提高重组腺相关病毒产率的方法与流程

提高重组腺相关病毒产率的方法
1.与相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年3月16日提交的美国临时专利申请号62/990,099的利益和优先权，所述临时申请的全部内容为所有目的整体通过引用并入本文。
技术领域
3.本发明总体涉及提高重组腺相关病毒载体(raav)产率的方法，更具体地，本发明涉及使用化合物提高raav产率。


背景技术：

4.腺相关病毒(aav)是一种非致病性、复制缺陷型细小病毒。重组aav载体(raav)具有许多独特的特点，使其成为具有吸引力的基因治疗载体。特别是，raav载体可以将治疗性基因递送到分裂和非分裂细胞，并且这些基因可以长时间保留而不整合到靶细胞的基因组中。鉴于raav的广泛治疗应用，对生产raav载体的改进方法，包括获得高滴度raav载体产率的方法，仍存在着持续不断的需求。以前改进各种病毒载体生产的尝试包括使用细胞培养添加剂例，如金属、微量补充剂、盐等(参见例如williams,j.gen.virol.,9(3):251-5(1970)；weinbauer等，limnology and oceanography,54(3):774-784(2009)；yang等，hepatology,48(5):1396-403(2008)；和美国公开号20150353899)。


技术实现要素：

5.本发明部分是基于下述发现，即当将用于产生重组腺相关病毒载体(raav)的宿主细胞与包含本文描述的化合物的溶液接触时，所述宿主细胞产生raav的量将增加。
6.因此，一方面，本文提供了一种生产重组腺相关病毒(raav)的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含至少一种式(i)的化合物或其盐的溶液接触：
7.其中：
8.表示单键或双键；
9.n是选自1至5的整数；
10.每个r1在每次出现时独立地选自由-oh、c
1-6
烷基、c
1-6
烷基-oh、c
1-6
烷基-o-c
1-6
烷基、-o-c
1-6
烷基、-c(o)n(ra)2和-c(o)orb组成的组；
11.ra在每次出现时独立地是氢或c
1-6
烷基；
12.rb在每次出现时独立地是氢或c
1-6
烷基；
13.x是crcrd或n；
14.rc和rd在每次出现时独立地选自由氢、c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基组成的组，其中当rc是氢时，rd选自c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基，当rc选自c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基时，rd是氢；并且
15.其中所述至少一种化合物不是：
16.或其盐。
17.另一方面，本文提供了一种提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含式(i)的化合物或其盐的溶液接触。
18.在某些实施方式中，所述溶液包含至少一种式(i-a)的化合物或其盐：
19.其中：
20.r2和r3在每次出现时独立地是氢或-oh，
21.或者r2和r3可以合在一起形成羰基；
22.r4选自由氢、-oh、-o-c
1-6
烷基和-n(re)2组成的组；并且
23.re在每次出现时独立地是氢或c
1-6
烷基。
24.在某些实施方式中，所述溶液包含选自下述组成的组中至少一种化合物：
25.及其任何组合。
26.在某些实施方式中，所述溶液包含至少一种式(i-b)的化合物或其盐：
27.其中：
28.x是crcrd；并且
29.r
5a
、r
5b
、r
5c
、r
5d
和r
5e
在每次出现时独立地是-oh、-o-c
1-6
烷基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷基-oh和c
1-6
烷基-o-c
1-6
烷基；并且
30.rc和rd在每次出现时独立地选自由氢、c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基组成的组，其中当rc是氢时，rd选自c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基，当rc选自c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基时，rd是氢。
31.在某些实施方式中，所述溶液包含式(iii)的化合物：
32.4(high-five)细胞。在一个实施方式中，所述宿主细胞是hela细胞。在另一个实施方式中，所述宿主细胞是hek293细胞。设想了宿主细胞可以包含重组核酸构建物，其包含侧翼带有aav反向末端重复序列的异源核苷酸序列。在一个实施方式中，所述宿主细胞可以包含rep和cap基因(例如aav rep和cap基因)。在一个实施方式中，所述宿主细胞可以包含辅助病毒基因，例如，通过辅助质粒或通过用腺病毒感染提供。在一个实施方式中，所述宿主细胞包含：i)侧翼带有aav反向末端重复序列的异源核苷酸序列，ii)rep和cap基因，和iii)辅助病毒基因。
50.在一个实施方式中，与未与包含所述至少一种化合物(例如式(i)、(i-a)、(i-b)、(ii)、(iii)或(iv)的化合物或b族维生素(例如维生素b2、维生素b7、维生素b9或维生素b
12
))的溶液接触的宿主细胞所产生的分泌raav量相比，所述宿主细胞产生至少1.2倍高的分泌raav量。在另一个实施方式中，与未与包含所述至少一种化合物(例如式(i)、(i-a)、(i-b)、(ii)、(iii)或(iv)的化合物或b族维生素(例如维生素b2、维生素b7、维生素b9或维生素b
12
))的溶液接触的宿主细胞所产生的总raav量相比，所述宿主细胞产生至少1.2倍高的总raav量。
51.在某些实施方式中，本发明提供了生产重组腺相关病毒(raav)的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含选自下述组成的组中至少一种化合物的溶液接触：
52.及其任何组合，
53.其中所述宿主细胞包含：i)侧翼带有aav反向末端重复序列的异源核苷酸序列，ii)aav rep和cap基因，和iii)任选的辅助病毒基因。
54.在某些实施方式中，本发明提供了提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含选自下述组成的组中至少一种化合物的溶液接触：
55.及其任何组合，
56.其中所述宿主细胞包含：i)侧翼带有aav反向末端重复序列的异源核苷酸序列，ii)aav rep和cap基因，和iii)任选的辅助病毒基因。
57.在某些实施方式中，本发明提供了组合物，其包含宿主细胞和选自下述组成的组中至少一种化合物：
58.及其任何组合，
59.其中所述宿主细胞包含：i)侧翼带有aav反向末端重复序列的异源核苷酸序列，ii)aav rep和cap基因，和iii)任选的辅助病毒基因。
60.在某些实施方式中，本发明提供了生产重组腺相关病毒(raav)的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含下述化合物的溶液接触：
[0061][0062]
其中所述宿主细胞包含：i)侧翼带有aav反向末端重复序列的异源核苷酸序列，ii)aav rep和cap基因，和iii)任选的辅助病毒基因。
[0063]
在某些实施方式中，本发明提供了提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含下述化合物的溶液接触：
[0064][0065]
其中所述宿主细胞包含：i)侧翼带有aav反向末端重复序列的异源核苷酸序列，ii)aav rep和cap基因，和iii)任选的辅助病毒基因。
[0066]
在某些实施方式中，本发明提供了组合物，其包含宿主细胞和下述化合物：
[0067][0068]
其中所述宿主细胞包含：i)侧翼带有aav反向末端重复序列的异源核苷酸序列，ii)aav rep和cap基因，和iii)任选的辅助病毒基因。
[0069]
在某些实施方式中，本发明提供了生产重组腺相关病毒(raav)的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含下述化合物的溶液接触：
[0070][0071]
其中所述宿主细胞包含：i)侧翼带有aav反向末端重复序列的异源核苷酸序列，ii)aav rep和cap基因，和iii)任选的辅助病毒基因。
[0072]
在某些实施方式中，本发明提供了提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含下述化合物的溶液接触：
[0073][0074]
其中所述宿主细胞包含：i)侧翼带有aav反向末端重复序列的异源核苷酸序列，ii)aav rep和cap基因，和iii)任选的辅助病毒基因。
[0075]
在某些实施方式中，本发明提供了组合物，其包含宿主细胞和
[0076][0077]
其中所述宿主细胞包含：i)侧翼带有aav反向末端重复序列的异源核苷酸序列，ii)aav rep和cap基因，和iii)任选的辅助病毒基因。
[0078]
在某些实施方式中，本发明提供了生产重组腺相关病毒(raav)的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含选自由维生素b2、维生素b7、维生素b9、维生素b
12
及其任何组合组成的组中的至少一种化合物的溶液接触，其中所述宿主细胞包含：i)侧翼带有aav反向末端重复序列的异源核苷酸序列，ii)aav rep和cap基因，和iii)任选的辅助病毒基因。
[0079]
在某些实施方式中，本发明提供了提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含选自由维生素b2、维生素b7、维生素b9、维生素b
12
及其任何组合组成的组中的至少一种化合物的溶液接触，其中所述宿主细胞包含：i)侧翼带有aav反向末端重复序列的异源核苷酸序列，ii)aav rep和cap基因，和iii)任选的辅助病毒基因。
[0080]
在提供的方法的某些实施方式中，所述溶液不含或其盐。
[0081]
在提供的方法的某些实施方式中，所述溶液不含或其盐。
[0082]
在某些实施方式中，提供的组合物不含或其盐。
[0083]
在某些实施方式中，提供的组合物不含或其盐。
[0084]
在某些实施方式中，本发明提供了组合物，其包含宿主细胞和选自由维生素b2、维生素b7、维生素b9、维生素b
12
及其任何组合组成的组中的至少一种化合物，其中所述宿主细胞包含：i)侧翼带有aav反向末端重复序列的异源核苷酸序列，ii)aav rep和cap基因，和iii)任选的辅助病毒基因。
