用于病毒转导的半自动中空纤维系统的制作方法

用于病毒转导的半自动中空纤维系统
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)要求于2020年6月10日提交的美国临时申请63/037,377的优先权。该在先申请的公开内容被认为是该申请的公开内容的一部分，并且通过引用将其全部内容结合于此。
技术领域
3.本公开涉及使用中空纤维过滤器模块进行病毒转导的半自动方法和系统。


背景技术：

4.细胞疗法利用自然转导过程，使用经过安全性和功能性修饰的病毒颗粒作为递送媒介物(载体)将治疗性基因引入患者细胞中。病毒载体转导是目前细胞疗法制造中用于引入治疗性遗传物质的最常用方法。
5.目前的制造转导工艺是劳动密集型的并且在病毒载体的使用中效率低下，从而导致细胞疗法的制造成本高并且产生这些疗法所需要的时间延长。因此，现有技术在制造转导过程中存在显著的局限性。


技术实现要素：

6.本公开的一个方面提供了一种用于将载体导入细胞中的系统。所述系统包括限定毛细管内空间和通过多孔膜与所述毛细管内空间隔开的毛细管外空间的过滤器模块。所述系统还包括一对毛细管内端口，其流体联接到所述毛细管内空间的相对端部并且各自接收转导介质、细胞和载体。所述系统还包括一对毛细管外端口，其联接到所述毛细管外空间的相对端部并与毛细管外介质源和废物容器流体连通。
7.本公开的该方面可包括以下任选特征中的一个或多个。在一些实例中，所述系统包括与所述毛细管内端口中的至少一者流体连通的收获容器。在一些实施方式中，所述系统包括毛细管内泵，其可操作以向所述毛细管内端口中的至少一者提供所述转导介质、所述细胞和所述载体中的每一者的流。任选地，所述毛细管内泵可在第一状态下操作以在第一时间段期间向所述毛细管内端口提供所述细胞和所述载体，并且可在第二状态下操作以在第二时间段期间向所述毛细管内端口提供所述转导介质。
8.在一些实例中，所述系统包括通过所述毛细管外端口中的至少一者与所述毛细管外空间连通的废物容器。在一些实施方式中，所述系统包括可操作以向所述毛细管外端口中的每一者提供所述毛细管外介质流的毛细管外泵。在一些构型中，系统包括可操作以提供从所述毛细管外端口到所述废物容器的废物流体流的毛细管外泵。
9.在一些实施方式中，多孔膜是圆柱形的。在一些实例中，多孔膜包括孔，所述孔允许尺寸小于约50kda的颗粒从所述毛细管内空间穿过所述孔。在一些构型中，毛细管内空间限定转导区。
10.本公开的另一方面提供了一种用于将病毒或非病毒载体引入细胞中的系统。所述
系统包括限定从第一端部延伸至第二端部的毛细管内空间的中空纤维。所述系统还包括外壳，其封闭一根或多根中空纤维以在所述中空纤维和所述外壳之间从所述第一端部到所述第二端部限定毛细管外空间，所述外壳包括与邻近所述第一端部的所述毛细管内空间流体连通的第一端口和与邻近所述第二端部的所述毛细管内空间流体连通的第二端口。所述系统还包括转导介质源，其通过所述第一端口和所述第二端口中的每一者与所述毛细管内空间流体连通。所述系统还包括细胞源，其包括细胞并通过所述第一端口和所述第二端口中的每一者与所述毛细管内空间流体连通。所述系统还包括病毒源，其包括病毒或非病毒载体并通过所述第一端口和所述第二端口中的每一者与所述毛细管内空间流体连通。
11.本公开的该方面可包括以下任选特征中的一个或多个。在一些实例中，所述系统包括通过所述第一端口和所述第二端口中的至少一者与所述毛细管内空间流体连通的收获容器。在一些实施方式中，所述系统包括毛细管内泵，所述毛细管内泵包括与所述转导介质源、所述细胞源和所述病毒源中的每一者流体连通的入口。在一些实例中，所述毛细管内泵包括通过所述第一端口与所述毛细管内空间流体连通的第一出口和通过所述第二端口与所述毛细管内空间流体连通的第二出口。
12.在一些构型中，外壳包括与毛细管外空间连通的第三端口，并且系统还包括通过第三端口与毛细管外空间连通的废物容器。在一些实例中，所述系统包括通过所述第三端口与所述毛细管外空间流体连通的毛细管外介质源。在一些构型中，所述第三端口邻近所述毛细管内空间的所述第一端部安置，并且所述系统还包括与所述毛细管外空间流体连通并且邻近所述毛细管内空间的所述第二端部安置的第四端口。在一些实例中，所述废物容器和所述毛细管外介质源中的每一者通过所述第三端口和所述第四端口中的每一个与所述毛细管外空间连通。
13.在一些构型中，中空纤维包括多根中空纤维。在一些实施方式中，中空纤维包括孔，所述孔允许尺寸小于约50kda的颗粒从所述毛细管内空间穿过所述孔。
14.本公开的又一方面提供了一种使用中空纤维将病毒或非病毒载体引入细胞中的方法，所述中空纤维限定从第一端部延伸至第二端部的毛细管内空间和从所述第一端部至所述第二端部围绕所述毛细管内空间的毛细管外空间。所述方法包括将病毒或非病毒载体装载到所述中空纤维的所述毛细管内空间中以及将细胞装载到所述中空纤维的所述毛细管内空间中。
15.本公开的该方面可包括以下任选特征中的一个或多个。在一些实例中，将所述病毒或非病毒载体装载到所述毛细管内空间中包括从所述毛细管内空间的所述第一端部和所述第二端部中的至少一者装载所述病毒或非病毒载体。在一些实施方式中，将所述病毒或非病毒载体装载到所述毛细管内空间中包括从所述毛细管内空间的所述第一端部和所述第二端部中的每一者装载所述病毒或非病毒载体。在一些构型中，将所述细胞装载到所述毛细管内空间中包括从所述毛细管内空间的所述第一端部和所述第二端部中的至少一者装载所述细胞。
16.在一些实例中，将所述细胞装载到所述毛细管内空间中包括从所述毛细管内空间的所述第一端部和所述第二端部中的每一者装载所述细胞。任选地，所述方法还可包括转导所述中空纤维的所述毛细管内空间内的细胞以及从所述中空纤维的所述毛细管内空间收获所转导的细胞。在一些实例中，从所述毛细管内空间收获所转导的细胞包括将冲洗流
体装载到所述中空纤维的所述毛细管外空间中。在一些实施方式中，从所述毛细管内空间收获所转导的细胞包括从所述第一端部或所述第二端部中的一者将冲洗流体装载到所述毛细管内空间中。
17.在一些实例中，该方法包括从毛细管外空间收集废物。在一些实施方式中，细胞和病毒或非病毒载体被同时装载。在一些构型中，细胞和病毒或非病毒载体被单独装载。在一些实施方式中，在病毒或非病毒载体之前装载细胞。在一些构型中，在细胞之前装载病毒或非病毒载体。
18.在一些实例中，以1
×
103至1
×
1010个细胞/ml范围内的浓度装载细胞。在一些实施方式中，装载所述细胞包括以作为所述中空纤维的内表面积的尺寸的函数的速率装载细胞。在一些构型中，病毒或非病毒载体作为病毒颗粒装载。在一些实例中，病毒或非病毒载体作为核酸载体装载。
19.在一些实例中，所述方法包括以约5-100μl/min/cm2的所述中空纤维的每平方厘米内表面面积的流速装载所述细胞和所述病毒或非病毒载体。在一些实例中，在所述中空纤维的每平方厘内表面面积的流速下的装载以约5-20μl/min/cm2进行。在一些实施方式中，载体来源于慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或杂合病毒。在一些实例中，载体是逆转录病毒。在一些实施方式中，载体是慢病毒。在一些实例中，载体包括纳米颗粒、脂质体、脂质颗粒、碳、非活性金属、明胶和/或多胺纳米球。
20.在一些实施方式中，将所述细胞和病毒载体以约0.25至约4.0范围内的感染复数(moi)装载到所述毛细血管内空间中。在一些实例中，将所述细胞和病毒载体以约2.5的moi装载到所述毛细管内空间中。在一些构型中，细胞是b细胞、t细胞、nk细胞、单核细胞、祖细胞或细胞系。
21.本公开的另一方面提供了通过根据前述段落所述的方法产生的细胞群。本公开的另一方面提供了一种药物组合物，其包含通过根据前述段落所述的方法产生的细胞。
22.本公开的另一方面提供了一种制造包含一种或多种转导的细胞的细胞治疗产品的方法。所述方法包括(i)提供用于转导细胞的系统，所述系统包括限定从第一端部延伸至第二端部的毛细管内空间的中空纤维，(ii)将细胞群和病毒或非病毒载体装载到所述毛细血管内空间中，导致所述毛细血管内空间中一种或多种细胞的转导，(iii)从所述毛细管内空间收获包含一种或多种转导的细胞的细胞群。
