非洲猪瘟疫苗组合物的制作方法

本发明涉及一种多肽、多核苷酸、质粒和包含它们的疫苗组合物，其涉及引发对非洲猪瘟的免疫应答。并且，本发明还涉及一种引发受体对非洲猪瘟免疫应答的方法。此外，本发明还涉及一种用于治疗或预防非洲猪瘟的药物组合物，该药物组合物包含多肽、多核苷酸或质粒，其涉及引发对非洲猪瘟免疫应答。另外，本发明还涉及一种治疗或预防受体非洲猪瘟的方法。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是一种猪的传染性病毒疾病，会导致严重出血。一旦发生，它具有高度传染性，而且没有治疗方法。此外，受感染的猪的死亡率非常高，对猪肉行业造成巨大损害。因此，当非洲猪瘟发生时，必须立即向世界动物卫生组织(oie)报告，并立即停止与猪有关的国际贸易。asf被世界动物卫生组织(oie)列为一种非常重要的疾病，根据韩国《传染病预防法》，该疾病被指定为法定传染病并进行管理。

2、非洲猪瘟病毒(asfv)是一种约200nm的dna病毒，属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属。据报道，asf病毒不会感染人类或其他动物，但只感染猪科动物。

3、asf病毒大量存在于受感染动物的唾液、呼吸道分泌物、尿液、粪便等中，asf传染接触这些物质的正常动物。由于猪死后病毒可能会在血液和组织中存活，如果在不加热的情况下向猪提供含有受感染动物组织的饲料，asf可能会迅速传染。另外，该病毒可能会通过猪之间打斗、血性腹泻等溢出的血液传播。另外，吸血昆虫，如蚊子、咬人的苍蝇和属于钝缘蜱属的软蜱可能携带asfv，并当它们咬猪或吸血时作为传播疾病的携带者。

4、asf可以感染所有年龄段的猪。发病率取决于感染的病毒和接触途径，自然感染的潜伏期为4至19天不等。感染高致病性病毒时，死亡率几乎为100％。

5、asf病毒根据其致病性可分为高致病性、中致病性和低致病性。高致病性asf病毒可引起过急性(猪感染后1至4天死亡)和急性(猪感染后3至8天死亡)疾病，而中致病性asf病毒可引起急性(猪感染之后11至15天死亡)和亚急性(猪感染20天后死亡)疾病。低致病性asf病毒仅在流行地区报告，并导致亚临床或慢性疾病。

6、asf很难在早期诊断，特别是当感染猪的数量很少时。这是因为asf的临床症状与其他出血性猪疾病相混淆，如败血症性沙门氏菌病和猪皮炎肾病综合征(pdns)。只有通过实验室分析，如检测血液和内脏中病毒的方法和检测感染猪血清中抗体的方法，才能准确诊断。在许多情况下，当asf被诊断时，该疾病已经广泛传播。例如，asf的传染性如此之高，以至于2018年在中国首次确诊asf后不到9个月，asf就在中国所有行政区发生。此外，在世界上最大的养猪国中国，2019年约有1.3亿头猪因asf死亡或被杀死，这意味着从asf爆发前的4.3亿头猪减少了约1/3。

7、asf疫苗自20世纪60年代以来一直在稳步研究。迄今为止，已经进行了各种尝试，例如减毒活疫苗、灭活疫苗、重组蛋白疫苗和病毒载体疫苗，但尚未开发出可商业应用的具有优异效果的疫苗。最近发表的一项研究表明，即使通过接种灭活疫苗形成了中和抗体，但在实际挑战过程中没有保护作用或可以忽略。研究表明，除了产生中和抗体外，诱导细胞免疫应答是提高疫苗对病毒保护能力的重要机制(takamatsu et al.,virus res.2013 apr,173(1):110-21)。

8、此外，很难开发出针对猪致命的asf的有效疫苗的原因之一是asf病毒的庞大和复杂性。正常病毒有10至12种蛋白质，asf病毒有150多种蛋白质，有许多不同类型的病毒(24种基因型)。因此，专家们预测，至少在未来10年内，疫苗的商业化是困难的。

9、因此，非常需要针对asf的疫苗或治疗。特别是，提前稳定有效地预防asf是非常重要的，为此，对新疫苗的需求非常高。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是提供能够引发对asf的免疫应答的多肽和编码该多肽的多核苷酸。

2、本发明的另一个目的是提供能够引发对asf的免疫应答的质粒。

3、本发明的另一个目的是提供抗asf的疫苗组合物。

4、本发明的另一个目的是提供一种在受体中引发对asf的免疫应答的方法。

5、本发明的另一个目的是提供用于治疗或预防asf的药物组合物。

6、本发明的另一个目的是提供治疗或预防受体asf的方法。

7、为了实现上述目的，本发明的一个方面提供了一种多肽，包含至少一个选自asf病毒基因p30、p54、c型凝集素、cd2v、p49、pp62、ep364r、f317l、a104r和k205r的氨基酸序列。