[0085]
其他方面，本发明提供了通过任何所设想的方法生产的raav，包含通过任何设想的方法生产的raav的组合物，或包含宿主细胞和至少一种本文描述的化合物(例如式(i)、(i-a)、(i-b)、(ii)、(iii)或(iv)的化合物或b族维生素(例如维生素b2、维生素b7、维生素b9、维生素b
12
或其任何组合)或其任何组合)的组合物。
[0086]
本发明的这些和其他方面和特点在下面的详细描述和权利要求书中描述。
附图说明
[0087]
本发明的前述和其他目的、特点和优点将从下面如附图中所说明的优选实施方式的描述变得显而易见。在相应附图中，类似的参考符号标识共同的特点。
[0088]
图1是在不同烟酰胺浓度(0.1mm至40mm)下从hela生产细胞产生的不同进化枝e和f raav的归一化体积重组aav(raav)滴度的概括柱形图。以每毫升基因组拷贝数(gc/ml)测量的的滴度相对于缺乏烟酰胺情况下的raav产量进行标准化。
[0089]
图2是在不同烟酰胺浓度下从不同hela生产细胞产生的进化枝e和f raav的归一化的体积raav滴度(gc/ml)的数据点的三阶多项式拟合。
[0090]
图3描绘了烟酰胺的容器规模对hela生产细胞系生产raav的影响的柱形图。该细胞系能够产生编码因子ix转基因的进化枝e raav(aavrh10-fix)。使用了两种常见容器规模：3ml深孔板(24-dw)和100ml摇瓶(烧瓶)。烟酰胺以指示浓度(1mm至50mm)添加，并测量raav产率(gc/ml)。
[0091]
图4a描绘了烟酰胺对hela生产细胞系克隆生产raav的影响的柱形图。该细胞系能够产生编码因子ix转基因的进化枝e raav(aavrh10-fix)。烟酰胺以指示浓度(5mm至40mm)添加，并测量raav产率(gc/ml)。
[0092]
图4b描绘了烟酰胺对第一个hela生产细胞系克隆生产raav的影响的柱形图。该细胞系能够产生编码葡萄糖6-磷酸酶(g6pase)转基因的进化枝e raav(aav8-g6pase)。烟酰胺以指示浓度(5mm至40mm)添加，并测量raav产率(gc/ml)。
[0093]
图4c描绘了烟酰胺对第二个hela生产细胞系克隆生产raav的影响的柱形图。该细胞系能够产生编码葡萄糖6-磷酸酶(g6pase)转基因的进化枝e raav(aav8-g6pase)。烟酰胺以指示浓度(1mm至40mm)添加，并测量raav产率(gc/ml)。
[0094]
图4d描绘了烟酰胺对hela生产细胞系克隆生产raav的影响的柱形图。该细胞系能够产生编码因子viii转基因的进化枝e raav(aavhu37-fviii)。烟酰胺以所指示浓度(1mm至40mm)添加，并测量raav产率(gc/ml)。
[0095]
图5描绘了烟酰胺对两个hela生产细胞系克隆生产raav的影响的柱形图。这两个细胞系能够产生编码截短的atp7b转基因的重组进化枝f aav(aav9-atp7b)。将所述克隆在2l生物反应器中培养。烟酰胺以所指示浓度(3mm)添加，并测量raav产率(gc/ml)。
[0096]
图6描绘了烟酰胺对30ml摇瓶中培养的hek293细胞生产raav的影响的柱形图。将所述hek293细胞用能够产生编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶的重组进化枝e aav(raav8-otc)的质粒转染。烟酰胺以所指示浓度(0.03mm至30mm)添加，并测量raav产率(gc/ml)。
[0097]
详细描述
[0098]
本发明部分是基于下述发现，即当将化合物例如式(i)的化合物、式(i-a)的化合物、式(i-b)的化合物、式(ii)的化合物、式(iii)的化合物、式(iv)的化合物或其任一者的c1-6
烷基、-c(o)n(ra)2和-c(o)orb的化合物；在某些实施方式中，本文描述的式(i)的化合物是其中x是crcrd，rc是氢，rd是-oh，并且r1在每次出现时独立地选自-oh、c
1-6
烷基、c
1-6
烷基-oh、c
1-6
烷基-o-c
1-6
烷基、-o-c
1-6
烷基、-c(o)n(ra)2和-c(o)orb的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i)的化合物是其中x是crcrd，rc是氢，rd是-oh，并且r1是-oh的化合物。
[0115]
在某些实施方式中，本文描述的式(i)的化合物是其中x是n，n是1，并且r1在每次出现时独立地选自c
1-6
烷基-oh、-c(o)n(ra)2和-c(o)orb(例如r1在每次出现时独立地选自-ch2oh、-c(o)nh2、-c(o)oh和-c(o)och3)的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i)的化合物是其中x是crcrd，rc是氢，rd是-oh，n是5，并且r1是-oh的化合物。
[0116]
在某些实施方式中，本发明提供了一种生产重组腺相关病毒(raav)的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含至少一种式(i-a)的化合物或其盐的溶液接触。在某些实施方式中，本发明提供了一种提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含式(i-a)的化合物或其盐的溶液接触：
[0117]
其中：
[0118]
r2和r3在每次出现时独立地是氢或-oh，
[0119]
或者r2和r3可以合在一起形成羰基；
[0120]
r4选自由氢、-oh、-o-c
1-6
烷基和-n(re)2组成的组；并且
[0121]
re在每次出现时独立地是氢或c
1-6
烷基。
[0122]
在某些实施方式中，本文描述的式(i-a)的化合物是其中r2和r3合在一起形成羰基的化合物。在某些实施方式中，式(i-a)的化合物是其中r4选自-oh、-o-c
1-6
烷基和-n(re)2(例如-nh2、-oh和-och3)的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-a)的化合物是其中r4选自-nh2、-oh和-och3的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-a)的化合物是其中r2和r3合在一起形成羰基，并且r4选自-oh、-o-c
1-6
烷基和-n(re)2(例如-nh2、-oh和-och3)的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-a)的化合物是其中r2和r3合在一起形成羰基，并且r4选自-nh2、-oh和-och3的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-a)的化合物是其中r2和r3合在一起形成羰基，并且r4是-nh2的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-a)的化合物是其中r2和r3合在一起形成羰基，并且r4是-oh的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-a)的化合物是其中r2和r3合在一起形成羰基，并且r4是-och3的化合物。
[0123]
在某些实施方式中，本文描述的式(i-a)的化合物是其中r2和r3两者都是氢的化合物。在某些实施方式中，式(i-a)的化合物是其中r4选自氢、-oh、-o-c
1-6
烷基和-n(re)2(例如-nh2、-oh和-och3)的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-a)的化合物是其中r4选自氢、-nh2、-oh和-och3的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-a)的化合物是其中r2和r3两者都是氢，并且r4选自氢、-nh2、-oh和-och3的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-a)的化合物是其中r2和r3两者都是氢，并且r4是氢的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-a)的化合物是其中r2和r3两者都是氢，并且r4是-nh2的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-a)的化合物是其中r2和r3两者都是氢，并且r4是-oh的化合物。
在某些实施方式中，本文描述的式(i-a)的化合物是其中r2和r3两者都是氢，并且r4是-och3的化合物。
[0124]
在某些实施方式中，本文描述的式(i-a)的化合物是其中r2和r3在每次出现时独立地是氢或-oh，或者r2和r3可以合在一起形成羰基，并且r4是-oh的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-a)的化合物是其中r2和r3在每次出现时独立地是氢或-oh，或者r2和r3可以合在一起形成羰基，并且r4是-och3的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-a)的化合物是其中r2和r3在每次出现时独立地是氢或-oh，或者r2和r3可以合在一起形成羰基，并且r4是-nh2的化合物。
[0125]
在某些实施方式中，本发明提供了一种生产raav的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含选自下述组成的组中至少一种化合物的溶液接触：
[0126]
及其任何组合。
[0127]
在某些实施方式中，提供了生产raav的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含选自下述组成的组中至少一种化合物的溶液接触：烟酰胺，烟酸，烟酸甲酯，烟醇，及其任何组合。
[0128]
在某些实施方式中，本发明提供了一种提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含选自下述组成的组中至少一种化合物的溶液接触：
[0129]
及其任何组合。
[0130]
在某些实施方式中，提供了提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含选自下述组成的组中至少一种化合物的溶液接触：烟酰胺，烟酸，烟酸甲酯，烟醇，及其任何组合。
[0131]
