肽可包含任何氨基酸序列，条件是tcr或其抗原结合部分对靶抗原具有抗原特异性。
[0086]
本发明的另一方面提供了根据本文结合本发明的其它方面描述的任何方法制备的分离的细胞群。细胞群可以是异质群体，其包含表达分离的tcr或其抗原结合部分的pbmc以及至少一种不表达分离的tcr或其抗原结合部分的其它细胞，例如宿主细胞(例如pbmc)，或t细胞以外的细胞，例如b细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、脑细胞等。或者，细胞群可以是基本上均质的群体，其中所述群体主要包含表达分离的tcr或其抗原结合部分的pbmc(例如，基本上由其组成)。所述群体也可以是细胞的克隆群，其中该群体的所有细胞是表达分离的tcr或其抗原结合部分的单个pbmc的克隆，使得该群体的所有细胞均表达分离的tcr或其抗原结合部分。在本发明的一方面中，细胞群是包含表达分离的tcr或其抗原结合部分的pbmc的克隆群，如本文所述。通过将编码分离的tcr或其抗原结合部分的核苷酸序列导入pbmc，本发明的方法可有利地提供包含高比例pbmc细胞的细胞群，所述pbmc细胞表达分离的tcr并对靶抗原具有抗原特异性。在本发明的一方面中，所述细胞群的约1％至约100％，例如约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％、或由前述值中的任意两个限定的范围，包括表达分离的tcr并对靶抗原具有抗原特异性的pbmc细胞。不受特定理论或机制的束缚，据信包含高比例的表达分离的tcr并对靶抗原具有抗原特异性的pbmc细胞的细胞群具有较低比例的不相关细胞，所述不相关细胞可阻碍pbmc的功能，例如pbmc靶向靶细胞的破坏和/或治疗或预防病症的能力。靶细胞可以包括，例如，癌细胞或病毒感染的细胞。
[0087]
本发明的tcr或其抗原结合部分以及细胞群可以被配制成组合物，如药物组合物。
在这方面，本发明提供了包含本发明的tcr或其抗原结合部分或细胞群中的任一种以及药学上可接受的载体的药物组合物。本发明的药物组合物可以包含与另外的药学活性剂或药物(如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安(busulfan)、卡铂、顺铂、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等)组合的本发明的tcr或其抗原结合部分或细胞群。
[0088]
优选地，所述载体是药学上可接受的载体。对于药物组合物，载体可以是所考虑的那些常规用于特定的本发明的tcr或其抗原结合部分或细胞群的任一种载体。这类药学上可接受的载体是本领域技术人员公知的，且很容易提供给公众。优选地，所述药学上可接受的载体是在使用条件下无有害副作用或毒性的载体。
[0089]
部分地将由特定的本发明的tcr或其抗原结合部分或细胞群以及用于施用本发明的tcr或其抗原结合部分或细胞群的具体方法来确定载体的选择。因此，存在多种本发明药物组合物的合适的制剂。合适的制剂可以包括那些用于瘤内、口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌内、动脉内、鞘内或腹膜内施用的制剂中任一种。多于一种的途径可用于施用本发明的tcr或细胞群，并且在某些情况下，特定途径可提供比另一种途径更直接和更有效的反应。
[0090]
优选地，本发明的tcr或其抗原结合部分或细胞群通过注射施用，例如，静脉内施用。当要施用本发明的细胞群时，用于注射的所述细胞的药学上可接受的载体，可以包括任何等渗载体，例如，生理盐水(约0.90％w/v的nacl水溶液，约300mosm/l的nacl水溶液，或每升水约9.0g的nacl)、normosol r电解液(abbott，chicago，il)、plasma-lyte a(baxter，deerfield，il)、约5％右旋糖水溶液或乳酸林格氏液。在一方面，药学上可接受的载体中补充有人血清白蛋白。
[0091]