23.本公开的该方面可包括以下任选特征中的一个或多个。在一些实施方式中，所述细胞群选自αβt细胞、γδt细胞、nk细胞、hsc、巨噬细胞、树突细胞和ipsc。在一些构型中，病毒或非病毒载体包括重组受体。在一些构型中，重组受体是嵌合抗原受体(car)。
24.在一些实例中，转导的细胞包含细胞表面上的重组受体。在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包括靶向肿瘤抗原的细胞外配体结合结构域，所述肿瘤抗原选自cd44、cd19、cd20、cd22、cd23、cd30、cd89、cd123、cs-1、ror1、间皮素、c-met、psma、her2、gd-2、cea、mage a3 tcr、egfr、her2/erbb2/neu、epcam、epha2、cea和bcma中的一者或多者。
25.在一些构型中，所述方法包括分离所转导的细胞的步骤。在一些构型中，所述方法还包括在生物反应器中扩增所收获的细胞的步骤。在一些实施方式中，所述方法还包括在合适的冷冻保存介质中冷冻保存所收获的细胞的步骤。在一些实施方式中，所述系统包括与邻近所述第一端部的所述毛细管内空间流体连通的第一端口和与邻近所述第二端部的
所述毛细管内空间流体连通的第二端口。
26.在一些实例中，将所述病毒或非病毒载体装载到所述毛细管内空间中包括从所述毛细管内空间的所述第一端部和所述第二端部中的至少一者装载所述病毒或非病毒载体。在一些实施方式中，将所述病毒或非病毒载体装载到所述毛细管内空间中包括从所述毛细管内空间的所述第一端部和所述第二端部中的每一者装载所述病毒或非病毒载体。在一些构型中，将所述细胞装载到所述毛细管内空间中包括从所述毛细管内空间的所述第一端部和所述第二端部中的至少一者装载所述细胞。在一些实施方式中，将所述细胞装载到所述毛细管内空间中包括从所述毛细管内空间的所述第一端部和所述第二端部中的每一者装载所述细胞。
27.本公开的各个方面在以下部分中详细描述。部分的使用并不意味着限制本公开。每个部分可适用于本公开的任何方面。在本技术中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物，除非上下文另有明确说明。
附图说明
28.[图1a]图1a示出了包括根据本公开的中空纤维的中空纤维系统。
[0029]
[图1b]图1b示出了沿图1a的线1b-1b截取的中空纤维的水平横截面，其中中空纤维装载有细胞和病毒或非病毒载体。
[0030]
[图1c]图1c示出了沿图1a的线1c-1c截取的中空纤维的垂直横截面，其中中空纤维装载有细胞和病毒或非病毒载体。
[0031]
[图1d]图1d是包括根据本公开的多根中空纤维的中空纤维过滤器模块的实例的示意图。
[0032]
[图2a]图2a示出了包括中空纤维的中空纤维系统，其显示了细胞和病毒载体装载期间的流体流动方向。
[0033]
[图2b]图2b示出了中空纤维的水平横截面，其显示了细胞和病毒或非病毒载体装载期间的流体流动方向。
[0034]
[图2c]图2c示出了中空纤维的垂直横截面，其显示了细胞和病毒或非病毒载体装载期间的流体流动方向。
[0035]
[图3a]图3a示出了包括中空纤维的中空纤维系统，其显示了在将病毒或非病毒载体引入靶细胞或宿主细胞期间的流体流动方向。
[0036]
[图3b]图3b示出了中空纤维的水平横截面，其显示了在将病毒或非病毒载体引入靶细胞或宿主细胞期间的流体流动方向。
[0037]
[图3c]图3c示出了中空纤维的垂直横截面，其显示了在将病毒或非病毒载体引入靶细胞或宿主细胞期间的流体流动方向。
[0038]
[图4a]图4a示出了包括中空纤维的中空纤维系统，其显示了细胞收获期间的流体流动方向。
[0039]
[图4b]图4b示出了具有细胞和病毒的中空纤维的水平横截面，其显示了细胞收获期间的流体流动方向。
[0040]
[图4c]图4c示出了中空纤维的垂直横截面，其显示了细胞收获期间的流体流动方
向。
[0041]
[图5]图5示出了在不同转导条件下的逆转录病毒转导的t细胞。
[0042]
[图6]图6示出了t细胞在不同条件下转导后的生存力。
[0043]
[图7]图7示出了在不同转导条件下的逆转录病毒转导的nk细胞。
[0044]
[图8]图8示出了在不同转导条件下的慢病毒转导的t细胞。
[0045]
[图9]图9示出了用于细胞治疗转导的半自动中空纤维系统的技术布局。
具体实施方式
[0046]
现有技术水平
[0047]
转导是病毒感染靶细胞或宿主细胞的过程。病毒天然地经历转导过程，并且已经进化到非常有效地将遗传物质引入靶细胞中。为了发生转导，病毒颗粒必须与其靶细胞物理接触，以首先结合、进入并最终将遗传物质引入靶细胞中。通过特异性蛋白质-蛋白质相互作用发生结合，与病毒和靶细胞都需要的正确蛋白质结合。
[0048]
细胞疗法利用自然转导过程，使用经过安全性和功能性修饰的病毒颗粒作为递送媒介物(载体)将治疗性基因引入患者细胞中。病毒载体转导是目前细胞疗法制造中用于将治疗性遗传物质引入细胞的最常用方法。
[0049]
病毒转导的当前工业方法包括静态转导系统、使用化学增强剂以及旋转接种(spinoculation)。下面进一步描述这些当前工业方法中的每一种。
[0050]
静态条件下的病毒转导是目前进行病毒转导的最普遍方式。在标准静态转导方法下，大多数转导在静态培养条件下在标准培养瓶或袋中进行。以这种方式，病毒载体悬浮在比单细胞直径深约100-1000倍的培养基中。使用标准静态方法进行转导面临着各种问题，从而导致细胞转导效率低下。例如，使用静态方法导致存在保留悬浮液中并且不能到达靶细胞的小载体颗粒。这至少部分是由于大细胞迅速沉降到培养容器的底部而发生。使用静态培养方法进行转导的最终结果是只有一小部分载体颗粒能够仅通过扩散到达细胞。因此，转导效率低，并且病毒载体的量需要高以实现可观的细胞转导。这是因为病毒载体与靶细胞的结合是由受体/配体表达和物理接触决定的。因此，转导率与给定细胞的局部病毒浓度成比例。需要大量的病毒载体来实现令人满意的转导率可能是昂贵的，并且在整个细胞治疗制造过程中也产生低效率。
[0051]
细胞转导的另一标准方法涉及使用化学增强剂，其进而提高载体与细胞的结合率。然而，使用依赖于化学增强剂的方法也是昂贵的，并且化学增强剂的去除在制造过程中产生了附加的障碍。
[0052]
细胞转导的另一标准方法是使用旋转接种。旋转接种是指细胞的离心接种。旋转接种减少细胞占据的体积。该技术已被证明具有各种消极方面，包括例如对细胞造成损伤、难以扩大规模，并且它通常对于小载体不太有效。
[0053]
用于增强病毒，特别是逆转录病毒的转导效率的另一种方法是通过使用与逆转录病毒结合的细胞粘附物质，诸如纤连蛋白或纤连蛋白片段ch-296[retronectin(已注册)(重组人纤连蛋白片段)或retronectin]。该方法需要将含有逆转录病毒载体的溶液添加到用retronectin涂覆的容器中，然后温育一段时间以仅允许病毒载体结合到retronectin，去除含有抗病毒感染的抑制物质的上清液，并且然后添加靶细胞。用retronectin涂覆容器
表面是繁琐的，并且使得该方法相当昂贵。此外，当需要将基因转移到大量细胞中时，该方法难以扩大规模。
[0054]
使用中空纤维系统的细胞转导
[0055]
本公开涉及使用中空纤维系统来转导细胞的高效方法，例如允许自动或半自动高效细胞转导的切向流体流动方法，所述细胞转导可应用于慢病毒、逆转录病毒和其他病毒和非病毒载体。本文所述的方法提供了一种绕过现有技术方法的局限性的中空纤维转导方法。
[0056]
图1a示出了中空纤维系统100，其包括集成在定制设计的基于泵/阀的结构中的一根或多根中空纤维。在本公开的一些实施方案中，中空纤维系统100包括毛细管内介质容器104、细胞容器108、病毒容器112、毛细管外介质容器116、废物容器120、收获容器124、毛细管内泵128、毛细管外泵132和包括一根或多根中空纤维136的过滤器模块134。如下文更详细描述的，过滤器模块134提供了用于将各种材料引入中空纤维系统100和逆转录病毒材料的方便手段。
[0057]