在某些实施方式中，本发明提供了一种生产raav的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含至少一种式(i-b)的化合物或其盐的溶液接触。在某些实施方式中，本发明提供了一种提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含至少一种式(i-b)的化合物或其盐的溶液接触：
[0132]
其中：
[0133]
x是crcrd；并且
[0134]r5a
、r
5b
、r
5c
、r
5d
和r
5e
在每次出现时独立地是-oh、-o-c
1-6
烷基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷基-oh和c
1-6
烷基-o-c
1-6
烷基，
[0135]
其中rc和rd在每次出现时独立地选自氢、c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基，其中当rc是氢时，rd选自c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基，当rc选自c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基时，rd是氢。
[0136]
在某些实施方式中，本文描述的式(i-b)的化合物是其中rc是氢，并且rd选自c
1-6
烷
基、-oh和-o-c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-b)的化合物是其中rc选自c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基，并且rd是氢的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-b)的化合物是其中rc是氢，并且rd是-oh的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-b)的化合物是其中rc是氢，并且rd是-o-c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-b)的化合物是其中rc是氢，并且rd是c
1-6
烷基的化合物。
[0137]
在某些实施方式中，本文描述的式(i-b)的化合物是其中r
5a
、r
5b
、r
5c
、r
5d
和r
5e
是-oh的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-b)的化合物是其中rc是氢，并且rd是-oh的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-b)的化合物是其中r
5a
、r
5b
、r
5c
、r
5d
和r
5e
是-oh，并且rc和rd在每次出现时独立地选自氢、c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基的化合物，其中当rc是氢时，rd选自c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基，并且当rc选自c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基时，rd是氢。在某些实施方式中，本文描述的式(i-b)的化合物是其中r
5a
、r
5b
、r
5c
、r
5d
和r
5e
是-oh，rc是氢，并且rd选自c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(i-b)的化合物是其中r
5a
、r
5b
、r
5c
、r
5d
和r
5e
是-oh，rc是氢，并且rd选自-oh的化合物。
[0138]
在某些实施方式中，本发明提供了一种生产raav的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含式(iii)的化合物或其盐的溶液接触：
[0139][0140]
在某些实施方式中，本发明提供了一种生产raav的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含肌醇或其盐的溶液接触。
[0141]
在某些实施方式中，本发明提供了一种提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含式(iii)的化合物或其盐的溶液接触：
[0142][0143]
在某些实施方式中，本发明提供了一种提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含肌醇或其盐的溶液接触。
[0144]
另一方面，本发明提供了一种生产raav的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含式(ii)的化合物或其盐的溶液接触。另一方面，本发明提供了一种提高raav滴度产率的方
法，所述方法包括将宿主细胞与包含至少一种式(ii)的化合物或其盐的溶液接触：
[0145][0146]
其中：
[0147]
r6和r7在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基；
[0148]
r8和r9在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基；
[0149]
y是c或n；
[0150]r10
和r
11
在每次出现时独立地选自氢、-oh和c
1-6
烷基；
[0151]
a选自由氢、c
1-6
烷基和-c(o)n(rf)2组成的组；并且
[0152]
rf在每次出现时独立地选自氢、c
1-6
烷基、c
1-6
烷基-c(o)oh和c
1-6
烷基-oh；
[0153]
其中所述至少一种化合物不是：
[0154][0155]
在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中r6和r7是氢的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中r8和r9是氢的化合物。在某些实施方式中，式(ii)的化合物是其中r6和r7是氢，并且r8和r9在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中r8和r9是氢，并且r6和r7在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中r6、r7、r8和r9是氢的化合物。
[0156]
在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是c的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是c，r6和r7是氢，并且r8和r9在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是c，r8和r9是氢，并且r6和r7在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是c，并且r6、r7、r8和r9是氢的化合物。
[0157]
在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是n的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是n，r6和r7是氢，并且r8和r9在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是n，r8和r9是氢，并且r6和r7在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是n，并且r6、r7、r8和r9是氢的化合物。
[0158]
在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中r
10
和r
11
是c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中r
10
和r
11
是ch3的化合物。
[0159]
在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是c，r
10
和r
11
是c
1-6
烷基，r6和r7是氢，并且r8和r9在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是c，r
10
和r
11
是c
1-6
烷基，r8和r9是氢，
并且r6和r7在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是c，r
10
和r
11
是c
1-6
烷基，并且r6、r7、r8和r9是氢的化合物。
[0160]
在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是n，r
10
和r
11
是c
1-6
烷基，r6和r7是氢，并且r8和r9在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是n，r
10
和r
11
是c
1-6
烷基，r8和r9是氢，并且r6和r7在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是n，r
10
和r
11
是c
1-6
烷基，并且r6、r7、r8和r9是氢的化合物。
[0161]
在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是c，r
10
和r
11
是ch3，r6和r7是氢，并且r8和r9在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是c，r
10
和r
11
是ch3，r8和r9是氢，并且r6和r7在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是c，r
10
和r
11
是ch3，并且r6、r7、r8和r9是氢的化合物。
[0162]
在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是n，r
10
和r
11
是ch3，r6和r7是氢，并且r8和r9在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是n，r
10
和r
11
是ch3，r8和r9是氢，并且r6和r7在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是n，r
10
和r
11
是ch3，并且r6、r7、r8和r9是氢的化合物。
[0163]