预期本发明的tcr、其抗原结合部分、细胞群和药物组合物可用于治疗或预防病症的方法中。不受特定理论或机制的束缚，本发明的tcr或其抗原结合部分被认为特异性结合靶抗原，使得tcr或其抗原结合部分在由细胞表达时能够介导针对表达靶抗原的靶细胞的免疫应答。在这方面，本发明提供了治疗或预防哺乳动物中病症的方法，其包括(i)根据本文结合本发明的其它方面描述的任何方法制备对靶抗原具有抗原特异性的富集的t细胞群；以及将所述细胞群以有效治疗或预防所述哺乳动物中的病症的量施用至所述哺乳动物。
[0092]
如本文所用，术语“治疗”和“预防”以及由此衍生的词语，并不一定意味着100％或完全的治疗或预防。相反，存在被本领域普通技术人员识别为具有潜在益处或治疗效果的不同程度的治疗或预防。在这方面，本发明的方法可以提供对哺乳动物中病症的任何水平的任何量的治疗或预防。此外，本发明的方法提供的治疗或预防可包括对被治疗或预防的病症的一种或多种迹象或症状的治疗或预防。例如，治疗或预防可以包括促进肿瘤的消退。此外，出于本文的目的，“预防”可以包括延迟病症或其症状、迹象或复发。
[0093]
出于本发明的目的，所施用的本发明的tcr、其抗原结合部分、细胞群或药物组合物的数量或剂量(例如，当施用本发明的细胞群时的细胞数量)应足以在合理的时间框架内在哺乳动物中起作用(例如，治疗或预防性应答)。例如，本发明的tcr、其抗原结合部分、细胞群或药物组合物的剂量应足以结合到靶抗原，或从施用时间起在约2小时或更长时间(例如，12至24小时或更长时间)的期间检测、治疗或预防病症。在某些方面，时间段可以是甚至
更长。通过所施用的特定的本发明的tcr、其抗原结合部分、细胞群或药物组合物的功效和哺乳动物(例如人)的病症，以及待治疗的哺乳动物(例如人)的体重来确定剂量。
[0094]
用于确定施用剂量的许多测定方法在本领域是已知的。出于本发明的目的，一种测定方法，其包括当向哺乳动物组(其各自给予不同剂量的t细胞)中的哺乳动物施用给定剂量的此类t细胞时，比较靶细胞被溶解或表达本发明的tcr或其抗原结合部分的t细胞分泌的ifn-γ的程度，这种测定方法可用于确定向哺乳动物施用的起始剂量。当施用一定剂量时，靶细胞被溶解或t细胞分泌的ifn-γ的程度可通过本领域已知的方法来测定。
[0095]
也可以通过可能伴随特定的本发明的tcr、其抗原结合部分、细胞群或药物组合物施用的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定本发明的tcr、其抗原结合部分、细胞群或药物组合物的剂量。通常，主治医师将考虑各种因素如年龄、体重、健康状况、饮食、性别、待施用的本发明的tcr、其抗原结合部分、细胞群或药物组合物、施用途径以及受治疗的病症的严重程度来决定用于治疗各个个体患者的本发明的tcr、其抗原结合部分、细胞群或药物组合物的剂量。
[0096]
在一方面中，其中待施用的本发明细胞群、每次输注所施用的细胞数量可以变化，例如100万至1000亿个细胞；然而，低于或高于该示例性范围的量都在本发明的范围之内。例如，本发明的宿主细胞的每日剂量可以是约100万至约1500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞、约600亿个细胞、约800亿个细胞、约1000亿个细胞、约1200亿个细胞、约1300亿个细胞、约1500亿个细胞或由前述值中任意两个所限定的范围)，优选约1000万至约1300亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞、约1000亿个细胞、约1100亿个细胞、约1200亿个细胞、约1300亿个细胞或由前述值中任意两个所限定的范围)，更优选约1亿个细胞至约1300亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞、约1000亿个细胞、约1100亿个细胞、约1200亿个细胞，约1300亿个细胞或由前述值中任意两个所限定的范围)。
[0097]
出于本发明方法的目的，其中细胞群施用时，所述细胞对于哺乳动物可以是同种异体的细胞或是自体的细胞。优选地，所述细胞对于哺乳动物是自体的细胞。
[0098]
本发明的另一方面提供了制备用于治疗或预防哺乳动物中的病症的药物的方法，所述方法包括(i)根据本文结合本发明的其它方面描述的任何方法制备对靶抗原具有抗原特异性的富集的t细胞群；或(ii)根据本文结合本发明的其它方面描述的任何方法制备表达tcr或其抗原结合部分的分离的细胞群。