毛细管内介质容器104含有毛细管内介质或转导介质106，并通过转导介质导管140连接到毛细管内泵128。细胞容器108含有细胞110，并通过细胞导管144连接到毛细管内泵128。细胞可以包括b细胞、t细胞、nk(自然杀伤)细胞、单核细胞、其他淋巴细胞或祖细胞。
[0058]
病毒容器112含有病毒或载体颗粒114，并通过病毒导管148连接到毛细管内泵128。载体114可以包括病毒颗粒。在其他实例中，病毒可以包括核酸载体。在一些实例中，病毒来源于慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或杂合病毒。在一些实施方案中，病毒可以包括逆转录病毒或慢病毒。在一些实例中，使用非病毒载体代替病毒。此处，非病毒载体可以包括脂质体、脂质颗粒、碳、非活性金属、明胶、多胺纳米球和/或无机纳米颗粒。非病毒载体的附加实例包括，例如原生质球、红细胞影泡、胶态金属、无机纳米颗粒、deae葡聚糖质粒等，或其组合。在一些实施方案中，无机纳米颗粒是磷酸钙纳米颗粒。
[0059]
虽然本公开示出了分别通过导管140、144、148独立地连接到毛细管内泵128的所有三个容器104、108、112，但是容器104、108、112中的两个或更多个可以共享公共导管。例如，所有三个容器104、108、112可以通过单个导管连接到毛细管内泵128。在另一个实施方案中，细胞容器108和病毒容器112可以通过独立于转导介质导管140的公共导管连接到毛细管内泵128。
[0060]
毛细血管内泵128接收毛细管内介质106、细胞110和载体颗粒114中的一种或多种，并以所需速率将它们提供给过滤器模块134。在所示实例中，毛细管内泵128包括与过滤器模块134流体连通的第一出口152a和第二出口152b。第一出口152a通过第一毛细管内导管156a与过滤器模块134流体连接，并且第二出口152b通过第二毛细管内导管156b与过滤器模块134流体连接。如图所示，过滤器模块134通过设置在过滤器模块134的第一端部的第一毛细管内端口160a连接到第一毛细管内导管156a，并通过设置在过滤器模块134的相对的第二端部的第二毛细管内端口160b连接到第二毛细管内导管156b。毛细管内端口160a和160b可以包括可操作以选择性地调节流体/介质进入过滤器模块134的通道的阀。
[0061]
继续参考图1a，毛细管外介质容器116含有毛细管外或收获介质118，并且废物容器120被构造成接收来自过滤器模块134的流体废物122。毛细管外泵132被构造成在过滤器模块134与毛细管外介质容器116和废物容器120中的每一者之间提供流体流动。此处，毛细
管外泵132通过毛细管外介质导管176与毛细管外介质容器116连接，并通过废物导管180与废物容器120连接。毛细管外泵132包括两个或更多个泵端口172a、172b，所述泵端口各自经由相应的毛细管外端口164a、164b连接到过滤器模块134，所述毛细管外端口可以包括被构造成调节毛细管外介质118和废物122流入和流出过滤器模块134的阀。第一毛细管外端口164a通过第一毛细管外导管168a将过滤器模块134连接到毛细管外泵132的第一毛细管外泵端口172a。第二毛细管外端口164b通过第二毛细管外导管168b将过滤器模块134连接到毛细管外泵132的第二毛细管外泵端口172b。
[0062]
毛细管内泵128和毛细管外泵132中的每一者都可包括可操作以在各种容器104、108、112、116、120和过滤器模块134之间提供流体流动的任何类型的泵。虽然所示的实例示出了每个泵128、132实施为单个泵，但是系统100的其他实施方案可以包括多个毛细管内泵128和/或多个毛细管外泵132，每个泵可操作以向容器104、108、112、116、120中的一者或多者提供流体或从所述容器中的一者或多者提供流体。泵128、132可以实施为手动泵，诸如注射器，或者实施为动力泵，诸如计量泵。任选地，从容器104、108、112、116、120中的每一者到泵128、132中的每一者的流动可以通过在导管140、144、148、176、180或容器104、108、112、116、120中实施的一个或多个阀来调节。在其他实例中，每个导管140、144、148、176、180可以分立地连接到独立的泵128、132，由此来自每个容器104、108、112、116、120的流动直接由相应泵128、132的操作来调节。
[0063]
图1b示出了中空纤维136的简化实例的水平横截面。水平横截面是沿如图1a所示的线1b-1b截取的中空纤维136的横截面。中空纤维136可被封闭在外壳137内，并形成过滤器模块134的实例。如图所示，中空纤维136内的空间限定毛细管内空间138，并且中空纤维136外的空间限定毛细管外空间139。例如，毛细管外空间139是中空纤维136和外壳137之间的空间。虽然所示的实例示出了限定毛细管内空间138的单根中空纤维136，但是应当理解，可以有多个平行排列并共同限定毛细管内空间138的中空纤维136，诸如在图1d所示的实例中。过滤器模块134的一个实例是来自repligen等的microkros中空纤维。继续参考图1a，第一毛细管内端口和第二毛细管内端口160a、160b在中空纤维136的相对端部处与毛细管内空间138流体联接，而第一毛细管外端口和第二毛细管外端口164a、164b在外壳137的相对端部处与毛细管外空间139流体联接。
[0064]
图1c示出了本公开的中空纤维136的垂直横截面。垂直横截面是沿如图1a所示的线1c-1c截取的中空纤维136的横截面。垂直横截面还示出了设置在外壳137内的中空纤维136。中空纤维136包括具有多个孔的膜，所述孔限定毛细管内空间138和毛细管外空间139之间的过滤通道。如上所述和如图1d所示，多根中空纤维136可以在过滤器模块134中实现，其中所有的中空纤维136都容纳在外壳137内。此处，每根中空纤维136限定毛细管内空间138的离散部分。
[0065]
在一个实施方案中，中空纤维136是圆柱形的，并且具有500μm的直径。在一些实施方案中，中空纤维是圆柱形的。在一些实例中，中空纤维的直径大于约80μm、100μm、150μm、200μm。在一些实施方案中，中空纤维直径为约250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm或约1,000μm。
[0066]
在一些实施方案中，中空纤维136包括具有多种孔径的膜。在一个实施方案中，膜的孔径为750kd。在一些实例中，中空纤维136的膜的孔径可以在约50和100kda之间。在一些
实例中，中空纤维136的膜的孔径大于约50kda。在一些实施方案中，中空纤维136的膜的孔径为约100kda至约200kda。在一些实例中，中空纤维136的膜的孔径为约300kda、400kda、500kda、30nm、40nm、50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm或1μm。
[0067]
在一些实施方案中，中空纤维膜包括聚砜(ps)、改性聚醚砜(mpes)、混合纤维素酯(me)、聚醚砜(pes)或其混合物。在一些实例中，中空纤维膜包括陶瓷、金属或其混合物。任选地，中空纤维膜不包括retronectin、纤连蛋白和/或聚凝胺(即，不含retronectin、纤连蛋白和/或聚凝胺)。在一些实施方案中，可通过用化合物涂覆中空纤维136的膜来增强将载体114引入细胞110中。在一些实施方案中，中空纤维136涂覆有retronectin。在一些实施方式中，中空纤维136涂覆有纤连蛋白。在一些构型中，中空纤维136的膜涂覆有聚凝胺。在一些实例中，中空纤维涂覆有retronectin、纤连蛋白和/或聚凝胺的混合物。
[0068]
使用中空纤维系统的病毒转导过程
[0069]
如下文更详细地解释，使用根据本公开的中空纤维系统100将病毒或非病毒载体引入细胞中通常包括以下三个步骤：1)将细胞和病毒或非病毒载体装载到毛细管内空间138中，2)将病毒或非病毒载体引入毛细管内空间138内的细胞中，以及3)从毛细管内空间138收获细胞和病毒或非病毒载体。可以在每个步骤调节流体流动方向。