在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中a是c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中a是ch3的化合物。
[0164]
在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是是其中y是c，a是c
1-6
烷基，r
10
和r
11
是ch3，r6和r7是氢，并且r8和r9在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是c，a是c
1-6
烷基，r
10
和r
11
是ch3，r8和r9是氢，并且r6和r7在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是c，a是c
1-6
烷基，r
10
和r
11
是ch3，并且r6、r7、r8和r9是氢的化合物。
[0165]
在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是n，a是c
1-6
烷基，r
10
和r
11
是ch3，r6和r7是氢，并且r8和r9在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中y是n，a是c
1-6
烷基，r
10
和r
11
是ch3，r8和r9是氢，并且r6和r7在每次出现时独立地选自氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基的化合物。在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是是其中y是n，a是c
1-6
烷基，r
10
和r
11
是ch3，并且r6、r7、r8和r9是氢的化合物。
[0166]
在某些实施方式中，本文描述的式(ii)的化合物是其中r6、r7、r8和r9是氢，y是n，r
10
和r
11
是ch3，并且a是ch3的化合物。
[0167]
在某些实施方式中，本发明提供了一种生产raav的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含式(iv)的化合物或其盐的溶液接触：
[0168]
[0169]
在某些实施方式中，本发明提供了一种生产raav的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含胆碱或其盐的溶液接触。
[0170]
在某些实施方式中，本发明提供了一种提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含式(iv)的化合物或其盐的溶液接触：
[0171][0172]
在某些实施方式中，本发明提供了一种提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含胆碱或其盐的溶液接触。
[0173]
另一方面，本发明提供了一种生产raav的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含选自维生素b2、维生素b7、维生素b9、维生素b
12
或其任何组合的至少一种b族维生素的溶液接触。
[0174]
另一方面，本发明提供了一种提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含选自维生素b2、维生素b7、维生素b9、维生素b
12
或其任何组合的至少一种b族维生素的溶液接触。
[0175]
ii.培养条件
[0176]
在某些实施方式中，本发明提供了一种生产raav或提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含至少一种本文所描述的化合物(例如式(i)、(i-a)、(i-b)、(ii)、(iii)或(iv)的化合物或b族维生素(例如维生素b2、维生素b7、维生素b9、维生素b
12
或其任何组合)或其任何组合)的溶液接触，其中所述至少一种化合物在所述溶液中的终浓度大于0.5mm。在其他实施方式中，所述至少一种化合物在所述溶液中的终浓度大于或等于0.5mm。
[0177]
在某些实施方式中，本发明提供了一种生产raav或提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含至少一种本文所描述的化合物(例如式(i)、(i-a)、(i-b)、(ii)、(iii)或(iv)的化合物或b族维生素(例如维生素b2、维生素b7、维生素b9、维生素b
12
或其任何组合)或其任何组合)的溶液接触，其中所述至少一种化合物在所述溶液中的终浓度在0.5mm至15mm(例如0.5mm至14mm之间、0.5mm至13mm之间、0.5mm至12mm之间、0.5mm至11mm之间、0.5mm至10mm之间、0.5mm至9mm之间、0.5mm至8mm之间、0.5mm至7mm之间、0.5mm至6mm之间、0.5mm至5mm之间、0.5mm至4mm之间、0.5mm至3mm之间、0.5mm至2mm之间、0.5mm至1mm之间、1mm至15mm之间、2mm至15mm之间、3mm至15mm之间、4mm至15mm之间、5mm至15mm之间、6mm至15mm之间、7mm至15mm之间、8mm至15mm之间、9mm至15mm之间、10mm至15mm之间、11mm至15mm之间、12mm至15mm之间、13mm至15mm之间和14mm至15mm之间)。在某些示例性实施方式中，所述至少一种化合物在所述溶液中的终浓度在1mm至10mm之间。在某些实施方式中，所述至少一种化合物在所述溶液中的终浓度选自0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm或15mm以及在0.5mm至15mm之间的所有小数和分数值。
[0178]
在某些实施方式中，本发明提供了一种生产raav或提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含至少一种本文所描述的化合物(例如式(i)、(i-a)、(i-b)、(ii)、(iii)或(iv)的化合物或b族维生素(例如维生素b2、维生素b7、维生素b9、维生素b
12
或其任何组合)或其任何组合)的溶液接触，其中与未与包含所述至少一种化合物的溶液接触
的宿主细胞所产生的分泌raav量相比，所述至少一种化合物在所述溶液中的终浓度足以产生至少1.2倍高的分泌raav量。在某些实施方式中，所述提高可以是提高至1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5倍，以及1.2倍至5倍之间的所有小数和分数值。
[0179]
在某些实施方式中，本发明提供了一种生产raav或提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含至少一种本文所描述的化合物(例如式(i)、(i-a)、(i-b)、(ii)、(iii)或(iv)的化合物或b族维生素(例如维生素b2、维生素b7、维生素b9、维生素b
12
或其任何组合)或其任何组合)的溶液接触，其中与未与包含所述至少一种化合物的溶液接触的宿主细胞所产生的总raav量相比，所述至少一种化合物在所述溶液中的终浓度足以产生至少1.2倍高的总raav量。在某些实施方式中，所述提高可以是提高至1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5倍，以及1.2倍至5倍之间的所有小数和分数值。
[0180]
在某些实施方式中，本发明提供了一种生产raav或提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含至少一种本文所描述的化合物(例如式(i)、(i-a)、(i-b)、(ii)、(iii)或(iv)的化合物或b族维生素(例如维生素b2、维生素b7、维生素b9、维生素b
12
或其任何组合)或其任何组合)的溶液接触，其中与未与包含所述至少一种化合物的溶液接触的宿主细胞所产生的分泌raav量相比，所述至少一种化合物在所述溶液中的终浓度足以产生1.2至2.5倍高的分泌raav量。
[0181]
在某些实施方式中，本发明提供了一种生产raav或提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含至少一种本文所描述的化合物(例如式(i)、(i-a)、(i-b)、(ii)、(iii)或(iv)的化合物或b族维生素(例如维生素b2、维生素b7、维生素b9、维生素b
12
或其任何组合)或其任何组合)的溶液接触，其中未与包含所述至少一种化合物的溶液接触的宿主细胞所产生的总raav量相比，所述至少一种化合物在所述溶液中的终浓度足以产生1.2至2.5倍高的总raav量。
[0182]
在某些实施方式中，将所述宿主细胞与所述包含所述至少一种化合物的溶液接触至少2天。
[0183]
在某些实施方式中，所述方法还包括收获和纯化所述raav的步骤。
[0184]
在某些实施方式中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞选自hela、hek293、cos、a549、bhk和vero细胞。
[0185]
在一个实施方式中，所述宿主细胞是hela细胞。专业技术人员将会理解并容易地认识到，在hela细胞的含义内包括任何克隆衍生物例如hela s3细胞，其是可以在无血清培养基以及悬浮培养中生长的hela细胞系的亚克隆。
[0186]
在另一个实施方式中，所述宿主细胞是hek293细胞。专业技术人员将会理解并容易地认识到，在hek293细胞的含义内包括任何克隆衍生物例如hek293-f细胞、hek293-t细胞或hek-expi293细胞。
[0187]
在某些实施方式中，所述宿主细胞是昆虫细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞选自由sf9、sf-21、tn-368和bti-tn-5b1-4(high-five)细胞组成的组。
[0188]
在某些实施方式中，所述宿主细胞包含侧翼带有aav反向末端重复序列的异源核苷酸序列。在某些实施方式中，所述宿主细胞包含rep和cap基因(例如aav rep和cap基因)。
在某些实施方式中，所述宿主细胞包含辅助病毒基因。在某些实施方式中，所述宿主细胞包含：i)侧翼带有aav反向末端重复序列的异源核苷酸序列，ii)rep和cap基因(例如aav rep和cap基因)，和iii)辅助病毒基因。
[0189]
在某些实施方式中，本发明提供了一种生产raav或提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含至少一种本文所描述的化合物(例如式(i)、(i-a)、(i-b)、(ii)、(iii)或(iv)的化合物或b族维生素(例如维生素b2、维生素b7、维生素b9、维生素b