[0099]
在本发明的一方面中，所述病症是癌症。癌症可以有利地是任何癌症，包括以下任一种：急性淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳腺癌，肛门、肛管或肛门直肠的癌症，眼癌、肝内胆管癌、关节癌，颈部、胆囊或胸膜的癌症，鼻、鼻腔或中耳的癌症，口腔癌、阴道癌、外阴癌、胆管癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞癌、结肠癌、食道癌、子宫颈癌、胃肠道良性肿瘤、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、恶性间皮瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、
口咽癌、卵巢癌、阴茎癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、输尿管癌、膀胱癌、实体瘤和液体肿瘤。优选地，所述癌症是上皮癌。在一方面中，所述癌症是胆管癌、黑素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌或直肠癌。
[0100]
在本发明的一方面中，所述病症是病毒病症。出于本文的目的，“病毒病症”意指可从人传播至人或从生物体传播至生物体且由病毒引起的病症。在本发明的一方面中，所述病毒病症由选自下组的病毒引起：疱疹病毒、痘病毒、嗜肝dna病毒、乳头瘤病毒、腺病毒、冠状病毒、正粘病毒、副粘病毒、黄病毒和杯状病毒。例如，所述病毒病症可由选自以下的病毒引起：呼吸道合胞病毒(rsv)、流感病毒、单纯疱疹病毒、eb病毒、hpv、水痘病毒、巨细胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(hiv)、人t淋巴细胞病毒、杯状病毒、腺病毒和arena病毒。在本发明的一方面中，所述病毒病症可以是由本文所述的任何病毒引起的慢性病毒感染。所述病毒病症可以是，例如，流行性感冒、肺炎、疱疹、肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、慢性乏力综合征、突然急性呼吸综合征(sars)、肠胃炎、肠炎、心炎、脑炎、细支气管炎、呼吸乳头瘤病、脑膜炎、hiv/aids，hpv感染和单核细胞增多症。在本发明的一个实施方案中，所述病毒病症是由癌症相关病毒引起的病毒感染。
[0101]
在本发明方法中提到的哺乳动物可以是任何哺乳动物。如本文所用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于：啮齿目哺乳动物如小鼠和仓鼠，以及兔形目的哺乳动物如兔。优选的哺乳动物来自食肉目，包括猫科(猫)和犬科(狗)。优选地，哺乳动物来自偶蹄目，包括牛科(牛)和猪科(猪)，或者奇蹄目，包括马科(马)。优选地，所述哺乳动物是灵长目、猿目(ceboids)或猴目(simoids)(猴)、或类人猿目(人和类人猿)。更优选的哺乳动物是人类。在特别优选的方面中，所述哺乳动物是表达靶原的患者。
[0102]
下面的实施例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。
实施例
[0103]
在实施例1-12中描述的实验中采用以下材料和方法。实验设置/样品制备
[0104]
用于10x基因组5’单细胞基因表达谱分析和tcr测序(10x sctcr)/转录物组分析的样品以下列方式一致地制备。从til收获制备单细胞悬浮液并冷藏。将样品解冻，并在不含细胞因子的til培养基中静置过夜。使用索尼细胞分选仪(ma900或sh800)分离cd4阳性和/或cd8阳性的活细胞，通常总计为约30,000个t细胞。将样品递送至单细胞分析核心设备nih(scaf)，用于10x sctcr分析。scaf递送原始条形码基因表达/tcr数据。将原始转录物数据归一化。在归一化数据上运行质量控制(qc)步骤以确定合适的簇深度水平。对转录物组数据进行t-sne。将tcr投影到转录物组t-sne图谱上。