[0070]
在一些实例中，将包括转导的免疫细胞的收获的细胞转移到合适的生物反应器或培养容器中用于扩增。然后将转导的细胞在合适的培养基中扩增3-20天，并且然后洗涤并悬浮在最终制剂缓冲液中，并冷冻保存在合适的制剂中用于将来的治疗用途。
[0071]
在一些实例中，一旦收获，通过使用本领域中合适的手段将转导的细胞与未转导的细胞和载体分离，例如使用结合在转导细胞的细胞上表达的嵌合抗原受体(car)的抗体或使用流式细胞仪将转导的细胞与载体和未转导的细胞亲和分离。本领域中可以使用的其他合适的手段包括但不限于尺寸排阻分离或一些其他方法，诸如使用柱、膜等以从载体中分离细胞。一旦细胞在收获步骤后被分离、分开或去除，细胞可被扩增并且然后冷冻保存，或者在收获步骤后被冷冻保存，并且冷冻保存的细胞可随后用于将来的治疗用途。
[0072]
细胞和病毒或非病毒载体装载过程中的流体流动方向
[0073]
图2a-图2c示出了细胞和载体装载过程期间中空纤维系统100的构型和流体流动方向。导管140、144、148、156a、156b、168a、168b、176和180内的箭头方向；毛细管内空间138；中空纤维136；以及毛细管外空间139指示装载过程中的流体流动方向。如图2a所示，在细胞和载体装载过程中，毛细管内泵128接收来自细胞容器108的细胞流110和来自病毒容器112的载体流114，但不接收来自毛细管内介质容器104的毛细管内介质106。因此，尽管容器104、108、112中的每一者可以流体联接到毛细管内泵128，但来自容器中的每一者的流动可以经由一个或多个阀被选择性地控制(例如，打开和关闭)。
[0074]
继续参考图2a，毛细管内泵128经由第一毛细管内导管和第二毛细管内导管156a、156b中的每一者向毛细管内空间138提供细胞110和载体114。如前所述，毛细管内导管156a、156b可以经由设置在中空纤维过滤器模块134的相对端部的毛细管内端口160a、160b连接到毛细管内空间138。因此，将细胞110和载体114经由毛细管内导管156a、156b从中空纤维136的相对端部引入中空纤维136的毛细管内空间138，以在毛细管内空间138内产生细胞110和载体114的逆流。当细胞110和载体114从毛细管内空间138的相对端部流动时，细胞
110和载体114的逆流在毛细管内空间138内的共同区域碰撞和/或聚结，以限定转导区。因此，在转导步骤期间，如下文参考图3a-图3c所述，可以基于逆流在毛细管内空间138的局部区域内转导细胞110。
[0075]
在装载步骤期间，细胞110和载体114可以同时提供至毛细管内空间138。在其他实例中，可以在提供载体114之前将细胞110提供至毛细管内空间138。相反地，在一些实例中，可以在细胞110之前向毛细管内空间138提供载体114。在另一个实例中，细胞110和载体114可以通过两个端口160a、160b间歇地和交替地提供给毛细管内空间138，使得在毛细管内空间138内提供细胞110和载体114的分层。任选地，细胞110和载体114可以通过端口160a、160b中的一个装载，而端口160a、160b中的另一个处于关闭状态。
[0076]
在一些实施方案中，将细胞以1
×
103至1
×
10
10
个细胞/ml范围内的浓度装载到中空纤维中。在一些实施方案中，将细胞以约1
×
106至1
×
109个细胞/ml的浓度装载到中空纤维中。在一些实施方案中，将细胞以约1
×
106、1
×
107个细胞/ml、2
×
107个细胞/ml、3
×
107个细胞/ml、4
×
107个细胞/ml、5
×
107个细胞/ml、6
×
107个细胞/ml、7
×
107个细胞/ml、8
×
107个细胞/ml、9
×
107个细胞/ml或1
×
108个细胞/ml的浓度装载到中空纤维中。
[0077]
在一些实施方案中，以1
×
106iu个病毒/ml至1
×
109iu个病毒/ml范围内的浓度装载病毒颗粒。在一些实施方案中，以约1
×
107iu个病毒/ml、2
×
107iu个病毒/ml、3
×
107iu个病毒/ml、4
×
107iu个病毒/ml、5
×
107iu个病毒/ml、6
×
107iu个病毒/ml、7
×
107iu个病毒/ml、8
×
107iu个病毒/ml、9
×
107iu个病毒/ml、1
×
108iu个病毒/ml或1
×
109iu个病毒/ml的浓度装载病毒。
[0078]
在一些实施方案中，装载病毒或非病毒载体的流速是中空纤维136的膜的内表面面积大小的函数。在一些实例中，中空纤维136的膜的每平方厘米内表面面积的流速在0.25ml/min/cm2至100ml/min/cm2的范围内。在一些实施方案中，用于将细胞装载到中空纤维中的恒定流速在0.25ml/min/cm2至100ml/min/cm2之间。例如，在一些实施方式中，恒定流速为约0.25ml/min/cm2、0.5ml/min、1ml/min/cm2、5ml/min/cm2、10ml/min/cm2、15ml/min/cm2、20ml/min/cm2、25ml/min/cm2、30ml/min/cm2、35ml/min/cm2、40ml/min/cm2、45ml/min/cm2、50ml/min/cm2、55ml/min/cm2、60ml/min/cm2、65ml/min/cm2、70ml/min/cm2、75ml/min/cm2、80ml/min/cm2、85ml/min/cm2、90ml/min/cm2、95ml/min/cm2或100ml/min/cm2。
[0079]
在一些实施方案中，将细胞和病毒颗粒以约0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5或4.0的感染复数(moi)装载到中空纤维毛细管内空间中。因此，在一些实施方案中，以约0.25的moi装载细胞和病毒颗粒。在一些实施方案中，以约0.5的moi装载细胞和病毒颗粒。在一些实施方案中，以约1.0的moi装载细胞和病毒颗粒。在一些实施方案中，以约1.5的moi装载细胞和病毒颗粒。在一些实施方案中，以约2.0的moi装载细胞和病毒颗粒。在一些实施方案中，以约2.5的moi装载细胞和病毒颗粒。在一些实施方案中，以约3.0的moi装载细胞和病毒颗粒。在一些实施方案中，以约3.5的moi装载细胞和病毒颗粒。在一些实施方案中，以约4.0的moi装载细胞和病毒颗粒
[0080]
随着细胞110和载体114装载在毛细管内空间138内，中空纤维136将细胞110和载体114保留并集中在中空纤维136的毛细管内空间138内。因此，细胞110和载体114被集中在毛细管内空间138中(例如，在中空纤维136的膜的内表面上。来自细胞110和载体114的废物或流体122穿过中空纤维136的孔从毛细管内空间138到达毛细管外空间139。如图2b所示，
废物122通过毛细管外空间139沿相反方向流到设置在过滤器模块134的相对端部的毛细管外端口164a、164b。此处，废物122朝向毛细管外端口164a、164b的相反流动导致废物122的流出流相对于细胞110和载体114的流入流的交叉流动。废物122从毛细管外端口164a、164b经由毛细管外导管168a、168b行进到毛细管外泵132的毛细管外泵端口172a、172b，并且然后由泵132经由废物导管180排放到废物容器120。
[0081]
病毒或非病毒载体引入期间的流体流动方向
[0082]
一旦细胞110和载体114被装载到毛细管内空间138中，中空纤维系统100被构造成将毛细管内介质106引入毛细管内空间以促进转导。毛细管内流体装载步骤促进了细胞110和载体114在毛细管内空间138中(例如，在中空纤维136的膜的内表面上)的相互作用，这导致载体114与细胞110的结合和随后的载体颗粒114进入细胞110。图3a-图3c示出了在转导过程期间中空纤维系统100的构型和流体流动方向。箭头的方向表示在转导过程期间相应材料122、140的流体流动方向。如图3a所示，在转导过程期间，细胞容器108和病毒容器112不与毛细管内泵128流体连通，而毛细管内介质容器104与毛细管内泵128流体连通。因此，毛细管内泵128接收毛细管内介质106的流动，但不接收细胞110或载体114。