8、本发明的另一方面提供一种多肽，其包含至少一个选自seq id nos：1～10的氨基酸序列或与其具有90％或更多同一性的氨基酸序列。

9、如本文所用，术语“同一性”是指给定多肽序列或多核苷酸序列对应的程度，并且可以百分比表示。在本说明书中，与给定多肽序列具有相同或类似活性的序列的同一性可以用“％同一性”表示。可以通过使用诸如blast2.0的标准软件来确定同一性，blast 2.0计算诸如分数、同一性、相似性等参数，或者通过在严格限定的条件下使用的杂交测试来比较序列。可通过本领域技术人员公知的任何方法来确定待定义的适当杂交条件。

10、seq id nos：1～10的氨基酸序列依次是6通过比较来自各种asf病毒株的基因p30(cp204l)、p54(e183l)、c型凝集素(ep153r)、cd2v(ep402r)、p49(b438l)、pp62(cp530r)、ep364r、f317l、a104r和k205r的序列同源性而获得的共有序列。

11、包含seq id nos：1～10的氨基酸序列或与其具有90％或更多同一性的氨基酸序列中的至少一个的多肽可以有效地充当能够产生针对asf的免疫应答的抗原。

12、所述多肽可包含上述氨基酸序列中的一个，或可包含两个或更多。此外，所述多肽可进一步包含kozak序列、ige前导序列、泛素序列和/或切割位点序列。例如，所述多肽可包含kozak序列-ige前导序列-seq id no：1的氨基酸序列。作为另一个例子，所述多肽可包含kozak序列-ige前导序列-泛素序列-seq id no：1的氨基酸序列。作为另一个例子，所述多肽可包含kozak序列-ige前导序列-泛素序列-seq id no：1的氨基酸序列-切割位点序列-seq id no：2的氨基酸序列。泛素序列优选为seq id no：41，切割位点序列优选为seq idno：43。

13、本发明的一个方面提供一种多核苷酸，其包含至少一个选自asf病毒基因p30、p54、c型凝集素、cd2v、p49、pp62、ep364r、f317l、a104r和k205r的核苷酸序列。

14、本发明的另一方面提供一种多核苷酸，其包含至少一个选自seq id nos：11～20的核苷酸序列或与其具有90％或更多同一性的核苷酸序列。

15、或者，本发明的另一方面提供一种多核苷酸，其编码seq id nos：1～10的氨基酸序列或与其具有90％或更多同一性的氨基酸序列中的至少一个。编码seq id nos：1～10的氨基酸序列的多核苷酸可以分别是seq id nos：11～20的核苷酸序列。

16、seq id nos：11～20的核苷酸序列依次是通过比较来自各种asf病毒株的基因p30(cp204l)、p54(e183l)、c型凝集素(ep153r)、cd2v(ep402r)、p49(b438l)、pp62(cp530r)、ep364r、f317l、a104r和k205r的序列同源性而获得的共有序列。

17、或者，在多核苷酸中，seq id nos：1～10的氨基酸序列或seq id nos：11～20的核苷酸序列可以是那些被针对受体优化以产生免疫应答的密码子修饰的序列。例如，受体是动物。该动物可以是哺乳动物，包括例如猪、牛、马、绵羊、山羊、鹿和人。该动物优选是猪。

18、所述多核苷酸可包含上述核苷酸序列中的一个，或可包含两个或更多。此外，所述多核苷酸可进一步包含kozak序列、ige前导序列、泛素序列和/或切割位点序列。例如，所述多核苷酸可包含kozak序列-ige前导序列-seq id no：11的核苷酸序列。作为另一个例子，多核苷酸可以包括kozak序列-ige前导序列-泛素序列-seq id no：11的核苷酸序列。作为另一个例子，多核苷酸可以包括kozak序列-ige前导序列-泛素序列-seq id no：11的核苷酸序列-切割位点序列-seq id no：12的核苷酸序列。泛素序列优选为seq id no：42，切割位点序列优选为seq id no：44。

19、本发明的一个方面提供了一种包含多核苷酸的质粒，所述多核苷酸包含至少一个选自asf病毒基因p30、p54、c型凝集素、cd2v、p49、pp62、ep364r、f317l、a104r和k205r的核苷酸序列。

20、本发明的另一方面提供了一种包含多核苷酸的质粒，所述多核苷酸包含至少一个选自seq id nos：11～20的核苷酸序列或与其具有90％或更多同一性的核苷酸序列。

21、本发明的另一方面提供了一种包含多核苷酸的质粒，所述多核苷酸编码seq idnos：1的氨基酸序列或与seq id nos：1具有90％或更多同一性的氨基酸序列中的至少一个。