[0105]
对于cite-seq分析，将冷藏的til解冻并置于不含细胞因子的til培养基中。第二天，使用死细胞去除试剂盒(miltenyi biotech，bergisch gladbach，germany)从til中去除死细胞，并使用easysep人t细胞分离试剂盒(stemcell technologies，vancouver，canada)进一步纯化t细胞。接下来，t细胞用荧光染料标记的抗cd3抗体和特征条形码(fbc)抗体染色，包括但不限于抗cd4、cd8a、cd45ra、cd45ro、cd62l、cd27、cd107a、hla-dr、cd39、cd103、cd69、cd134、cd137、cd244、cd272、cd357、cd279、cd274、cd223、cd366、klrg1、tigit、
cd185和cd278。使用索尼细胞分选仪(ma900或sh800)分离cd3+细胞，并将约50,000个t细胞递送至scaf以产生10x单细胞文库和深度测序。原始序列数据由10x cellranger和转录物组fbc处理，并且通过10x loupe应用和partek flow软件合并和分析tcr vdj数据。实施例1
[0106]
本实施例证实了使用单细胞转录物组分析从人直肠癌中分离新抗原反应性tcr的方法。
[0107]
第一次使用自体新抗原特异性t细胞(在分子水平上针对突变抗原和tcr序列而限定)来寻找具有新抗原反应性的t细胞的标志物。特别值得注意的是，这是使用来自常见上皮癌如结肠癌和肺癌的til完成的。这是用转录物组方法以及条形码抗体技术(cite-seq)进行的。通过酶消化新鲜肿瘤样本来制备单细胞悬浮液。从患有直肠癌的患者(患者4323)收获肝转移。对于该患者，开始使用先前描述的用于筛选til的技术鉴定了四种(4)新抗原反应性cd8
+ tcr(parkhurst等人，cancer discov.，9(8)：1022-1035(2019))，占肿瘤内所有til的总计6.6％。用流式细胞术从肿瘤消化物中分离cd4阳性和cd8阳性的t细胞。在scaf下进行10x sctcr。对转录物组数据进行t-sne。将tcr投影到转录物组t-sne图谱上。结果显示在图1a-1c中。
[0108]
图1a显示了来自患者4323的t细胞的t-sne分析结果。如图1a所示，所得单细胞转录物组数据的tsne表型聚类显示在分选的til中存在7个不同的表型集簇(图1a；集簇编号为0-7)。
[0109]
已知的新抗原反应性tcr被投影到图1a的t-sne图谱上。结果示于图1b中。如图1b所示，当已知的新抗原反应性tcr覆盖在tsne图上时，几乎所有的反应性tcr定位于单个集簇，即集簇5。集簇5被称为新抗原反应性tcr(neotcr)集簇。
[0110]
这种neotcr集簇代表功能紊乱的cd8
+
细胞表型，如多种活化/抑制标志物的存在所示，包括cd39(entpd1)、pd-1(pdcd1)、tigit、cd69、lag3、tim3(havcr2)、ctla4及其组合(图1c)。
[0111]
因此，假设该neotcr集簇中的其它未测试tcr也可能是新抗原反应性的。为了检验这一假设，利用单细胞tcr测序数据对neotcr集簇中的9种其它tcr进行了前瞻性的电脑模拟重建。在集簇5中，195个细胞表达已知的新抗原反应性tcr或具有可电脑模拟重建的tcr。
[0112]
将tcr克隆到pmsgv1载体中，在健康供体pbl中表达，并筛选针对患者4323的树突细胞(dc)的反应性：(i)用编码患者新抗原的tmg电穿孔或(ii)用编码患者新抗原的肽库脉冲。9种新的未知tcr中的7种(77.77％)在该筛选中是新抗原反应性的。
[0113]
总之，集簇5中97％的细胞是新抗原反应性的(图2a)。一些tcr很少，只能通过测序观察一次。相比之下，在所有8个集簇中都鉴定到了非反应性克隆(来自本研究和以前的鉴定该患者的新抗原反应性tcr的尝试)(图2b)。实施例2
[0114]
本实施例证实了新抗原反应性在对多种活化标志物呈阳性的细胞群内富集。
[0115]