[0083]
继续参考图3a，毛细管内泵128经由第一毛细管内导管和第二毛细管内导管156a、156b中的每一者向毛细管内空间138提供毛细管内介质以启动载体引入。因此，类似于细胞110和载体114，毛细管内介质106可以从中空纤维136的相对端部装载到毛细管内空间138中。在一个实施方案中，转导时间为约90分钟。
[0084]
可以使用低流速的连续和恒定的流体流向毛细管内空间138提供毛细管内介质106，以防止病毒从细胞扩散出去。在一些实施方案中，将病毒或非病毒载体引入细胞中的恒定流速为10μl/min至5ml/min。在一些实施方案中，将载体转导至细胞中的恒定流速为10μl/min至5ml/min。例如，在一些实施方案中，恒定流速为约10μl/min、25μl/min、50μl/min、100μl/min、250μl/min、500μl/min、750μl/min、1ml/min、2ml/min、3ml/min、4ml/min或5ml/min。
[0085]
在一些实施方案中，使细胞和病毒或非病毒载体经受约5分钟至约几天的流体流动。在一些实施方案中，使细胞和病毒经受5分钟至约18小时的流体流动。在一些实施方案中，使细胞和病毒经受60分钟至约120分钟的流体流动。在一些实施方案中，使细胞和病毒经受约90分钟的流体流动。在一些实施方案中，在转导数周后，在中空纤维系统中进一步培养细胞。
[0086]
在转导过程期间，流体经由端口160a、160b进入过滤器模块134的毛细管内空间，并从毛细管内空间138穿过中空纤维136的孔并流出到毛细管外空间139。来自转导过程的废物或流体122从毛细管内空间138穿过中空纤维136的孔到达毛细管外空间139。如图3b所示，废物122通过毛细管外空间139沿相反方向流到设置在过滤器模块134的相对端部的毛细管外端口164a、164b。此处，废物122朝向毛细管外端口164a、164b的相反流动导致废物122的流出流相对于毛细管内介质140的流入流的交叉流动。毛细管外泵132从毛细管外端口164a、164b经由毛细管外导管168a、168b接收废物122，并且然后经由废物导管180将废物122排放到废物容器120。
[0087]
在收获细胞和病毒或非病毒载体期间的流体流动方向
[0088]
在图3a-图3c所示的转导过程之后，系统100被构造成从毛细管内空间138收获转
导的细胞126。图4a-图4c示出了在细胞收获过程期间中空纤维系统100的构型和流体流动方向。箭头的方向表示细胞收获过程期间的流体流动方向。如图4a所示，在收获过程期间，毛细管外泵132经由毛细管外端口164a、164b中的每一者提供从毛细管外介质容器116到毛细管外空间139的毛细管外介质118的流。如图4b和4c所示，毛细管外介质118从毛细管外空间139进入毛细管内空间138，以将转导的细胞126从毛细管内空间138移出。例如，经由毛细管外端口164a、164b中的每一者将毛细管外介质118引入到过滤器模块134的毛细管外空间，以最大化转导的细胞126从中空纤维136的膜的内表面移置到毛细管内空间138中。
[0089]
继续参考图4a，毛细管内泵128还可以提供从毛细管内介质容器104到毛细管内空间138的毛细管内介质流106(或其他冲洗流体)，以从毛细管内空间冲洗释放的转导细胞126。然而，与经由两个毛细管内端口160a、160b从中空纤维136的两个端部提供毛细管内介质106的转导过程(图3a-图3c)不同，在收获过程期间，仅经由一个毛细管内端口160a提供毛细管内介质106，以启动通过毛细管内空间138的单向流动。通过毛细管内空间的重复单向流体流动使得能够经由另一个毛细管内端口160b从毛细管内空间138向收获容器124收获转导的细胞126。
[0090]
在一些实例中，转导的细胞126从毛细管内空间138收集在完全培养基中，并且然后直接转移到合适的生物反应器或培养容器中。然后将转导的细胞在依赖于产物的培养缓冲液中扩增一段扩增期(例如3-20天)。一旦扩增，将细胞洗涤并悬浮在最终制剂缓冲液中，然后冷冻用于治疗用途。在其他实例中，转导的细胞126可以从最终制剂缓冲液中的毛细管内空间138中收获。此处，转导的细胞126被引入膜、柱或其他基于大小选择靶细胞和去除多余病毒的过程。然后将选择的靶细胞冷冻用于将来的治疗用途。
[0091]
使用半自动中空纤维系统的逆转录病毒和慢病毒转导
[0092]
实施例1.使用半自动中空纤维系统的t细胞的不含retronectin的逆转录病毒转导
[0093]
本实例示出了一项研究，该研究证明了使用半自动中空纤维系统的t细胞的不含retronectin的逆转录病毒转导。该实施例比较了在六种不同条件下实现的转导率：a)仅未转导(utd)的静态袋，b)不含与细胞和病毒共温育90分钟的retronectin(rn)涂层的静态袋，c)含有温育90分钟的retronectin涂层的静态袋，d)不含与细胞和病毒共温育过夜的retronectin涂层的静态袋，e)含有与细胞和病毒共温育过夜的retronectin涂层的静态袋(标准方法)，以及f)不具有与细胞和病毒共温育90分钟的retronectin的半自动中空纤维系统。所有六种条件的比较转导率如图5所示。
[0094]
在该实例中，制备了逆转录病毒的三倍稀释液，以确定最佳感染范围。将cd4/cd8分离的t细胞解冻，并活化48小时。在静态对照条件下，将浓度为100万个细胞/ml的700万个预活化的t细胞放入培养袋中。然后将这些预活化的细胞用病毒(moi 2.5)转导过夜或90分钟。制备retronectin对照，并用10μg/ml的retronectin涂覆细胞袋过夜。将retronectin涂覆的袋与逆转录病毒预温育2小时。
[0095]
在半自动中空纤维系统100中，将moi为2.5的细胞和病毒装载到过滤器模块134中并转导90分钟。在中空纤维系统100中不使用retronectin。在90分钟转导过程结束时，从过滤器模块134收获细胞和病毒，随后洗涤以去除病毒，并且然后将细胞接种在grex-6m中。过夜转导的静态袋细胞在第二天也经历了类似的过程。所有细胞在转导后扩增5天，并且然后
收获用于流动分析。
[0096]
数据显示，当细胞被转导相似的时间间隔时，与没有retronectin涂层的袋相比，retronectin涂覆的袋表现出更高的转导率。例如，温育90分钟的具有retronectin涂层的静态袋与没有retronectin涂层并温育相似时间间隔的静态袋相比，显示出更高的转导率，如图5所示。类似地，温育过夜的具有retronectin涂层的静态袋与温育过夜的不具有retronectin涂层的静态袋相比，显示出更高的转导率，如图5所示。温育90分钟的不具有retronectin涂层的半自动中空纤维系统100表现出与温育过夜的具有retronectin涂层的静态袋(即，标准方法)大约相同的转导速率，如图5中可以清楚地理解的。
[0097]
此外，从袋中收获的细胞(即静态对照)和转导后从中空纤维收获的细胞的生存力没有明显差异，如图6所示。类似地，在袋中转导的细胞和在中空纤维系统中转导的细胞之间，细胞的扩增或增殖没有明显差异。
[0098]
实施例2.使用半自动中空纤维系统的nk细胞的不含retronectin的逆转录病毒转导
[0099]
该实施例示出了一项概念验证研究，该研究证明了使用中空纤维系统的nk细胞的逆转录病毒转导。该实施例比较了在两种不同条件下实现的转导率：a)不含retronectin涂层的静态板，温育90分钟，b)不含retronectin涂层的半自动中空纤维系统100，温育90分钟。这两种条件的比较转导率如图7所示。
[0100]
在该实施例中，逆转录病毒被制备成最佳感染范围。分离新鲜脐带血nk细胞，并在转导前活化6天。在静态对照条件下，用病毒(moi2)转导浓度为100万细胞/ml的500万个预先活化的nk细胞90分钟。在半自动中空纤维系统中，将moi为2的细胞和病毒装载到中空纤维中并转导90分钟。在90分钟转导过程结束时，从中空纤维系统100收获细胞和病毒，随后洗涤以去除病毒，并且然后将细胞接种在组织培养板中。转导的静态细胞也经历了类似的过程。所有细胞在转导后扩增9天，并且然后收获用于流动分析。
