与CD3和FolR1结合的抗体的制作方法

本发明整体涉及例如用于活化t细胞的、与cd3和叶酸受体1(folr1)结合的双特异性抗体。此外，本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生产所述抗体的方法，以及涉及在疾病的治疗中使用所述抗体的方法。

背景技术：

1、在各种临床环境下，通常希望选择性破坏单个细胞或特定细胞类型。例如，癌症疗法的主要目标是特异性地摧毁肿瘤细胞，同时保持健康细胞和组织完好无损。

2、实现这一目标的一种有吸引力的方法是诱导针对肿瘤的免疫应答，以使免疫效应细胞(诸如自然杀伤(nk)细胞或细胞毒性t淋巴细胞(ctl))来攻击和摧毁肿瘤细胞。ctl是免疫系统的最有效的效应细胞，但它们不能被常规治疗性抗体的fc结构域所介导的效应机制激活。

3、在这方面，设计成一条“臂”与靶细胞上的表面抗原结合并且第二条“臂”与t细胞受体(tcr)复合物的活化非变体组分结合的双特异性抗体近年来已引起人们的关注。这种抗体与其两个靶标的同时结合将迫使靶细胞与t细胞之间发生暂时的相互作用，从而活化任何细胞毒性t细胞并随后裂解靶细胞。因此，免疫应答被重新定向至靶细胞，并且与靶细胞的肽抗原呈递或t细胞的特异性无关，其与ctl的正常mhc限制性活化相关。在这种情况下，至关重要的是，ctl仅在靶细胞向它们呈递双特异性抗体时才被激活，即模拟免疫突触。特别期望的是不需要淋巴细胞预处理或共刺激以便引起靶细胞有效裂解的双特异性抗体。

4、cd3作为药物靶点已被广泛探索。靶向cd3的单克隆抗体已被用作自身免疫性疾病(诸如i型糖尿病)的免疫抑制剂疗法，或用于移植排斥的治疗中。1985年，cd3抗体莫罗单抗-cd3(okt3)是第一种获准在临床上用于人类的单克隆抗体。

5、cd3抗体最近的应用是以双特异性抗体形式，其一方面结合cd3，另一方面结合肿瘤细胞抗原。这种抗体与其两个靶标的同时结合将迫使靶细胞与t细胞之间发生暂时的相互作用，从而活化任何细胞毒性t细胞并随后裂解靶细胞。

6、folr1在各种来源(例如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、结直肠癌、子宫内膜癌)的上皮肿瘤细胞上表达。已经描述了几种用治疗性抗体诸如法利珠单抗、抗体药物缀合物或用于肿瘤成像的过继性t细胞疗法靶向folr1的方法(kandalaft等人,j transl med.2012aug 3；10:157.doi:10.1186/1479-5876-10-157；van dam等人,nat med.2011 sep 18；17(10):1315-9.doi:10.1038/nm.2472；clifton等人,hum vaccin.2011 feb；7(2):183-90.epub 2011 feb 1；kelemen等人,int j cancer.2006 jul 15；119(2):243-50；vaitilingam等人,j nucl med.2012 jul；53(7)；teng等人,2012 aug；9(8):901-8.doi:10.1517/17425247.2012.694863.epub 2012 jun 5)。已经进行了一些尝试，以用靶向叶酸受体和cd3的构建体靶向叶酸受体阳性肿瘤(kranz等人,proc natl acad sci u s a.sep26,1995；92(20):9057–9061；roy等人,adv drug deliv rev.2004 apr 29；56(8):1219-31；huiting cui等人,biol chem.aug 17,2012；287(34):28206–28214；lamers等人,int.j.cancer.60(4):450(1995)；thompson等人,mabs.2009 jul-aug；1(4):348-56.epub2009 jul 19；mezzanzanca等人,int.j.cancer,41,609–615(1988))。但是，到目前为止采用的方法有许多缺点。迄今为止所用的分子无法轻松、可靠地生产，因为它们需要化学交联。类似地，杂交分子无法作为人蛋白质大规模生产，而是需要使用大鼠、鼠或其他蛋白质，这些蛋白质在向人施用时具有高免疫原性，因此治疗价值有限。进一步，许多现有分子保留了fcgr结合能力。

7、最近，wo2016/079076描述了靶向cd3和folr1的t细胞活化双特异性抗原结合分子。

8、出于治疗目的，抗体必须满足的一个重要要求是在体外(用于储存药物)和体内(对患者施用之后)有足够的稳定性。

9、如天冬酰胺脱酰胺化等修饰是重组抗体的典型降解，并且可影响体外稳定性和体内生物学功能两者。

10、鉴于抗体，特别是用于活化t细胞的双特异性抗体的巨大治疗潜力，需要具有优化的特性的双特异性cd3/folr1抗体。

技术实现思路

1、本发明提供了与cd3结合的抗体，包括多特异性(例如双特异性)抗体，这些抗体对例如天冬酰胺脱酰胺降解具有抗性，因此特别稳定，满足治疗目的的要求。这些(多特异性)抗体进一步结合了良好的功效和可生产性以及低毒性和有利的药代动力学特性。

2、如本文所示，本发明提供的与cd3结合的抗体(包括多特异性抗体)，相对于在ph6、-80℃下2周后与cd3的结合活性，在ph 7.4、37℃下2周后保留超过约90％的结合活性，如通过表面等离子体共振(spr)所测定。

3、在特定方面，本发明提供了与cd3和叶酸受体1(folr1)结合的双特异性抗体，其相对于在ph 6、-80℃下2周后与cd3的结合活性，在ph7.4、37℃下2周后保留超过约90％的结合活性，如通过表面等离子体共振(spr)所测定。