将从实施例1中的患者4323收获的til冷藏。将细胞解冻并在没有细胞因子的情况下静置过夜。根据pd-1(1个96-孔板)，cd39(1个96-孔板)，tigit(0.5个板)或lag3(0.5个板)表达，将活cd3细胞分选到板中用于单细胞聚合酶链式反应(scpcr)和tcr重建。标志物阳性表达的分选细胞的百分比如下：pd-1(63.5％)，cd39(27.0％)，tigit(31.1％)和lag3
(0.74％)。通过immunoseq测定(adaptive biotechnologies)对分选的细胞进行测序。所有12种新抗原反应性tcr可用于分析不同群体之间的频率。
[0116]
对facs分选群体的适应性测序进行了回顾性分析。表1显示每个群体中新抗原反应性tcr的百分比。回顾性分析显示在多种活化标志物阳性的细胞群中新抗原反应性的富集。实施例3
[0117]
本实施例证实了使用单细胞转录物组分析从人结肠癌中分离新抗原反应性tcr的
方法。
[0118]
对已经从结肠癌患者(患者4324)切除的肺转移中分选的til进行单细胞转录物组分析和tcr测序。结果显示在图3a-3c中。对于该患者，先前鉴定了三种新抗原反应性cd8
+ tcr，总计占肿瘤内所有til的0.98％。这三种tcr识别突变的tp53。
[0119]
对于来自患者4324的til，不仅所有已知的新抗原反应性cd8
+ tcr富集在单一表型集簇(即集簇6)内(图3b)，而且该集簇与在样品4323中观察到的neotcr集簇共享许多标志物(即表2中列出的cd8
+
标志物)(图3c)。此外，还有另外的集簇(集簇4)，其含有与neotcr集簇具有相似表型的cd4
+ til。
[0120]
从4324的neotcr集簇重建四种tcr产生一种对突变tp53具有反应性的tcr。从cd8
+ cxcl13
+
集簇重建四种tcr并针对突变tp53(含有突变编码氨基酸的长肽和串联小基因)进行测试。一种tcr(即5号tcr)为阳性。
[0121]
来自4323和4324的cd8
+ neotcr集簇共有的标志物将被编译成cd8
+ neotcr标签，其可应用于单细胞转录物组数据以预测来自cd8
+
细胞的tcr是否将是癌症反应性的。用cd4
+ neotcr标签进行同样的测试。
[0122]
从cd8
+
集簇前瞻性地构建了10种新的tcr。从cd4
+
集簇前瞻性地构建了15种新的tcr。其目的是测试这些是否是新抗原反应性的。实施例4
[0123]
本实施例证实了已知的来自乳腺癌的cd4
+
新抗原反应性til自组装成由cxcl13表达标记的表型集簇。
[0124]
为了测试新抗原反应性tcr标签在cd4
+ til中是否有效，对来自乳腺癌转移样品(患者4322)的til进行单细胞转录物组和tcr测序，其中已知6种cd4
+
新抗原反应性tcr。结果显示在图4a-4c中。在该样品中，已知所有til的2.4％是反应性的(图4a)。
[0125]
在给定的集簇(即，集簇3)(图4b的框区)中发现了所有表达已知的cd4
+ neoag反应性tcr的细胞，其表达与4323和4324中的neotcr集簇类似的标志物(即，表2中列出的cd4
+
标志物)(图4c)，包括cxcl13。实施例5
[0126]
本实施例证实了来自肺癌的cd8
+
新抗原反应性til与来自直肠癌的cd8
+
新抗原反应性til共聚类。
[0127]
先前已经对从两个手术切除的非小细胞肺癌(nsclc)肿瘤分离的til进行了单细胞转录物组/tcr测序，其中til筛选显示反应性tcr(4234&4237，图5a)。
[0128]
用这些nsclc样品再聚类4323个cd8
+
集簇显示来自所有三个样品的反应性细胞均富集在同一集簇中(图5b)。
[0129]
这种含有neotcr的集簇对于与先前样品中所见的neotcr相同的活化/耗尽/检查点标志物是阳性的(图5c)，表明cd8
+ neotcr标签不限于胃肠道肿瘤内的til，而是更广泛地适用于那些浸润性的肺癌。实施例6
[0130]
本实施例证实了已知的来自结肠癌的cd4
+
新抗原反应性til自组装成由cxcl13表达标记的表型集簇。
[0131]
对来自结肠癌(患者4283)的肺转移的til进行单细胞转录物组和tcr测序，其中已
知四种cd4
+