[0101]
数据显示，与静态板对照相比，中空纤维系统表现出更高的nk细胞转导率，如图7所示。
[0102]
实施例3.使用半自动中空纤维系统的慢病毒转导
[0103]
该实施例示出了一项概念验证研究，该研究证明了使用半自动中空纤维系统的慢病毒转导。该实施例比较了在四种不同条件下实现的转导率：a)未转导的袋(即，仅静态袋)，b)温育90分钟的静态袋，c)温育过夜的静态袋，以及d)温育90分钟的半自动中空纤维。所有这四种条件的相对转导率如图8所示。
[0104]
在该实施例中，使用具有zsgreen报道基因的慢病毒载体。将cd4/cd8分离的t细胞解冻，并活化48小时。制备单个小瓶的细胞和病毒混合物[感染复数(moi)为1]，并且然后等分到单独的小瓶中以确保相等的moi。
[0105]
在静态对照条件下，将浓度为100万个细胞/ml的700万个预活化的t细胞置于细胞袋中。然后将这些预活化的细胞用moi为1的病毒转导过夜或90分钟。
[0106]
在半自动中空纤维系统中，将细胞/病毒混合物装载到中空纤维中并转导90分钟。在90分钟转导过程结束时，从中空纤维收获细胞和病毒，随后洗涤以去除病毒，并且然后将细胞接种在grex-6m中。过夜转导的细胞在第二天也经历了类似的过程。所有细胞在转导后扩增5天，并且然后收获用于流动分析。
[0107]
如图8所示，与转导90分钟的静态袋相比，转导过夜的静态袋显示出更高的转导率。与过夜温育的静态袋相比，仅温育90分钟的半自动中空纤维系统100表现出高约1.4倍的转导，如图8中清楚可见。此外，从袋中收获的细胞和转导后从中空纤维收获的细胞的生存力没有明显差异。类似地，在转导后，袋和中空纤维之间的膨胀没有明显差异。
[0108]
用于细胞治疗转导的半自动中空纤维系统
[0109]
图9示出了用于细胞治疗转导的中空纤维系统200的另一个实例的示意性布局。该布局以输入材料206、210、214、218、输出材料222、226和中空纤维236为特征。
[0110]
输入材料包括转导介质206、细胞210、载体214和回收/收获介质218。用于输入材料的每个容器204、208、212、216还连接到气泡传感器284和阀260a-260d，其控制输入材料206、210、214到中空纤维236的流动。气泡传感器284a-d检测输入材料206、210、214、218中气泡的存在，并帮助确保中空纤维236接收无气泡的输入材料206、210、214、218。
[0111]
输出材料包括收获的细胞226和废物222。每个输出材料的容器220、224还连接到一个或多个端口164a、164b，其控制流体/介质从中空纤维236到输出材料容器220、224的流动。
[0112]
中空纤维236经由阀260e-260g、264a-264d和压力传感器288连接到几个泵228a、228b、232。在细胞和病毒装载过程、转导过程和收获过程期间，这些泵228a、228b、232控制流体流到中空纤维236的毛细管内空间和毛细管外空间的速率，这些过程以与上文关于中空纤维236所述类似的方式用中空纤维236进行。
[0113]
本文公开的系统和方法通过使用中空纤维系统增加载体和靶细胞之间的接触而显著增加了将病毒或非病毒载体引入细胞的效率。以此方式，将大量细胞暴露于允许有效的细胞转导的足够的载体浓度。这导致转导细胞的时间减少，同时还使载体浪费最小化。因此，本公开提供了不仅减少用于实现细胞的高转导的载体的总量，而且显著减少转导时间的系统和方法。因此，在一个方面，与常规转导系统相比，本文所述的系统和方法以降低的成本实现了有效的细胞转导。本文公开的系统和方法的其他益处包括转导细胞数量的增加、转导过程中消耗的病毒更少、处理时间减少以及制造成本降低。这进而使患者受益，至少是因为所述方法允许更快的处理时间，并产生更有效的治疗剂。
[0114]
本文所述的方法使用中空纤维系统，其使切向流体能够从中空纤维的一侧流向中空纤维的另一侧。中空纤维系统包括一根或多根中空纤维。中空纤维包括允许切向流体流过膜的多孔圆柱形表面。切向流体流使载体与细胞接触/接近，这有助于增加病毒转导效率。
[0115]
中空纤维的多孔圆柱形表面使得流体和小分子能够流过，但同时不允许细胞和较大分子流过。因此，在本文所述的一些实施方案中，中空纤维包括选择性地允许某些分子流过和流出中空纤维，同时保留细胞和其他较大分子的孔径。此外，本文所述的中空纤维可被定制成具有50kda至1μm之间的孔隙率，以进一步增强所需的流动特性，从而实现将病毒或非病毒载体高效引入到靶细胞或宿主细胞中。中空纤维的孔隙率也可以根据所用病毒或非病毒载体的大小进行定制。在一些实施方案中，中空纤维的孔径是病毒或非病毒颗粒尺寸的四分之一。在一些实施方案中，中空纤维的孔径是病毒或非病毒颗粒尺寸的三分之一。在一些实施方案中，中空纤维的孔径是病毒或非病毒颗粒尺寸的一半。为了可被调节以进一步优化将病毒或非病毒载体引入到靶细胞或宿主细胞中的效率的中空纤维的附加参数是
中空纤维本身的直径。
[0116]
转导细胞的用途
[0117]
使用本文所述的方法引入病毒或非病毒载体的细胞允许将细胞用于修饰细胞可具有的任何目的。修饰的细胞保持高生存力(例如，大于70％、75％、80％、85％或90％，或至多98％)，并且可用于多种应用，诸如用于细胞治疗目的，例如过继细胞疗法应用。
[0118]
在一些实施方案中，使用中空纤维系统的转导的细胞的生存力和增殖与使用过夜静态条件的转导的细胞的生存力和增殖相同。
[0119]
过继细胞疗法
[0120]
本文所述的方法尤其可用于遗传工程改造细胞，以用于各种治疗方法，包括例如用于过继细胞疗法应用。
[0121]
过继细胞疗法(“act”)是指将自体或同种异体细胞输注到患者体内以治疗疾病。各种细胞类型可用于基于act的疗法，诸如b细胞、t细胞、nk细胞、单核细胞、祖细胞或细胞系。祖细胞可以直接从患者或非患者供体中分离。祖细胞包括，例如，成体干细胞和多能细胞，诸如来源于患者或非患者供体的ipsc。在一些实施方案中，act使用遗传修饰的造血干细胞(“hsc”)移植。
[0122]
造血干细胞(“hsc”)移植是act方法的一个类别，涉及输注自体或同种异体干细胞，以重建骨髓或免疫系统受损或有缺陷的患者的造血功能。它还允许引入基因修饰的hsc，例如，用于治疗先天性遗传疾病。在典型的hsc移植中，hsc从骨髓、外周血或脐带血中获得。
[0123]
在一些实施方案中，从外周血获得的细胞经过基因工程改造以用于act方法。外周血用于自体移植，因为与骨髓或脐带血相比，干细胞和祖细胞的含量高。此外，从外周血中获得的hsc在移植后表现出更快的植入。由于外周血中的hsc以低浓度存在，因此通常使用动员剂处理供体，所述动员剂诸如粒细胞集落刺激因子(g-csf)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)，其影响hsc对骨髓环境的粘附并将它们释放到外周血中。
[0124]
在一些实施方案中，本文所述的方法用于对t细胞进行基因修饰，以用于基于t细胞免疫疗法的act方法。t细胞免疫疗法是act方法的另一种类型，并且涉及输注自体或同种异体t淋巴细胞，所述细胞被选择和/或离体工程化以靶向特异性抗原，例如肿瘤相关抗原。t淋巴细胞通常通过白细胞单采术(leukapheresis)从供体的外周血中获得。在一些t细胞免疫治疗方法中，将从供体获得的t淋巴细胞，诸如肿瘤浸润性淋巴细胞(“til”)，在培养物中扩增并针对抗原特异性进行选择而不改变其天然特异性。在其他t细胞免疫治疗方法中，对从供体获得的t淋巴细胞进行离体工程改造，通常通过用病毒表达载体转导，以表达具有预先确定的特异性的嵌合抗原受体(“car”)。car通常包括细胞外结构域，诸如来自scfv的结合结构域，其赋予对期望抗原的特异性；跨膜结构域；以及一个或多个细胞内结构域，其触发t细胞效应功能，诸如来自cd3ζ或fcrγ的细胞内结构域，以及任选地，从例如cd28和/或4-1bb获取的一个或多个共刺激结构域。在其他t细胞免疫治疗方法中，对从供体获得的t淋巴细胞进行离体工程改造，通常通过用病毒表达载体转导，以表达赋予对在特定hla等位基因的环境中存在的抗原的期望特异性的t细胞受体(“tcr”)。