22、如本文所使用的，术语“质粒”是指含有与合适的调控序列可操作地连接的dna序列的dna构建体，能够在适当宿主或受体中表达dna。质粒可以是载体、噬菌体颗粒或简单的潜在基因组插入物。在本说明书中，术语质粒可以与术语载体或病毒载体互换使用。

23、所述质粒可根据本领域已知的常规方法制备。例如，通过基因克隆将多核苷酸插入质粒载体，可制备本发明的质粒并用作dna疫苗。

24、所述质粒可包含上述多核苷酸序列中的一个，或可包含两个或更多。此外，所述多核苷酸可进一步包含kozak序列、ige前导序列、泛素序列和/或切割位点序列。

25、例如，所述质粒可包含seq id no：31的核苷酸序列，其中seq id nos：11～20的核苷酸序列顺序连接。作为另一个例子，所述质粒可包含seq id no：36的核苷酸序列，其中泛素序列和seq id nos：11～20的核苷酸序列顺序连接。例如，所述质粒可包含seq id no：50的核苷酸序列，其中泛素序列和seq id nos：11～20的核苷酸序列顺序连接，并且seq idnos：12～20的每个核苷酸序列也通过切割位点序列顺序连接。

26、泛素序列可以优选为seq id no：42的核苷酸序列。cd8+t细胞识别源自内源性抗原的mhc i类相关肽，如病毒抗原或位于胞浆中的癌基因产物。在这些mhc i类分子呈递抗原之前，抗原被泛素化并与抗原肽一起由蛋白酶体处理。因此，泛素融合蛋白进入蛋白酶体依赖性降解途径，增强呈递mhc i类肽的能力，从而增加细胞免疫应答(ctl，细胞毒性t淋巴细胞应答)的诱导。

27、切割位点序列可以优选为seq id no：44的核苷酸序列。切割位点是指被蛋白酶识别和切割的肽。在本发明中，它允许由含有多核苷酸的质粒表达的多肽被裂解酶裂解，使得每个裂解的多肽可以有效地充当能够产生针对asf的免疫应答的抗原。切割位点可被细胞中存在的内源性酶切割，例如但不限于嘌呤蛋白酶。

28、作为另一个例子，所述质粒可包含seq id no：32的核苷酸序列，其中seq id no：32表示seq id nos：11～14的核苷酸序列顺序连接。或者，所述质粒可包含seq id no：37的核苷酸序列，其中seq id no：37表示泛素序列和seq id nos：11～14的核苷酸序列顺序连接。

29、作为另一个例子，所述质粒可包含seq id no：33的核苷酸序列，其中seq id no：33表示seq id nos：15～20的核苷酸序列顺序连接。或者，所述质粒可包含seq id no：38的核苷酸序列，其中seq id no：38表示泛素序列和seq id nos：15～20的核苷酸序列顺序连接。

30、作为另一个例子，所述质粒可包含seq id no：34的核苷酸序列，其中seq id no：34表示seq id nos：11、12、16、13和14的核苷酸序列顺序连接。或者，所述质粒可包含seqid no：39的核苷酸序列，其中seq id no：39表示泛素序列和seq id nos：11、12、16、13和14的核苷酸序列顺序连接。

31、作为另一个例子，所述质粒可包含seq id no：35的核苷酸序列，其中seq id no：35表示seq id nos：15、17、18、19和20的核苷酸序列顺序连接。或者，所述质粒可包含seqid no：40的核苷酸序列，其中seq id no：40表示泛素序列和seq id nos：15、17、18、19和20的核苷酸序列顺序连接。

32、作为另一个例子，所述质粒可包含seq id no：50的核苷酸序列，其中seq id no：50表示其包含seq id no：42的泛素序列和seq id no：44的切割位点序列，并且seq idnos：11、44、12、44、13、44、14、44、15、44、16、44、17、44、18、44、19、44、20的核苷酸序列顺序连接。

33、作为另一个例子，所述质粒可包含seq id no：51的核苷酸序列，其中seq id no：51表示其包含seq id no：42的泛素序列和seq id no：44的切割位点序列，并且seq idnos：11、44、12、44、13、44、14的核苷酸序列顺序连接。

34、作为另一个例子，所述质粒可包含seq id no：52的核苷酸序列，其中seq id no：52表示其包含seq id no：42的泛素序列和seq id no：44的切割位点序列，并且seq idnos：15、44、16、44、17、44、18、44、19、44、20的核苷酸序列顺序连接。

35、作为另一个例子，所述质粒可包含seq id no：53的核苷酸序列，其中seq id no：53表示其包含seq id no：42的泛素序列和seq id no：44的切割位点序列，并且seq idnos：11、44、12、44、16、44、13、44、14的核苷酸序列顺序连接。