新抗原反应性tcr。10倍测序捕获4种细胞中的3种(总计仅6种细胞)。结果示于图7a-7c中。
[0132]
所有表达已知的cd4
+ neoag反应性tcr的细胞都在表达cxcl13的给定集簇(即集簇2)中发现(图7b)。实施例7
[0133]
本实施例证实了表2中列出的标志物可用于以高置信度从肿瘤消化物鉴定肿瘤突变反应性t细胞。
[0134]
使用在4323的neotcr集簇中高度表达的基因，开发了用于称为“neotcr标签”的新抗原反应性tcr的转录物组基因表达谱。在单细胞水平上将这种标签应用于来自4323的til能够清楚地区分已知的新抗原反应性t细胞和其它细胞(p＜2
×
10-16
，wilcoxon秩和检验)(图6)。因此，neotcr标签可前瞻性地用于对来自肿瘤单个t细胞进行评分。基于neotcr标签的高得分，可合成tcr并测试肿瘤反应性。
[0135]
使用投影到其它患者的原始tsne图上的表达来自pt.4323的neotcr标签的第95个百分位数的细胞(图6)显示，neotcr标签以高置信度鉴定了相同的细胞集簇和细胞(图3a-3c-患者(pt.)4324；图4a-4c-pt.4322；以及图5a-5c-三个患者样品，即患者4323、4237和4234)。这些结果总结在图8a-8c中(8a-患者4324，8b-患者4322和8c-患者4323、4237和4234)。表2
[0136]
因此，表2所示的neotcr标签中所列的标志物可用于以高置信度从肿瘤消化物鉴定肿瘤突变反应性t细胞。表2的第一列列出了cd4
+
和cd8
+
新抗原反应性细胞共有的标志物。表2的第二列列出了cd4
+
新抗原反应性细胞共有的标志物。表2的第三列列出了cd8
+
新抗原反应性细胞共有的标志物。表2中在前面加上“(-)”的标志物与新抗原反应性负相关。表2中
未在前面加上“(-)”的标志物与新抗原反应性正相关。实施例8
[0137]
本实施例证实了使用cite-seq(通过测序的转录物组和表位的细胞索引)和抗体从人直肠癌中分离新抗原反应性tcr的方法。
[0138]
cite-seq是提供基于抗体的细胞表面分子检测以及tcr基因和转录物组分析的单细胞分析方法。通过使用cite-seq，与单独分析转录物组相比，可以获得更灵敏和定量的细胞表面分子表达数据。例如，当肿瘤样品的rna质量受损时，cite-seq方法可能是有用的。
[0139]
对来自非小细胞肺癌(nsclc)样本的三种单细胞悬浮液进行cite-seq分析。首先，比较由基于cite-seq的tsne和基于转录物组的tsne获得的新抗原反应性cd8
+ t细胞的聚类(图9)。如图9所示，在大多数情况下，基于抗体的tsne图导致新抗原反应性t细胞的更好的聚类。
[0140]
接下来，检测哪些分子在新抗原反应性t细胞中特异性表达。结果示于表3-8和图10中。表3表3表4表5
表6表6表7表8
[0141]
这些分析显示新抗原反应性cd8
+ t细胞表达一种或多种这样的细胞表面分子，如cd27、cd39、cd74、cd103、cd106、cd137、hla-dr、pd-1、tim-3和tigit。与其它非新抗原反应性cd8细胞相比，它们还通过ccr7、cd8a、cd16、cd45ra、cd62l和il7r的较低的细胞表面分子表达来标记(图11)。至于细胞内分子，除了实施例7中描述的neotcr标签中所包括的基因外，基因如afap1il2、asb2、hmox1和pdlim4也在新抗原反应性细胞上表达。
[0142]
为了测试这种neotcr标签能够鉴定先前未知的til和突变反应性tcr的假说，选择neotcr定义的集簇内的高频克隆型并合成它们的tcr基因。通过逆转录病毒转导将这些基因导入pbl，随后与呈递新抗原候选物的树突状细胞共培养，所述新抗原候选物已通过自体肿瘤的下一代测序鉴定(表9-11)。表9
[0143]
对于患者4234，在所查询的5种先前未知的tcr克隆型中，其中4种是新抗原反应性的。明显地，它们当中的所有在cd3
+
细胞中以小于1％的量存在，并且pnpla6反应性没有通过任何传统的til筛选方法鉴定到。表10
[0144]
