胆盐细菌传感器及其在诊断和治疗中的用途

1.本发明涉及医学领域，特别是合成生物学和肝病学。


背景技术：

2.肝脏是协调代谢、解毒和免疫过程的重要器官。包括肝炎、肝硬化、脂肪性肝病和癌症在内的肝病是主要的公共健康问题，需要大规模的筛查方法进行预防、诊断和治疗监测。肝脏活检和基于超声的弹性成像是诊断和监测肝脏疾病进展的最常用方法。然而，这些技术仍然受到复杂基础设施和训练有素的技术人员的限制。肝功能也可以通过定量血清酶活性和胆红素来监测，但当损伤已经发生时，这些标记物是可检测的，并且不是完全特异的。由于缺乏特异性，通常通过同时定量几种酶活性来监测肝功能。血清和尿胆盐是肝功能障碍早期诊断的替代生物标志物，但它们目前的检测方法不切实际且难以推广。
3.wo2018049362公开了胆盐传感器，特别是使用来自费氏弧菌的胆汁传感器蛋白(例如brer和vfa0359)在拟杆菌中的胆盐的转录传感器。


技术实现要素：

4.本发明由权利要求书限定，更具体地，本发明涉及胆盐细菌传感器及其在诊断和治疗目的中的用途。
具体实施方式
5.定义：
6.如本文所用，术语“氨基酸残基”指包括任何天然或合成氨基酸残基，并且主要指表示包含在由20个天然存在的氨基酸组成的组中的氨基酸残基，即，选自由丙氨酸(ala或a)、半胱氨酸(cys或c)、天冬氨酸(asp或d)、谷氨酸(glu或e)、苯丙氨酸(phe或f)、甘氨酸(gly或g)、组氨酸(his或h)、异亮氨酸(ile或i)、赖氨酸(lys或k)、亮氨酸(leu或l)、蛋氨酸(met或m)、天冬酰胺(asn或n)、脯氨酸(pro或p)、谷氨酰胺(gln或q)、精氨酸(arg或r)、丝氨酸(ser或s)、苏氨酸(thr或t)、缬氨酸(val或v)，色氨酸(trp或w)和酪氨酸(tyr或y)残基组成的组。
7.如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指任何长度的氨基酸聚合物。术语还包括已修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、磷酸化或与标记成分结合。在基因治疗的背景下，多肽指的是各自完整的多肽，或其保留了完整蛋白质的所需生化功能的任何片段或基因工程衍生物。
8.如本文所用，术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，并且可以被非核苷酸组分中断。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。本文中使用的术语多核苷酸可互换地指双链和单链分子。除非另有规定或要求，否则本发明所描述的任何多核苷酸的实施方式都包括双链形式和已知或预测
构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
9.如本文所用，术语“同一性”分别指两个多核苷酸或多肽序列的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的精确对应关系。通过比对两个分子之间的序列信息，计算两个比对序列之间的准确匹配数，除以较短序列的长度，并将结果乘以100，可以确定同一性百分比。根据本发明，与第二氨基酸序列具有至少90％同一性的第一氨基酸序列表示第一序列与第二氨基酸序列具有90；91；92；93；94；95；96；97；98；99或100％的同一性。序列同一性通常以同一性百分比(或相似性或同源性)来衡量；百分比越高，两个序列越相似。用于比较的序列比对方法在本领域是公知的。各种程序和比对算法在smith and waterman,adv.appl.math.,2:482,1981；needleman and wunsch,j.mol.biol.,48:443,1970；pearson and lipman,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,85:2444,1988；higgins and sharp,gene,73:237-244,1988；higgins and sharp,cabios,5:151-153,1989；corpet et al.nuc.acids res.,16:10881-10890,1988；huang et al.,comp.appls biosci.,8:155-165,1992；和pearson et al.,meth.mol.biol.,24:307-31,1994中描述。altschul et al.,nat.genet.,6:119-129,1994中给出了序列比对方法和同源性计算的详细思路。例如，校准工具align(myers and miller,cabios 4:11-17,1989)或lfasta(pearson and lipman,1988)可用于执行序列比较(internet1996,w.r.pearson and the university of virginia,fasta20u63 version 2.0u63,发布日期1996年12月)。align将整个序列相互比较，而lfasta将局部相似性区域进行比较。例如，这些校准工具及其各自的教程可在ncsa网站的互联网上获得。