36、作为另一个例子，所述质粒可包含seq id no：54的核苷酸序列，其中seq id no：54表示其包含seq id no：42的泛素序列和seq id no：44的切割位点序列，并且seq idnos：15、44、17、44、18、44、19、44、20的核苷酸序列顺序连接。

37、本发明的另一方面提供asf疫苗组合物，其包含根据本发明的多肽、多核苷酸或质粒。

38、除非另有说明，asf疫苗组合物中的多肽、多核苷酸和质粒与上述相同。

39、术语“疫苗”是指含有免疫受体的抗原的生物制剂。也就是说，它是指例如通过注射或口服给药给人或动物的免疫原性或抗原性物质，以便为受体提供免疫以预防疾病。

40、所述疫苗可以是dna疫苗。术语“dna疫苗”指的是通过人工复制病原体、病毒等的一些基因并施用它们，从而引起免疫反应的疫苗。这些dna疫苗比现有的蛋白质疫苗有许多优点，包括以下优点：(i)dna疫苗能只用自然目标病原体抗原的遗传信息合成，因此不需要处理危险病原体本身，(ii)只使用诱导毒性所需的一些基因，因此dna疫苗在给受体注射时不会表现出任何意外的毒性，和(iii)由于质粒dna的结构简单，有可能通过对突然发生的各种传染病作出快速反应来开发疫苗。

41、所述asf疫苗组合物可具有保护性免疫力，优选针对asf病毒。

42、本发明的疫苗组合物可包含兽医可接受的载体。术语“兽医可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、免疫佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等。可包含在疫苗组合物中的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、淀粉、甘油、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。此外，本发明的疫苗组合物可以按照常规方法配制成口服剂型，例如粉末、颗粒、片剂、胶囊、悬浮液、乳剂、糖浆、气雾剂等或无菌注射溶液。当配制疫苗组合物时，该组合物可使用任何稀释剂或赋形剂来制备，例如通常使用的填充剂、增补剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等。优选地，可使用聚-l-谷氨酸来帮助稳定。

43、所述疫苗组合物可以以各种形式注射到受体体内。“注射(injection)”可通过选自由皮下注射、肌肉注射、皮内注射、腹腔注射、鼻内给药、静脉注射、经皮给药和口服给药组成的组中的任何一种进行。

44、所述疫苗组合物可包含一种或多种佐剂以改善或增强免疫应答。合适的佐剂包括肽、氢氧化铝、磷酸铝、氧化铝、矿物油如marcol 52、植物油、乳化剂或表面活性物质如溶血卵磷脂、聚阳离子、聚阴离子等。

45、本发明的另一方面提供了在受体中引发对asf病毒的免疫应答的方法，包括：向受体施用本发明的疫苗组合物。

46、除非另有说明，否则引发免疫应答方法中的疫苗组合物具有与上述相同的含义。

47、术语“免疫应答(immune response)”是指宿主的免疫系统响应于抗原的引入而激活。免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或两者的形式。

48、术语“受体”是指包括人类在内的动物，例如，可以是哺乳动物，特别是猪、牛、马、绵羊、山羊、鹿、人等。它可以与个体或宿主互换使用。

49、在引发免疫应答的方法中，所述疫苗组合物可包含有效量的活性成分，即重组多肽、重组多核苷酸或包含他们的质粒，以及药学上可接受的载体和/或佐剂。术语“有效量”是指疫苗成分的量足以诱导接种动物对asf病毒产生特异性免疫应答。有效量可由本领域技术人员容易地确定，例如通过对动物的典型实验。

50、给药可以通过适合于施用dna疫苗的任何途径进行，并且可以例如通过皮下、肌肉、腹腔或静脉注射进行。

51、本发明的另一方面提供了治疗或预防受体asf的方法，包括向受体施用本发明的疫苗组合物、多肽、多核苷酸或质粒。

52、本发明的另一方面提供了用于治疗或预防asf的药物组合物，其包含根据本发明的多肽、多核苷酸或质粒。

53、在根据本发明的用于治疗或预防asf的方法以及用于治疗或预防asf的药物组合物中，除非另有说明，否则每个术语具有与上述相同的含义。

54、术语“防治”或“预防”是指通过施用根据本发明的组合物来抑制或延迟asf的任何作用。此外，术语“诊治”或“治疗”是指通过施用根据本发明的组合物来改善、治愈、改善或部分治疗asf症状的任何行动。

55、发明的效果

56、根据本发明的疫苗组合物可以提供对asf病毒表现出优异保护性免疫力的dna疫苗。特别是，它具有诱导针对asf的细胞免疫应答的非常好的效果。

57、当施用本发明的疫苗组合物时，在接种的受体中产生了显著高水平的抗asf抗体，相应地有效表现出免疫应答，并且获得了抗asf的优异预防效果。