对于患者4237，tcr f12和f9是通过传统的til筛选方法鉴定的，但是是在集簇中排序第一和第四的高频克隆型。在通过neotcr聚类选择的5种其它未确定的tcr克隆型中，其中3种被证明也识别bpnt1新抗原。总之，存在于neotcr集簇中的6种最频繁tcr克隆型中的5种对突变的bpnt1具有特异反应性。表11
[0145]
对于患者4369，通过传统的til筛选鉴定到最高频率的克隆型。在通过频率选择的另外5种未知克隆型中，其中的2种对突变的mllt4具有反应性。通过tcr测序，这两种新的mllt4-反应性克隆型以低于总til群的0.1％存在。这表明所述方法在选择新抗原反应性t细胞中的潜力。该集簇内的其它高频率克隆型可能识别其它尚未鉴定的肿瘤相关抗原，如癌症种系抗原家族。实施例9
[0146]
本实施例证实了对pd-1
+
/cd39
+
/tigit
+
细胞的分选可以高度富集新抗原反应性cd8
+
细胞。
[0147]
使用facs针对cd8、pd-1、cd39和tigit的表达来分选来自患者4323的两板细胞。通
过活cd3
+
cd8
+
门控细胞。在140种可辨别的tcr β链序列中，已知123种是新抗原反应性tcr(88％)(表12)。表12实施例10
[0148]
本实施例证实了cxcl13
+
捕获导致来自患者4323的已知新抗原反应性cd8
+
细胞的与pd-1
+
/cd39
+
/tigit
+
类似的富集。
[0149]
没有现成的cxcl13捕获试剂可用，但据报道cxcl13在没有特异性刺激/活化的情况下是通过elisa在体外可检测到的。生物素化的抗cxcl13单克隆抗体与现成的cd45-链霉亲和素缀合物结合。解冻4323肿瘤消化物，并与cd45-链霉亲和素：cxcl13生物素内部捕获抗体孵育过夜或4小时。然后洗涤样品，并与山羊igg或山羊抗cxcl13二抗和抗山羊igg pe-缀合的检测抗体一起孵育。在细胞分选仪(索尼ma900)上运行样品。分选cd8
+
cxcl13
+
细胞(33)来进行scpcr tcr测序。在分选的33个细胞中，鉴定到了28种可辨别的cdr3β序列。在28种可辨别的tcrβ链序列中，已知85.7％是新抗原反应性tcr(表13)。基于cxcl13表达的分选可以避免不具有用于抗原反应性cd4
+
细胞的理想表面标志物组的问题。表13
实施例11
[0150]
本实施例证实了cxcl13表达测定可以鉴定指示新抗原反应性的共表达标志物。
[0151]
患者4397接受了转移性肛门癌til采集。进行肿瘤消化。细胞立即用cd45：cxcl13双特异性抗体染色过夜。对细胞进行cxcl13和pd-1、cd39和tigit染色，并通过活cd3
+
门控。cd4
+
cxcl13
+
细胞在cd39
+
/tigit
+
/pd-1-细胞中频率最高(表14)。cd8
+
cxcl13
+
在cd39
+
/tigit
+
/pd-1
+
细胞中频率最高(表14)。表14表14实施例12
[0152]
本实施例证实了使用单细胞分析从肿瘤中快速分离新抗原tcr的工作流程。
[0153]
如实施例1-11所示，使用来自常见上皮癌(结肠直肠和肺)的克隆限定的t细胞，鉴定到了特异性识别肿瘤相关突变抗原(新抗原)的t细胞的标签。这是用基于单细胞转录物组的方法和使用条形码抗体(cite-seq)完成的，并且它可以在多维(tsne)图上的狭窄限定的空间内聚类这样的细胞。
[0154]
使用这种neotcr标签，查询了与已知新抗原反应性t细胞共聚类的具有这种相同表型的其它细胞，并且发现其含有非常高频率的以前未知的也识别来自相同肿瘤的新抗原的t细胞克隆。
[0155]
这种技术不仅扩大了识别已知新抗原的t细胞的所有组成部分，而且还可以鉴定对通过任何其它常规筛选方法未被鉴定为免疫原性的新抗原具有特异性的t细胞。
[0156]
这种方法的高灵敏度和特异性以及其直接从新鲜肿瘤样本的til进行的特征将其与发现突变反应性t细胞的常规方法区分开。
[0157]
快速确定反应性tcr序列的能力在将该信息转化成tcr改造的t细胞群以进行治疗中也具有很大的价值。使用从实施例1-11中概述的这几位患者获得的数据，设计了用于从人肿瘤中快速分离tcr，而不管肿瘤的组织学的工作流程。该工作流程在图12中概述。实施例13