[0125]
在一些实施方案中，本文所述的方法用于对造血干细胞(hsc)进行基因修饰。在一些实施方案中，在移植到受体受试者中之前，对hsc进行另外的处理以扩增hsc群或通过本
文所述的重组方法对其进行操纵以将异源基因或另外的功能引入同种异体hsc。在某些实施方案中，另外的处理导致hsc的成熟。
[0126]
从供体获得的hsc，无论是自体的还是同种异体的，都可以在移植到受体受试者中之前进行另外的处理。在一些实施方案中，对hsc进行处理以扩增hsc群，例如通过在合适的培养基中培养一个或多个hsc。
[0127]
在一些实施方案中，hsc，无论是自体的还是同种异体的，都通过重组方法进行操纵，以通过本文公开的方法引入异源基因。这样的遗传操纵可以用于在移植前纠正遗传缺陷和/或向hsc引入另外的功能。在一些实施方案中，将功能性野生型基因引入hsc以纠正遗传缺陷，例如先天性造血障碍(例如，β-地中海贫血、范可尼贫血(fanconi anemia)、血友病、镰状细胞性贫血等)；原发性免疫缺陷(例如，腺苷脱氨酶缺陷、x连锁严重联合免疫缺陷、慢性肉芽肿病、威斯科特-奥尔德里奇综合征(wiskott-aldrich syndrome)、janus激酶3缺陷、嘌呤核苷磷酸化酶(pnp)缺陷、1型白细胞粘附缺陷等)；以及先天性代谢疾病(例如，i、ii、iii、vii型粘多糖贮积症(mps)、戈谢病(gaucher disease)、x连锁肾上腺脑白质营养不良等)。在某些实施方案中，通过重组酶系统对hsc进行基因操纵，诸如使用crispr/cas9系统或cre/lox重组酶的基因组编辑。例如，重组酶系统可以用于消融基因或纠正基因缺陷。在各种实施方案中，改变hsc的功能的其他方法包括引入反义核酸、核酶和rnai等。
[0128]
在一些实施方案中，通过将病毒或非病毒载体引入祖细胞或细胞系来修饰祖细胞或细胞系。根据本文所述的方法和系统，可以使用任何合适的祖细胞或细胞系。作为非限制性实例，合适的祖细胞包括例如直接从患者或从非患者供体分离的细胞。祖细胞包括，例如，成体干细胞和多能细胞，诸如来源于患者或非患者供体的ipsc。各种细胞系也可与本文所述的方法和系统一起使用，并且包括例如人类或非人类来源的哺乳动物细胞系。
[0129]
本公开的其他特征、目的和优点在以下实施例中是显而易见的。然而，应理解的是，这些实施例虽然指示了本公开的实施方案，但仅作为说明而非限制给出。根据实施例，本公开范围内的各种变化和修改对本领域技术人员来说将变得显而易见。
[0130]
定义
[0131]
过继细胞疗法：如本文所用，术语“过继细胞疗法”、“过继细胞转移”或“act”是指将细胞转移到有需要的患者体内。细胞可以从有需要的患者中得到和繁殖，或者可以从非患者供体获得。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞，诸如淋巴细胞。各种细胞类型可以用于act，例如t细胞、cd8+细胞、cd4+细胞、nk细胞、δ-γt细胞、调节性t细胞以及外周血单核细胞。在一些实施方案中，细胞被遗传修饰以引入嵌合抗原受体(car)。
[0132]
动物：如本文所用，术语“动物”指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、基因工程改造的动物和/或克隆。
[0133]
大约或约：如本文所用，术语“大约”或“约”，当应用于一个或多个所关注的值时，是指所述的值以及类似于所述的参考值的值。在某些实施方案中，除非另有说明或从上下文中明显看出，否则术语“大约”或“约”是指在陈述的参考值的任一方向上(大于或小于陈
述的参考值)落入25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小以内的值的范围(除了这样的数将超过可能值的100％的情况外)。
[0134]
嵌合抗原受体(car)：如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“car”工程化受体，其可将抗原特异性赋予使用本文所述的方法转导的细胞(例如免疫细胞如nk细胞、ipsc衍生的nk细胞(ink细胞)、t细胞如初始t细胞、中枢记忆t细胞、效应记忆t细胞、γδt细胞、t调节细胞或其组合)。car也被称为人工t细胞受体、嵌合t细胞受体或嵌合免疫受体。在各种实施方案中，本文所述的car可包括抗原特异性靶向结构域、细胞外结构域、跨膜结构域、任选的一个或多个共刺激结构域和细胞内信号结构域中的一者或多者。
[0135]
低温保存：如本文所用，术语“低温保存”通常是指将生物材料(例如，细胞群或转导的细胞)冷冻至足够低的温度，使得可能损害材料的化学过程停止，从而保存材料。冷冻保存的细胞在冷冻状态下可长时间保持活力，诸如在冷冻保存状态下可保持1年、5年、10年或更多年。一旦解冻，冷冻保存的细胞能够在体外和体内应用中增殖。
[0136]
宿主细胞或靶细胞：如本文所用，术语“宿主细胞”或“靶细胞”包括未转染的、未感染的和未转导的细胞。在一些实施方案中，术语“宿主细胞”或“靶细胞”包括用本公开的重组载体或多核苷酸转染、感染或转导的细胞。宿主细胞可包括包装细胞、生产细胞以及被病毒载体感染的细胞。在特定的实施方案中，用本公开的病毒载体感染的宿主细胞适于向需要治疗的受试者施用。在一些实施方案中，靶细胞是干细胞或祖细胞。在某些实施方案中，靶细胞是体细胞，例如成体干细胞、祖细胞或分化细胞。在优选实施方案中，靶细胞是造血细胞，例如造血干细胞或祖细胞。在一些实施方案中，靶细胞包括b细胞、t细胞、nk细胞、单核细胞或祖细胞。在一些实施方案中，靶细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌细胞或真菌细胞。
[0137]
哺乳动物细胞系
[0138]
在一些实施方案中，“宿主细胞”或“靶细胞”包括细胞系。各种细胞系在本领域中是已知的并且适用于本公开。合适的细胞系包括例如人类或非人类来源的哺乳动物细胞系。
[0139]
根据本公开，任何对细胞培养和多肽表达敏感的哺乳动物细胞或细胞类型都可以用作宿主细胞或靶细胞。根据本公开可以使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括人胚肾293细胞(hek293)、hela细胞；balb/c小鼠骨髓瘤细胞系(nso/l，ecacc编号：85110503)；人类成视网膜细胞(per.c6(crucell,leiden,the netherlands))；sv40转化的猴肾cv1系(cos-7，atcc crl 1651)；人胎肾细胞系(293或293细胞亚克隆用于在悬浮培养物中生长，graham等人,j.gen virol.,36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(bhk，atcc ccl 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-dhfr(cho,urlaub和chasin,proc.natl.acad.sci.usa,77:4139(1980))；小鼠支持细胞(tm4,mather,biol.reprod.,23:243-251(1980))；猴肾细胞(cv1 atcc ccl 70)；非洲绿猴肾细胞(vero-76，atcc crl-1 587)；人宫颈癌细胞(hela，atcc ccl 2)；犬肾细胞(mdck，atcc ccl 34)；水牛大鼠肝细胞(brl 3a，atcc crl 1442)；人肺细胞(w136，atcc ccl 75)；人肝细胞(hep g2，hb 8065)；小鼠乳腺肿瘤(mmt 060562，atcc ccl51)；tri细胞(mather等人,annals n.y.acad.sci.,383:44-68(1982))；mrc 5细胞；fs4细胞；以及人肝癌细胞系(hep g2)。在一些实施方案中，合适的哺乳动物细胞不是内体酸化缺陷型细胞。