12
或其任何组合)或其任何组合)的溶液接触，其中与未与包含所述至少一种化合物的溶液接触的宿主细胞所产生的分泌raav量相比，所述宿主细胞产生至少1.2倍高的分泌raav量。
[0190]
在某些实施方式中，本发明提供了一种生产raav或提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含至少一种本文所描述的化合物(例如式(i)、(i-a)、(i-b)、(ii)、(iii)或(iv)的化合物或b族维生素(例如维生素b2、维生素b7、维生素b9、维生素b
12
或其任何组合)或其任何组合)的溶液接触，其中与未与包含所述至少一种化合物的溶液接触的宿主细胞所产生的总raav量相比,所述宿主细胞产生至少至少1.2倍高的总raav量。
[0191]
在某些实施方式中，本发明提供了一种生产raav或提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含至少一种本文所描述的化合物(例如式(i)、(i-a)、(i-b)、(ii)、(iii)或(iv)的化合物或b族维生素(例如维生素b2、维生素b7、维生素b9、维生素b
12
或其任何组合)或其任何组合)的溶液接触，其中与未与包含所述至少一种化合物的溶液接触的宿主细胞所产生的分泌raav量相比，所述宿主细胞产生1.2至2.5倍高的分泌raav量。
[0192]
在某些实施方式中，本发明提供了一种生产raav或提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含至少一种本文所描述的化合物(例如式(i)、(i-a)、(i-b)、(ii)、(iii)或(iv)的化合物或b族维生素(例如维生素b2、维生素b7、维生素b9、维生素b
12
或其任何组合)或其任何组合)的溶液接触，其中与未与包含所述至少一种化合物的溶液接触的宿主细胞所产生的总raav量相比，所述宿主细胞产生1.2至2.5倍高的总raav量。
[0193]
在某些实施方式中，所述溶液包含细胞培养基。在某些实施方式中，所述溶液包含生产培养基。
[0194]
在某些实施方式中，所述方法包括将所述宿主细胞进行悬浮培养。在某些实施方式中，所述方法包括将所述宿主细胞进行贴壁培养。在某些实施方式中，所述方法包括将所述宿主细胞在1l生物反应器中培养。在某些实施方式中，所述方法包括将所述宿主细胞在2l生物反应器中培养。在某些实施方式中，所述方法包括将所述宿主细胞在3l生物反应器中培养。在某些实施方式中，所述方法包括将所述宿主细胞在250l生物反应器中培养。在某些实施方式中，所述方法包括将所述宿主细胞在500l生物反应器中培养。在某些实施方式中，所述方法包括将所述宿主细胞在2,000l生物反应器中培养。
[0195]
iii.组合物
[0196]
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含宿主细胞和式(i)的化合物或其盐。
[0197]
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含宿主细胞和式(i-a)的化合物或其盐。
[0198]
在某些实施方式中，本发明提供了一种组合物，其包含宿主细胞和选自下述组成的组中至少一种化合物：
[0199]
及其任何组合。
[0200]
在某些实施方式中，本发明提供了一种组合物，其包含宿主细胞和选自下述组成的组至少一种化合物：烟酰胺，烟酸，烟酸甲酯，烟醇，及其任何组合。
[0201]
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含宿主细胞和至少一种式(i-b)的化合物或其盐。
[0202]
在某些实施方式中，本发明提供了一种组合物，其包含宿主细胞和式(iii)的化合物或其盐：
[0203][0204]
在某些实施方式中，本发明提供了一种组合物，其包含宿主细胞和肌醇或其盐。
[0205]
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含宿主细胞和式(ii)的化合物或其盐。
[0206]
在某些实施方式中，本发明提供了一种组合物，其包含宿主细胞和式(iv)的化合物或其盐：
[0207][0208]
在某些实施方式中，本发明提供了一种组合物，其包含宿主细胞和胆碱或其盐。
[0209]
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含宿主细胞和至少一种选自维生素b2、维生素b7、维生素b9、维生素b
12
或其任何组合的b族维生素。
[0210]
iv.化学定义
[0211]
下面更详细地描述了特定官能团和化学术语的定义。化学元素根据cas版“元素周期表”(《化学和物理学手册》(handbook of chemistry and physics)第75版，内封面)来识别，具体官能团一般如其中所述来定义。此外，有机化学的一般原理以及具体的功能基团和反应性，描述在下述文献中：thomas sorrell，《有机化学》(organic chemistry)，university science books,sausalito,1999；smith和march，《march高等有机化学》(march’s advanced organic chemistry)，第5版，john wiley&sons,inc.,new york,2001；larock，《综合有机转化》(comprehensive organic transformations)，vch publishers,inc.,new york,1989；和carruthers，《有机合成的一些现代方法》(some modern methods of organic synthesis)，第3版，cambridge university press,cambridge,1987。
[0212]
没有具体数目的指称在本文中可用于指称一个或多个(即至少一个)指称物。例
如，“类似物”意味着一个类似物或多个类似物。
[0213]
当列出值的范围时，它旨在涵盖所述范围内的每个值和子范围。例如，“c1–6烷基”旨在涵盖c1、c2、c3、c4、c5、c6、c1–6、c1–5、c1–4、c1–3、c1–2、c2–6、c2–5、c2–4、c2–3、c3–6、c3–5、c3–4、c4–6、c4–5和c5–6烷基。
[0214]
下述术语旨在具有下文呈现的含义，并有助于理解本发明的描述和预期范围。
[0215]“烷基”是指具有1至20个碳原子的直链或支链饱和烃基的基团(“c1–
20
烷基”)。在某些实施方式中，烷基具有1至12个碳原子(“c1–
12
烷基”)。在某些实施方式中，烷基具有1至10个碳原子(“c1–
10
烷基”)。在某些实施方式中，烷基具有1至9个碳原子(“c1–9烷基”)。在某些实施方式中，烷基具有1至8个碳原子(“c1–8烷基”)。在某些实施方式中，烷基具有1至7个碳原子(“c1–7烷基”)。在某些实施方式中，烷基具有1至6个碳原子(“c1–6烷基”)。在某些实施方式中，烷基具有1至5个碳原子(“c1–5烷基”)。在某些实施方式中，烷基具有1至4个碳原子(“c1–4烷基”)。在某些实施方式中，烷基具有1至3个碳原子(“c1–3烷基”)。在某些实施方式中，烷基具有1至2个碳原子(“c1–2烷基”)。在某些实施方式中，烷基具有1个碳原子(“c1烷基”)。在某些实施方式中，烷基具有2至6个碳原子(“c2–6烷基”)。c1–6烷基的实例包括甲基(c1)、乙基(c2)、正丙基(c3)、异丙基(c3)、正丁基(c4)、叔丁基(c4)、仲丁基(c4)、异丁基(c4)、正戊基(c5)、3-戊基(c5)、戊基(c5)、新戊基(c5)、3-甲基-2-丁基(c5)、叔戊基(c5)和正己基(c6)。烷基的其他实例包括正庚基(c7)、正辛基(c8)等。除非另有规定，否则烷基的每种情况都是独立地选择性取代，即是未取代的(“未取代的烷基”)或者被一个或多个取代基例如1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代(“取代的烷基”)。在某些实施方式中，所述烷基是未取代的c1–
10
烷基(例如-ch3)。在某些实施方式中，所述烷基是取代的c1–
10
烷基。常用的烷基缩略语包括me(-ch3)、et(-ch2ch3)、ipr(-ch(ch3)2)、npr(-ch2ch2ch3)、n-bu(-ch2ch2ch2ch3)或i-bu(-ch2ch(ch3)2)。
[0216]“羰基”是指
–
c(＝o)
–
。
[0217]“卤”或“卤素”是指氟(f)、氯(cl)、溴(br)和碘(i)。在某些实施方式中，所述卤素基团是氟或氯。
[0218]“平衡离子”(counterion)或“阴离子平衡离子”(anionic counterion)是与阳离子性季氨基缔合以便维持电中性的带负电荷的基团。示例性的平衡离子包括卤离子(例如f
–
、cl
–
、br
–
、i
–
)、no3–
、clo4–
、oh
–
、h2po4–
、hso4–
、磺酸根离子(例如甲磺酸根、三氟甲烷磺酸根、对甲苯磺酸根、苯磺酸根、10-樟脑磺酸根、萘-2-磺酸根、萘-1-磺酸-5-磺酸根、乙-1-磺酸-2磺酸根等)和羧酸根离子(例如乙酸根、乙醇根、丙酸根、苯甲酸根、甘油酸根、乳酸根、酒石酸根、乙醇酸根等)。
[0219]“可药用盐”是指本发明的化合物的在制药学上可接受并且具有母体化合物的所需药理活性的盐。具体来说，所述盐是无毒的，可以是无机或有机酸加成盐和碱加成盐。具体来说，所述盐包括：(1)与无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成的酸加成盐，或者与有机酸例如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3
–
(4
–
羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2
–
羟基乙磺酸、苯磺酸、4
–
氯苯磺酸、2
–
萘磺酸、4
–
甲苯磺酸、樟脑磺酸、4
–
甲基双环[2.2.2]
–
辛
–2–
烯
–1–
羧酸、葡萄糖庚酸，3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸
等形成的酸加成盐；或(2)当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子代替，或者与有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、n
–