4、在一个方面，提供了一种与cd3和叶酸受体1(folr1)结合的双特异性抗体，其中该双特异性抗体包含

5、(i)能够与cd3特异性结合的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，该重链可变区包含seq id no:2的重链互补决定区(hcdr)1、seq id no:3的hcdr 2和seq id no:5的hcdr 3，该轻链可变区包含seq id no:8的轻链互补决定区(lcdr)1、seq id no:9的lcdr 2和seq id no:10的lcdr 3；以及

6、(ii)能够与folr1特异性结合的第二抗原结合结构域。

7、在一个方面，提供了一种双特异性抗体，其中第一抗原结合结构域的vh包含与seqid no:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且/或者vl包含与seq id no:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

8、在一个方面，双特异性抗体与cd3和folr1结合，其中双特异性抗体包含

9、(i)能够与cd3特异性结合的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含seq id no:7的vh序列和seq id no:11的vl序列；以及

10、(ii)能够与folr1特异性结合的第二抗原结合结构域。

11、在一个方面，第一抗原结合结构域是fab分子。

12、在一个方面，双特异性抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的fc结构域。

13、在一个方面，双特异性抗体包含能够与folr1特异性结合的第三抗原结合结构域。

14、在一个方面，第二抗原结合结构域和/或在存在时的第三抗原结合结构域为fab分子。

15、在一个方面，第一抗原结合结构域为fab分子，其中fab轻链和fab重链的可变结构域vl和可变结构域vh彼此替换或恒定结构域cl和恒定结构域ch1彼此替换，特别是可变结构域vl和可变结构域vh彼此替换。

16、在一个方面，第二抗原结合结构域和在存在时的第三抗原结合结构域为常规fab分子。

17、在一个方面，第二抗原结合结构域以及在存在时的第三抗原结合结构域为fab分子，其中在恒定结构域cl中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(k)、精氨酸(r)或组氨酸(h)取代(根据kabat编号)，并且位置123处的氨基酸独立地被赖氨酸(k)、精氨酸(r)或组氨酸(h)取代(根据kabat编号)；而在恒定结构域ch1中，位置147处的氨基酸独立地被谷氨酸(e)或天冬氨酸(d)取代(根据kabat eu索引编号)，并且位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(e)或天冬氨酸(d)取代(根据kabat eu索引编号)。

18、在一个方面，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域彼此融合，任选地经由肽接头融合。

19、在一个方面，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域各自为fab分子，并且(i)第二抗原结合结构域在fab重链的c末端处与第一抗原结合结构域的fab重链的n末端融合，或者(ii)第一抗原结合结构域在fab重链的c末端处与第二抗原结合结构域的fab重链的n末端融合。

20、在一个方面，第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域和在存在时的第三抗原结合结构域各自为fab分子，并且双特异性抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的fc结构域；并且其中(i)第二抗原结合结构域在fab重链的c末端与第一抗原结合结构域的fab重链的n末端融合，并且第一抗原结合结构域在fab重链的c末端处与fc结构域的第一亚基的n末端融合，或者(ii)第一抗原结合结构域在fab重链的c末端处与第二抗原结合结构域的fab重链的n末端融合，并且第二抗原结合结构域在fab重链的c末端处与fc结构域的第一亚基的n末端融合；并且第三抗原结合结构域在存在时在fab重链的c末端处与fc结构域的第二亚基的n末端融合。

21、在一个方面，fc结构域是igg，特别是igg1 fc结构域。

22、在一个方面，fc结构域是人fc结构域。

23、在一个方面，fc包含促进fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。

24、在一个方面，fc结构域包含降低与fc受体的结合和/或效应子功能的一个或更多个氨基酸取代。

25、在一个方面，第二抗原结合结构域和在存在时的第三抗原结合结构域包含vh和vl，该vh包含seq id no:124的hcdr 1、seq id no:125的hcdr 2和seq id no:126的hcdr3；该vl包含seq id no:8的lcdr 1、seq id no:9的lcdr 2和seq id no:10的lcdr 3。

26、在一个方面，提供了如上所述的双特异性抗体，其中第二抗原结合结构域和在存在时的所述第三抗原结合结构域包含：vh，其包含与seq id no:123的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或vl，其包含与seq id no:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

27、在一个方面，提供了一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码本发明的双特异性抗体的。

28、在一个方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含分离的多核苷酸。

29、在一个方面，提供了一种生产与cd3和folr1结合的双特异性抗体的方法，其包括以下步骤：(a)在适合表达该双特异性抗体的条件下培养宿主细胞，以及任选地(b)回收该双特异性抗体。

30、在一个方面，提供了一种通过如上所述的方法所生产的与cd3和folr1结合的双特异性抗体。

31、在一个方面，提供了一种药物组合物，其包含：本发明的双特异性抗体，以及药用载体。

32、在一个方面，提供了本发明的双特异性抗体或本发明的药物组合物，其用作药物。

33、在一个方面，提供了本发明的双特异性抗体或本发明的药物组合物，其在癌症的治疗中使用。

34、在一个方面，提供了本发明的双特异性抗体或本发明的药物组合物在制备药物中的用途。

35、在一个方面，提供了本发明的双特异性抗体或本发明的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

36、在一个方面，提供了一种治疗个体的疾病的方法，其包括向所述个体施用有效量的本发明的双特异性抗体或本发明的药物组合物。

37、在一个方面，该疾病是癌症。