[0140]
此外，根据本公开，可以利用任何数量的表达多肽或蛋白质的商业和非商业上可获得的杂交瘤细胞系。本领域技术人员将理解，杂交瘤细胞系可能具有不同的营养需求和/或可能需要不同的培养条件以用于最佳生长和多肽或蛋白质表达，并且将能够根据需要改变条件。
[0141]
非哺乳动物细胞系
[0142]
根据本公开，对细胞培养和多肽表达敏感的任何非哺乳动物来源的细胞或细胞类型都可以用作宿主细胞。可根据本公开使用的非哺乳动物宿主细胞和细胞系的非限制性实例包括来源于以下的细胞或细胞系：针对酵母的毕赤酵母(pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(pichia angusta)、粟酒裂殖酵母(schizosacccharomyces pombe)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)以及解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)；针对昆虫的草地贪夜蛾(sodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(trichoplusis ni)、黑腹果蝇(drosophila melangoster)和烟草天蛾(manduca sexta)；以及针对细菌的大肠杆菌(escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(bacillus lichenifonnis)、脆弱类杆菌(bacteroides fragilis)、产气荚膜梭菌(clostridia perfringens)、艰难梭菌(clostridia difficile)；以及来自两栖类的非洲爪蟾(xenopus laevis)。
[0143]
功能性等同物或衍生物：如本文所用，术语“功能性等同物”或“功能性衍生物”在氨基酸序列的功能性衍生物的上下文中表示保留与原始序列基本上相似的生物活性(功能或结构)的分子。功能性衍生物或等同物可以是天然衍生物或合成制备的。示例性功能性衍生物包括具有一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列，条件是蛋白质的生物活性是保守的。取代氨基酸理想地具有与被取代的氨基酸相似的化学-物理特性。理想的相似化学-物理特性包括电荷、体积、疏水性、亲水性等的相似性。
[0144]
体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中(例如，在试管或反应容器中、在细胞培养物中等)而不是在多细胞生物体内发生的事件。
[0145]
体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞生物体如人和非人动物内发生的事件。在基于细胞的系统的上下文中，该术语可用于指活细胞内发生的事件(与例如体外系统相反)。
[0146]
非病毒载体：如本文所用，术语“非病毒载体”包括例如纳米颗粒、脂质体、脂质颗粒、碳、非活性金属、明胶和/或多胺纳米球。
[0147]
原代细胞：术语“原代细胞”是指直接从受试者分离并随后繁殖的细胞。
[0148]
多肽：如本文所用，术语“多肽”是指通过肽键连接在一起的连续氨基酸链。该术语用于指任何长度的氨基酸链，但本领域普通技术人员将理解，该术语不限于长链并且可以指包括通过肽键连接在一起的两个氨基酸的最小链。如本领域技术人员所知，可对多肽进行加工和/或修饰。
[0149]
蛋白质：如本文所用，术语“蛋白质”是指作为离散单元起作用的一个或多个多肽。如果单个多肽是离散的功能单元并且不需要与其他多肽永久或暂时性地物理缔合以形成离散的功能单元，则术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。如果离散的功能单元由多于一个物理上彼此缔合的多肽组成，则术语“蛋白质”是指物理联接并作为离散单元一起发挥作用
的多个多肽。
[0150]
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括出生前和出生后形式。在许多实施方案中，受试者是人类。受试者可以是患者，其是指提供给医疗提供者用于诊断或治疗疾病的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可以患有或易患疾病或病症，但可表现出或可不表现出该疾病或病症的症状。
[0151]
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出感兴趣的特征或特性的全部或接近全部范围或程度的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)走到完全和/或继续进行至完全或者实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文中用于捕捉许多生物和化学现象中固有的完全性的潜在缺乏。
[0152]
患有：“患有”疾病、病症和/或病状的个体已被诊断具有或表现出该疾病、病症和/或病状的一种或多种症状。
[0153]
治疗有效量：如本文所用，术语治疗剂的“治疗有效量”意指当施用于患有或易患疾病、病症和/或病状的受试者时足以治疗、诊断、预防疾病、病症和/或病状和/或延迟其症状发作的量。本领域普通技术人员将理解，治疗有效量通常经由包含至少一个单位剂量的给药方案施用。
[0154]
治疗：如本文所用，术语“治疗(treat、treatment或treating)”是指用于部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、预防特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征、延迟其发作、降低其严重程度和/或降低其发生率的任何方法。可向未表现出疾病迹象和/或仅表现出疾病早期迹象的受试者施用治疗，以用于降低发展与该疾病相关的病理学的风险。
[0155]
载体(vector)：如本文所用，术语“载体”是指任何运载体和任何一种或多种外源基因的组合。载体可包括非病毒载体、病毒载体等，以及它们的任何组合。例如，非病毒载体可包括但不限于脂质体、原生质球、红细胞血影(red blood cell ghost)、胶态金属、磷酸钙、deae葡聚糖质粒等，或它们的组合。病毒载体可包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、假型载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、杂合病毒等，以及它们的任何组合。
[0156]
转导：如本文所用，术语“转导”是指经由病毒载体将外源dna引入另一细胞的过程。各种病毒载体是本领域已知的并且包括，例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体、假型载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等，以及它们的任何组合。
[0157]
转染：如本文所用，术语“转染”是指通过非病毒方法将核酸引入细胞的过程。在一些实施方案中，本文所述的方法适用于转染感兴趣的细胞。
[0158]
本文中通过端点表述的数值范围包括所述范围内包含的所有数值和分数(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.9、4和5)。还应当理解，所有的数字及其分数都被认为是由术语“约”修饰。
[0159]
本公开的各个方面在以下部分中详细描述。部分的使用并不意味着限制本公开。每个部分可适用于本公开的任何方面。在本技术中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物，除非上下文另有明确说明。