甲基葡萄糖胺等配位时形成的盐。仅仅作为实例，盐还包括钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵盐等；以及当所述化合物含有碱性官能团时则为无毒性有机或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。术语“可药用阳离子”是指酸性官能团的可接受的阳离子平衡离子。此类阳离子的实例是钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵阳离子等。参见例如berge等，j.pharm.sci.(1977)66(1):1
–
79。
[0220]
这些和其他示例性取代基被更详细描述在详细描述和权利要求书中。本发明不打算以任何方式受上述取代基的示例清单限制。
[0221]
v.腺相关病毒
[0222]
腺相关病毒(aav)是细小病毒科依赖细小病毒属的一种小的、无包膜的二十面体病毒。aav具有大约4.7kb的单链线性dna基因组。aav包括大量血清学可区分的类型，包括血清型aav-1至aav-12以及来自于非人类灵长动物的超过100种血清型(参见例如srivastava,j.cell biochem.,105(1):17
–
24(2008)；和gao等，j.virol.,78(12),6381
–
6388(2004))。在本发明的方法中可以使用任何aav类型。aav能够感染几种组织类型的分裂和静止细胞，并且不同的aav血清型表现出不同的组织嗜性。aav是非自主复制的，具有包括潜伏期和感染期的生命周期。在细胞被aav感染后的潜伏期，aav位点特异性地整合到宿主的基因组中作为前病毒。除非细胞也被允许aav复制的辅助病毒(例如腺病毒(av)或单纯疱疹病毒)感染，否则感染期不会发生。
[0223]
野生型aav基因组含有两个145个核苷酸的反向末端重复序列(itrs)，其中包含指导aav复制、基因组衣壳化和整合的信号序列。除了itrs之外，三个aav启动子p5、p19和p40驱动编码rep和cap基因的两个开放阅读框的表达。两个rep启动子再加上单个aav内含子的差异剪接，导致rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep 68、rep52和rep 40)。rep蛋白负责基因组复制。cap基因由p40启动子表达，并编码三种衣壳蛋白(vp1、vp2和vp3)，它们是cap基因的剪接变体。这些蛋白质形成aav颗粒的衣壳。
[0224]
由于用于复制、衣壳化和整合的顺式作用信号包含在itrs内，因此4.3kb内部基因组的一部分或全部可以被外源dna取代，例如感兴趣的外源蛋白的表达盒。在这种情况下，rep和cap蛋白(例如aav rep和cap蛋白)被反式提供在质粒上。为了产生aav载体，允许aav复制的宿主细胞系通常应表达rep和cap基因、侧翼带有itr的表达盒和由辅助病毒提供的辅助功能例如腺病毒(av)基因e1a、e1b55k、e2a、e4orf6和va(weitzman等，腺相关病毒生物学(adeno-associated virus biology)，《腺相关病毒：方法和方案》(adeno-associated virus:methods and protocols)，pp.1
–
23,2011)。aav载体的产生也可以导致辅助病毒颗粒的产生，其在某些实施方式中必须在使用aav载体之前将这些病毒颗粒去除或失活。大量细胞类型适合于生产aav载体，包括hek293细胞、cos细胞、hela细胞、bhk细胞、vero细胞以及昆虫细胞(参见例如美国专利号6,156,303、5,387,484、5,741,683、5,691,176、5,688,676、8,163,543、美国公开号20020081721、pct公开号wo00/47757、wo00/24916和wo96/17947)。aav载体通常在这些细胞中通过一个含有侧翼带有itr的表达盒的质粒和提供额外的aav和辅助病毒基因的一个或多个额外质粒产生。在某些实施方式中，aav载体在这些细胞中通过一个含有侧翼带有itr的表达盒和aav病毒基因的质粒和提供辅助病毒基因的一
个或多个额外质粒产生。
[0225]
在本发明中可以使用任何血清型的aav。同样地，设想了可以使用任何av类型，并且本领域技术人员将能够鉴定适合于生产他们所需的重组aav载体(raav)的aav和av类型。aav和av颗粒可以例如通过亲和层析、碘克沙醇梯度或cscl梯度进行纯化。
[0226]
野生型aav的基因组是单链dna，并且为4.7kb。aav载体可以具有大小为4.7kb或大于或小于4.7kb的单链基因组，包括大至5.2kb或小至3.0kb的超大基因组。此外，载体基因组基本上是自我互补的，因此在病毒内基因组基本上是双链的。含有所有类型的基因组的aav载体均适合用于本发明的方法。
[0227]
如前所述，aav需要与辅助病毒共同感染才能进入其生命周期的感染期。辅助病毒包括腺病毒(av)和单纯疱疹病毒(hsv)，并且存在着使用杆状病毒在昆虫细胞中生产aav的系统。也已提出，乳头瘤病毒也可以为aav提供辅助功能(参见例如hermonat等，molecular therapy 9,s289
–
s290(2004))。辅助病毒包括能够产生并允许aav复制的任何病毒。av是一种无包膜核dna病毒，具有大约36kb的双链dna基因组。av能够通过提供e1a、e1b55k、e2a、e4orf6和va基因，允许aav复制和衣壳化，来挽救细胞中潜伏的aav前病毒。hsv是一类具有相对较大的双链线性dna基因组的病毒，所述基因组被包装在二十面体衣壳中，所述衣壳被包裹在脂质双层包膜中。hsv具有感染性和高度传播性。下述hsv-1复制蛋白被鉴定为通常为aav复制的hsv-1辅助功能所必需：解旋酶/引发酶复合体(ul5、ul8和ul52)和由ul29基因编码的dna结合蛋白icp8，以及增强辅助功能的其他蛋白质。
[0228]
vi.raav的生产
[0229]
本发明包括使用本领域中已知的任何适合的方法，从宿主细胞生产重组腺相关病毒载体(raav)。当在本文中使用时，术语“宿主细胞”是指能够生产raav的任一种或多种细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞例如hela细胞、cos细胞、hek293细胞、a549细胞、bhk细胞或vero细胞。在其他实施方式中，所述宿主细胞是昆虫细胞例如sf9细胞、sf-21细胞、tn-368细胞或bti-tn-5b1-4(high-five)细胞。除非另有指明，否则术语“细胞”或“细胞系”被理解为包括所指明的细胞或细胞系的修饰或工程化改造的变体。
[0230]
如前所述，为了生产raav，通常应向宿主细胞提供aav反向末端重复序列(itrs)(其可以例如在感兴趣的异源核苷酸序列两侧)、aav rep和cap基因功能以及额外的辅助功能。可使用任意数量的适合的质粒或载体提供给所述宿主细胞。例如额外的辅助功能可以通过腺病毒(av)感染、携带全部所需av辅助功能基因的载体(质粒)或其他病毒例如hsv或杆状病毒来提供。宿主细胞产生raav所必需的任何基因、基因功能或其他遗传物质均可以短暂存在于所述宿主细胞内，或者被稳定地插入到宿主细胞基因组中。在某些实施方式中，所述宿主细胞是包含aav rep和cap基因功能和raav载体基因组的生产细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞是包含aav rep和cap基因功能的包装细胞，其在生产时通过独立的重组病毒提供raav载体基因组。适合与本发明方法一起使用的raav生产方法包括在下述文献中公开的方法：clark等，human gene therapy 6:1329
–
1341(1995)；martin等，human gene therapy methods 24:253
–
269(2013)；thorne等，human gene therapy 20:707
–
714(2009)；fraser wright,human gene therapy20:698
–
706(2009)；和virag等，human gene therapy 20:807
–
817(2009)。
[0231]
vii.raav颗粒的纯化
[0232]
在本发明的某些实施方式中，在将宿主细胞与包含本文描述的化合物(例如式(i)、(i-a)、(i-b)、(ii)、(iii)或(iv)的化合物或b族维生素(例如维生素b2、维生素b7、维生素b9和维生素b
12
))或其盐的溶液接触后，从所述宿主细胞收获和/或纯化raav颗粒。raav颗粒可以通过裂解所述宿主细胞获得。宿主细胞的裂解可以通过对所述细胞进行化学或酶法处理以便释放出感染病毒颗粒的方法来实现。这些方法包括使用核酸酶例如全能核酸酶(又称广谱核酸酶)或dna酶、蛋白酶例如胰蛋白酶或去污剂或表面活性剂。也可以使用物理破坏，例如均质化或研磨或通过微流化器压力元件施加压力或冻融循环。或者，可以从宿主细胞收集上清液而不需细胞裂解。当在本文中使用时，“总raav”是指由宿主细胞产生的总raav，“分泌raav”是指可以不需细胞裂解而从宿主细胞收获的raav。
[0233]
在收获raav颗粒后，可能需要纯化含有raav的样品以例如除去由细胞裂解产生的细胞碎片。aav颗粒的最低限度纯化方法在本领域中是已知的。两种示例性的纯化方法是基于氯化铯(cscl)和碘克沙醇的密度梯度纯化。两种方法均描述在strobel等，human gene therapy methods.,26(4):147
–
157(2015)中。也可以使用亲和层析实现最低限度的纯化，使用例如avb sepharose亲和树脂(ge healthcare bio-sciences ab,uppsala,sweden)来实现。使用avb sepharose亲和树脂纯化aav的方法描述在例如wang等，mol ther methods clin dev.,2:15040(2015)中。在纯化后，可以将raav颗粒过滤并储存在≤-60℃下。
[0234]
viii.raav颗粒的定量
[0235]
aav感染在体外不会导致细胞病变效应，因此不能使用噬斑测定法来确定感染滴度，这一事实使raav颗粒的定量变得复杂。然而，raav颗粒可以使用多种方法来定量，包括实时荧光定量pcr(qpcr)(clark等，hum.gene ther.10,1031
–
1039(1999))或斑点印迹杂交(samulski等，j.virol.63,3822
–
3828(1989))或通过高度纯化的载体制备物的光密度(sommer等，mol.ther.7,122
–