[0158]
本实施例证实了从新鲜肿瘤切除中前瞻性分离hpv 16反应性tcr。
[0159]
通过pd-1、cd39和tigit共表达分选来自患者4397(肛门癌)的t细胞并进行tcr测序。针对患者新抗原和hpv16抗原测试在该群体中观察到的前11种tcr，因为切除的肿瘤样本显示hpv16 e4的表达。表15总结了cd39
+
pd1
+
tigit
+
分选的群体中的前11种tcr，突出显示了tcr1。表15中的数字是指在主体和富集群体内的百分比。表15
[0160]
表15的针对hpv16衍生肽筛选的11种tcr中的每一种显示通过tcr id 1(tcr1)对hpv16 e4的反应性(图13)。tcr1的进一步测试显示对由hla-b*13：02呈递的cd8-限制性hpv16 e4最小表位lqsslhlta(seq id no：1)的反应性。实施例14
[0161]
本实施例证实了使用单细胞转录物组分析从人类癌症中分离新抗原反应性tcr的方法。
[0162]
用于鉴定新抗原反应性t细胞受体(tcr)的基因表达谱进一步进行如下精炼。如实施例1所述，通过单细胞转录物组分析，来分析来自13个以上患者样品的跨越多种肿瘤类型和组织学的超过45,000个肿瘤浸润性t细胞。基因表达谱在所有这些患者t细胞中都成功地得到了一致的验证。表16中列出了针对共有基因以及cd4和cd8的新抗原反应性t细胞的基
因表达谱。表16
neotcr。总之，本研究提供了对鉴定了反应性的12/12患者的测序til中肿瘤特异性neotcr的成功富集和检测。neotcr基因标签也不同于无关的病毒特异性t细胞，因此可以准确地鉴别肿瘤无关的t细胞。
[0164]
在此引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)通过引用并入本文，其程度如同每个参考文献单独地且具体地指示为通过引用并入本文，并以其全部内容在本文中阐述。。
[0165]
除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，在描述本发明的上下文中(尤其是在所附权利要求的上下文中)，所用术语“一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”和“至少一个”以及类似的表示，将被解释为涵盖了单数和复数。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，使用术语“至少一个”，随后列举一个或多个项目(例如，“a和b中的至少一个”)应被解释为是指选自所列项目的一个项目(a或b)，或者两个或更多个所列项目的任意组合(a和b)。除非另有说明，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”将被解释为开放式术语(即，意味着“包括，但不限于”)。除非本文另有说明，本文中提及的数值范围仅旨在用作单独提及每一个单独的值落在该范围内的简约表现方法，并且每个单独的值如同被本文单独列举而并入到说明书中。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另有要求，本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用，仅旨在更好地阐明本发明且对本发明的范围不构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示出对实施本发明所必需的任何未要求保护的元素。
[0166]
本文描述了本发明的优选方面，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。对本领域普通技术人员而言，在阅读以上描述后，这些优选方面的各种变型是显而易见的。本发明人预期本领域技术人员在适当情况下将采用这些变型，并且发明人期望本发明以不同于本文所具体描述的方式实施。因此，本发明包括由适用法律允许的所附权利要求书所述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，在所有可能的变型中上述元素的任意组合都包含在本发明中。