128(2003))。dna酶抗性颗粒(drp)可以通过实时荧光定量pcr(qpcr)(drp-qpcr)，在热循环仪(例如icycler iq 96孔区块格式热循环仪(bio-rad,hercules,ca))中进行定量。将含有raav颗粒的样品在dna酶i(100u/ml；promega,madison,wi)存在下，在37℃温育60min，然后用蛋白酶k(invitrogen,carlsbad,ca)在50℃消化(10u/ml)60min，然后在95℃变性30min。使用的引物-探针套装应该对raav载体基因组的非天然部分具有特异性，例如感兴趣的蛋白质的poly(a)序列。pcr产物可以在引物、探针和扩增序列的长度和组成，使用任何适合的循环参数组来扩增。替代方案公开在例如lock等，human gene therapy methods 25(2):115
–
125(2014)中。
[0236]
在整个描述中，在装置、设备和系统被描述为具有、包括或包含特定组件的情况下，或者在过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤的情况下，预期本发明的装置、设备和系统基本上由所叙述的组件组成或由所叙述的组件组成，并且本发明的过程和方法基本上由所叙述的处理步骤组成或由所叙述的处理步骤组成。
[0237]
本发明的实践将从下面的实施例中得到更充分的理解，在本文中呈现这些实施例仅仅是出于说明的目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明。
实施例
[0238]
实施例1：不同浓度的烟酰胺对hela细胞生产raav的影响
[0239]
在本实施例中，在不同hela生产细胞系中测试了范围为0.1mm至40mm的不同浓度
的烟酰胺对raav生产的影响。所述实验在工作体积为3ml的24孔深孔板培养系统中运行，在细胞培养生产培养基中的接种密度为0.2x 106细胞，ad5感染复数(moi)为200vp/细胞。图1示出了在不同烟酰胺浓度(0.1mm
–
40mm)下从hela生产细胞产生的不同进化枝e和f raav的归一化体积raav滴度的概述图。从0.1mm至10mm观察到raav滴度的提高，并且在1mm至10mm之间观察到最显著的提高。包括在这个分析中的衣壳血清型是aav8、aav9、rh10和hu37。
[0240]
图2示出了每种不同烟酰胺浓度下的归一化体积raav滴度(gc/ml)以及当使用数据点的三阶多项式拟合时的预测最大值的图。在1mm至10mm之间观察到raav滴度的显著提高，预测最大值在5mm处。
[0241]
实施例2：容器规模对raav生产的影响
[0242]
在本实施例中，使用两种常用容器(3ml深孔(“24-dw”)和100ml摇瓶(“烧瓶”)测试了在烟酰胺存在下容器规模对raav生产的影响。分析使用能够产生编码因子ix转基因的进化枝e raav(aavrh10-fix)的hela生产细胞系来进行。图3描绘的柱形图示出了在不同规模下，不同烟酰胺浓度下的raav滴度(gc/ml)。双因素方差分析观察了烟酰胺，规模以及它们之间的交互作用，显示只有烟酰胺的影响具有统计学意义(p《0.0001)。规模和相互作用因子是不显著的(分别为p＝0.3915和p＝0.1353)。进行了dunnett’s检验，其在将作为因子的规模移除后在所有浓度下显示出显著性。
[0243]
实施例3：烟酰胺对进化枝e hela克隆的raav生产的影响
[0244]
使用实施例1中描述的条件测试了4个不同的hela克隆。图4a-d分别示出了不同烟酰胺浓度下的raav滴度(gc/ml)，分别用于克隆1(aavrh10-fix)后续上清液、克隆2(aav8-g6pase)上清液、克隆3(aav8-g6pase)大范围无补充液和克隆4(aavhu37-fviii)大范围无补充悬浮液(即triton裂解样品)。当添加1mm至5mm之间的烟酰胺时，在所有四个克隆中显示了滴度提高。
[0245]
实施例4：烟酰胺对进化枝f hela克隆的raav生产的影响
[0246]
在本实施例中，在2l生物反应器中研究了3mm烟酰胺对表达编码截短的atp7b转基因的重组进化枝f aav(aav9-atp7b)的两个hela生产细胞系克隆的影响。如图5中所示，通过向生物反应器添加3mm烟酰胺，对于两个克隆均观察到显著的滴度提高。
[0247]
实施例5：不同浓度的烟酰胺对hek293细胞的raav生产的影响
[0248]
在本实施例中，使用hek293细胞测试了0.03mm至30mm范围内不同浓度的烟酰胺对raav生产的影响。实验在30ml摇瓶中，使用1.3
×
106至2.0
×
106个细胞/ml的转染密度来运行。在本实验中使用的hek293细胞用能够产生编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶的raav8(raav8-otc)的质粒转染。如图6中所示，使用hek293细胞，在添加0.3mm和3mm烟酰胺时观察到滴度的提高。在2l生物反应器规模下重复的运行显示出hek293细胞在添加烟酰胺时滴度提高(数据未示出)。
[0249]
实施例6：其他化合物对hek293细胞的raav生产的影响
[0250]
在本实施例中，在hek293细胞中研究了烟酰胺之外的化合物对raav生产的影响。在本实施例中分析的化合物包括烟酸、烟酸甲酯、肌醇、泛酸、吡哆醇、胆碱、硫胺素、葡萄糖胺、咖啡因、n-乙酰葡萄糖胺和胸苷。
[0251]
实验在24孔深孔板中，使用与实施例5中所述相同的细胞，在相似的转染和培养条件下运行。测试的每种化合物的浓度是1mm、3mm和9mm。在所述测试的化合物中，1mm烟酸提
高了20％的滴度，3mm烟酸甲酯提高了42％的滴度，3mm和9mm的肌醇提高了大约20％的滴度，而3mm胆碱提高了65％的滴度。测试的其他化合物在所测试的三种浓度中的任一浓度下均未对raav滴度提供显著益处。
[0252]
本实施例显示包括烟酸、烟酸甲酯、肌醇和胆碱在内的替代化合物可以提高raav滴度，尽管所述化合物均未提供由烟酰胺所提供的益处水平，所述烟酰胺似乎显著且令人吃惊地优于所研究的其他11种化合物。
[0253]
编号实施方式
[0254]
本文公开的实施方式包括在本公开的编号实施方式中所提供的实施方式p1至p68。
[0255]
实施方式p1：一种生产重组腺相关病毒(raav)的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含式(i)的化合物或其盐的溶液接触：
[0256]
其中：
[0257]
表示单键或双键；
[0258]
n是选自1至5的整数；
[0259]
r1选自由-oh、c
1-6
烷基、c
1-6
烷基-oh、c
1-6
烷基-o-c
1-6
烷基、-o-c
1-6
烷基、-c(o)n(ra)2和-c(o)orb组成的组；
[0260]
ra在每次出现时独立地是氢或c
1-6
烷基；
[0261]
rb在每次出现时独立地是氢或c
1-6
烷基；
[0262]
x是crcrd或n；
[0263]
rc和rd在每次出现时独立地选自由氢、c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基组成的组，其中当rc是氢时，rd选自c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基，当rc选自c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基时，rd是氢；并且
[0264]
其中所述化合物不是：
[0265]
或其盐。
[0266]
实施方式p2：一种提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含式(i)的化合物或其盐的溶液接触：
[0267]
其中：
[0268]
表示单键或双键；
[0269]
n是选自1至5的整数；
[0270]
r1选自由-oh、c
1-6
烷基、c
1-6
烷基-oh、c
1-6
烷基-o-c
1-6
烷基、-o-c
1-6
烷基、-c(o)n(ra)2和-c(o)orb组成的组；
[0271]
ra在每次出现时独立地是氢或c
1-6
烷基；
[0272]
rb在每次出现时独立地是氢或c
1-6
烷基；
[0273]
x是crcrd或n；
[0274]
rc和rd在每次出现时独立地选自由氢、c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基组成的组，其中当rc是氢时，rd选自c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基，当rc选自c
1-6
烷基、-oh和-o-c
1-6
烷基时，rd是氢；并且
[0275]
其中所述化合物不是：
[0276]
或其盐。
[0277]
实施方式p3：实施方式p1或p2所述的方法，其中x是n。
[0278]
实施方式p4：实施方式p1-p3中的任一项所述的方法，其中n是1。
[0279]
实施方式p5：实施方式p1-p4中的任一项所述的方法，其中r1选自由c
1-6
烷基-oh、-c(o)n(ra)2和-c(o)orb组成的组。
[0280]
实施方式p6：实施方式p1-p5中的任一项所述的方法，其中r1选自由ch2oh、-c(o)nh2、-c(o)oh和-c(o)och3组成的组。
[0281]
实施方式p7：实施方式p1或p2所述的方法，其中x是crcrd。
[0282]
实施方式p8：实施方式p1、p2和p7中的任一项所述的方法，其中rc是氢，并且rd是-oh。
[0283]
实施方式p9：实施方式p1、p2和p7-p8中的任一项所述的方法，其中n是5。
[0284]
实施方式p10：实施方式p1、p2和p7-p9中的任一项所述的方法，其中r1是-oh。
[0285]
实施方式p11：实施方式p1或p2所述的方法，其中所述化合物是式(i-a)的化合物或其盐：
[0286]
其中：
[0287]
r2和r3在每次出现时独立地是氢或-oh，
[0288]
或者r2和r3可以合在一起形成羰基；
[0289]
r4选自由氢、-oh、-o-c
1-6
烷基和-n(re)2组成的组；并且
[0290]
re在每次出现时独立地是氢或c
1-6
烷基。
[0291]
实施方式p12：实施方式p11所述的方法，其中r2和r3合在一起形成羰基。
[0292]
实施方式p13：实施方式p11或p12所述的方法，其中r4选自由-nh2、-oh和-och3组成的组。
[0293]
实施方式p14：实施方式p11所述的方法，其中r2和r3两者都是氢。
[0294]
实施方式p15：实施方式p11或p14所述的方法，其中r4是-oh。
[0295]
实施方式p16：实施方式p1、p2和p11中的任一项所述的方法，其中所述化合物选自下述化合物组成的组：
[0296][0297]
实施方式p17：实施方式p1或p2所述的方法，其中所述混合物是式(i-b)的化合物或其盐：
[0298]
其中：
[0299]
x是crcrd；并且
[0300]r5a
、r
5b
、r
5c
、r
5d
和r
5e
在每次出现时独立地是-oh、-o-c
1-6
烷基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷基-oh和c
1-6
烷基-o-c
1-6
烷基，
[0301]
其中rc和rd如实施方式p1中所定义。
[0302]
实施方式p18：实施方式p17所述的方法，其中rc是氢，并且rd是-oh。
[0303]
实施方式p19：实施方式p17或p18所述的方法，其中r
5a
、r
5b
、r
5c
、r
5d
和r
5e
是-oh。
[0304]
实施方式p20：实施方式p17-p19中的任一项所述的方法，其中所述化合物是
[0305][0306]
实施方式p21：一种生产raav的方法，所述方法包括将宿主细胞与式(ii)的化合物或其盐的溶液接触：
[0307]
其中：
[0308]
r6和r7在每次出现时独立地选自由氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基组成的组；
[0309]
r8和r9在每次出现时独立地选自由氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基组成的组；
[0310]
y是c或n；
[0311]r10
和r
11
在每次出现时独立地选自由氢、-oh和c
1-6
烷基组成的组；
[0312]
a选自由氢、c
1-6
烷基和-c(o)n(rf)2组成的组；并且
[0313]
rf在每次出现时独立地选自由氢、c
1-6
烷基、c
1-6
烷基-c(o)oh和c
1-6
烷基-oh组成的组；
[0314]
其中所述化合物不是：
[0315][0316]
实施方式p22：一种提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含式(ii)的化合物或其盐的溶液接触：
[0317]
其中：
[0318]
r6和r7在每次出现时独立地选自由氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基组成的组；
[0319]
r8和r9在每次出现时独立地选自由氢、-oh、-cn、卤素和c
1-6
烷基组成的组；
[0320]
y是c或n；
[0321]r10
和r
11
在每次出现时独立地选自由氢、-oh和c
1-6
烷基组成的组；
[0322]
a选自由氢、c
1-6
烷基和-c(o)n(rf)2组成的组；并且
[0323]
rf在每次出现时独立地选自由氢、c
1-6
烷基、c
1-6
烷基-c(o)oh和c
1-6
烷基-oh组成的组；
[0324]
其中所述化合物不是：
[0325][0326]
实施方式p23：实施方式p21或p22所述的方法，其中r6和r7是氢。
[0327]
实施方式p24：实施方式p21-p23中的任一项所述的方法，其中r8和r9是氢。
[0328]
实施方式p25：实施方式p21-p24中的任一项所述的方法，其中y是n。
[0329]
实施方式p26：实施方式p21-p25中的任一项所述的方法，其中r
10
和r
11
是ch3。
[0330]
实施方式p27：实施方式p21-p26中的任一项所述的方法，其中a是ch3。
[0331]
实施方式p28：实施方式p21-p27中的任一项所述的方法，其中所述化合物是
[0332]
实施方式p29：一种生产raav或提高raav滴度产率的方法，所述方法包括将宿主细胞与包含选自由维生素b2、维生素b7、维生素b9和维生素b
12
组成的组的b族维生素的溶液接触。
[0333]
实施方式p30：实施方式p1-p29中的任一项所述的方法，其中所述化合物在所述溶液中的终浓度大于0.5mm。
[0334]
实施方式p31：实施方式p1-p29中的任一项所述的方法，其中所述化合物在所述溶液中的终浓度大于或等于0.5mm。
[0335]
实施方式p32：实施方式p1-p29中的任一项所述的方法，其中所述化合物在所述溶液中的终浓度在0.5mm至10mm之间。
[0336]
实施方式p33：实施方式p1-p29中的任一项所述的方法，其中所述化合物在所述溶液中的终浓度在1mm至10mm之间。
[0337]
实施方式p34：实施方式p1-p33中的任一项所述的方法，其中与未与包含所述化合物的溶液接触的宿主细胞所产生的分泌raav量相比，所述化合物在所述溶液中的终浓度足以产生至少1.2倍高的分泌raav量。
[0338]
实施方式p35：实施方式p1-p33中的任一项所述的方法，其中与未与包含所述化合物的溶液接触的宿主细胞所产生的总raav量相比，所述化合物在所述溶液中的终浓度足以产生至少1.2倍高的总raav量。
[0339]
实施方式p36：实施方式p1-p33中的任一项所述的方法，其中与未与包含所述化合物的溶液接触的宿主细胞所产生的分泌raav量相比，所述化合物在所述溶液中的终浓度足以产生1.2至2.5倍高的分泌raav量。
[0340]
实施方式p37：实施方式p1-p33中的任一项所述的方法，其中与未与包含所述化合物的溶液接触的宿主细胞所产生的总raav量相比，所述化合物在所述溶液中的终浓度足以产生1.2至2.5倍高的总raav。
[0341]
实施方式p38：实施方式p1-p37中的任一项所述的方法，其中将所述宿主细胞与包含所述化合物的溶液接触至少2天。
[0342]
实施方式p39：实施方式p1-p38中的任一项所述的方法，其还包括收获和纯化所述raav的步骤。
[0343]
实施方式p40：实施方式p1-p39中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
[0344]
实施方式p41：实施方式p40所述的方法，其中所述宿主细胞选自由hela、hek293、cos、a549、bhk和vero细胞组成的组。
[0345]
实施方式p42：实施方式p41所述的方法，其中所述宿主细胞是hela细胞。
[0346]
实施方式p43：实施方式p41所述的方法，其中所述宿主细胞是hek293细胞。
[0347]
实施方式p44：实施方式p1-p39中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是昆虫细胞。
[0348]
实施方式p45：实施方式p44所述的方法，其中所述宿主细胞选自由sf9、sf-21、tn-368和bti-tn-5b1-4(high-five)细胞组成的组。
[0349]
实施方式p46：实施方式p1-p45中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞包含侧翼带有aav反向末端重复序列的异源核苷酸序列。
[0350]
实施方式p47：实施方式p1-p46中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞包含rep和cap基因。
[0351]
实施方式p48：实施方式p1-p47中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞包含辅助病毒基因。
[0352]
实施方式p49：实施方式p1-p48中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞包含侧翼带有aav反向末端重复序列的异源核苷酸序列、rep和cap基因和辅助病毒基因。
[0353]
实施方式p50：实施方式p1-p49中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞与未与包含所述化合物的溶液接触的宿主细胞相比所产生的分泌raav的量至少高1.2倍。
[0354]
实施方式p51：实施方式p1-p49中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞与未与包含所述化合物的溶液接触的宿主细胞相比所产生的总raav的量至少高1.2倍。
[0355]
实施方式p52：实施方式p1-p49中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞与未与
包含所述化合物的溶液接触的宿主细胞相比所产生的分泌raav的量高1.2至2.5倍。
[0356]
实施方式p53：实施方式p1-p49中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞与未与包含所述化合物的溶液接触的宿主细胞相比所产生的总raav的量高1.2至2.5倍。
[0357]
实施方式p54：实施方式p1-p53中的任一项所述的方法，其中所述溶液包含细胞培养基。
[0358]
实施方式p55：实施方式p1-p53中的任一项所述的方法，其中所述溶液包含生产培养基。
[0359]
实施方式p56：实施方式p1-p55中的任一项所述的方法，其包括将所述宿主细胞进行悬浮培养。
[0360]
实施方式p57：实施方式p1-p55中的任一项所述的方法，其包括将所述宿主细胞进行贴壁培养。
[0361]
实施方式p58：实施方式p1-p56中的任一项所述的方法，其包括将所述宿主细胞在1l生物反应器中培养。
[0362]
实施方式p59：实施方式p1-p56中的任一项所述的方法，其包括将所述宿主细胞在2l生物反应器中培养。
[0363]
实施方式p60：实施方式p1-56中的任一项所述的方法，其包括将所述宿主细胞在3l生物反应器中培养。
[0364]
实施方式p61：实施方式p1-p56中的任一项所述的方法，其包括将所述宿主细胞在250l生物反应器中培养。
[0365]
实施方式p62：实施方式p1-p56中的任一项所述的方法，其包括将所述宿主细胞在500l生物反应器中培养。
[0366]
实施方式p63：实施方式p1-p56中的任一项所述的方法，其包括将所述宿主细胞在2,000l生物反应器中培养。
[0367]
实施方式p64：一种组合物，其包含宿主细胞和式(i)的化合物或其盐。
[0368]
实施方式p65：一种组合物，其包含宿主细胞和式(i-a)的化合物或其盐。
[0369]
实施方式p66：一种组合物，其包含宿主细胞和式(i-b)的化合物或其盐。
[0370]
实施方式p67：一种组合物，其包含宿主细胞和式(ii)的化合物或其盐。
[0371]
实施方式p68：一种组合物，其包含宿主细胞和选自由维生素b2、维生素b7、维生素b9和维生素b
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组成的组的b族维生素。
[0372]
通过引用并入
[0373]
本文中引用的每个专利和科学文献的全部公开内容通过引用并入本文用于所有目的。
[0374]
等同性
[0375]
在不背离本发明的精神或本质特征的情况下，本发明可以以其他特定形式体现。因此，上述实施方式在所有情况下都应被认为是说明性的，而不是对本文描述的发明的限制。因此，本发明的范围由所附的权利要求书而不是前面的描述来指示，并且意在将落入权利要求书的含义和等同性范围之内的所有变化涵盖在其中。