或者，对于大于约30个氨基酸的氨基酸序列的比较，可以使用设置为默认参数的默认blosum62矩阵进行blast 2序列函数(空位存在罚分为11，每个残基空位罚分为1)。当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，应使用blast 2序列功能进行比对，使用pam30矩阵设置默认参数(开放空位9，扩展空位1)。blast序列比较系统可从ncbi网站获得；参见altschul et al.,j.mol.biol.,215:403-410,1990；gish.&states,nature genet.,3:266-272,1993；madden et al.meth.enzymol.,266:131-141,1996；altschul et al.,nucleic acids res.,25:3389-3402,1997；和zhang&madden,genome res.,7:649-656,1997。
10.如本文所用，表达“衍生自”是指一种过程，其中第一组分(例如，第一多肽)或来自该第一组分的信息用于分离、衍生或制备不同的第二组分(例如，与第一组分不同的第二多肽)。
11.如本文所用，术语“融合蛋白”是指具有至少两个通常不存在于单个天然多肽中的多肽结构域的单个多肽链。因此，天然存在的蛋白质不是本文所用的“融合蛋白”。优选地，目的多肽(例如tcpp多肽)通过肽键与至少一种异源多肽(例如dna结合结构域)融合，并且融合蛋白还可以包括衍生自分离蛋白的氨基酸部分之间的氨基酸连接区。
12.如本文所用，术语“异源多肽”是指非衍生自与所述异源多肽融合的同一蛋白质的多肽。
13.如本文所用，术语“接头”是指将目的多肽与融合蛋白中的异源多肽连接的至少一种氨基酸的序列。这种接头可用于防止空间位阻。典型地，接头包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、
60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、或70个氨基酸。
14.如本文所用，术语“tcpp”是指霍乱弧菌的毒素协同调节菌毛生物合成蛋白p。tcpp是跨膜转录因子，并且已经表明一组胆盐通过在其胞质结构域中诱导分子间二硫键而引起跨膜转录因子tcpp的二聚化。特别地，tcpp蛋白包括跨膜结构域和周质传感结构域。tcpp的示例性氨基酸序列如seq id no:1所示。
15.seq id no:1》sp|p29485|tcpp_vibch毒素协同调节菌毛生物合成蛋白p os＝血清型o1霍乱弧菌(菌株atcc 39315/el tor inaba n16961)ox＝243277gn＝tcpp pe＝4sv＝2；跨膜结构域用粗体、斜体和下划线表示。周质传感结构域以粗体和双下划线表示。
[0016][0017]
如本文所用，术语“tcph”是指霍乱弧菌的毒素协同调节菌毛生物合成蛋白h。tcph的示例性氨基酸序列如seq id no:2所示。
[0018]
seq id no:2》sp|p29489|tcph_vibch毒素协同调节菌毛生物合成蛋白h os＝血清型o1霍乱弧菌(菌株atcc 39315/el tor inaba n16961)ox＝243277gn＝tcph pe＝4sv＝2
[0019]
mhkklkawggatglfvvalgvtiialpmrqknshgtmiidgtvtqifstyqgnlsnvwltqtdpqgnvvkswttryqtlpdpssqklnlipdysqsnasrdynvlsiyqlgkgcflafpyklltaekmwfscqsdf
[0020]
如本文所用，术语“dna结合结构域”指但不限于可结合特定dna序列(例如基因组dna序列)的基序。dna结合结构域具有至少一个识别并结合单链或双链dna的基序。dna结合结构域可以以序列特异性或非序列特异性的方式与dna相互作用。
[0021]
如本文所用，术语“cadc转录激活剂”在本领域具有其一般含义，并指大肠杆菌的膜整合转录调节器cadc。cadc在较低的外部ph值下激活cadba操纵子的表达，并伴有赖氨酸，提供对轻度酸性胁迫的适应性。cadc是典型的类toxr蛋白，在单个多肽内结合了感官、信号转导和dna结合活性。具体而言，cadc由一个c端胞质周ph传感结构域、一个单跨膜螺旋和一个n端胞质翼螺旋-转向螺旋dna结合结构域组成(buchner s,schlundt a,lassak j,sattler m,jung k.structural and functional analysis of the signal-transducing linker in the ph-responsive one-component system cadc of escherichia coli.j mol biol.2015jul 31；427(15):2548-61.)。cadc通过其c末端周质ph传感域二聚化。因此，表达“大肠杆菌cadc转录激活剂dna结合结构域”是指cadc的细胞质结构域，其能够通过其c端融合结构域的寡聚来恢复其功能。
[0022]
如本文所用，术语“重组”是指两个分离的序列片段的人工组合，例如通过化学合成或通过基因工程技术处理分离的氨基酸片段或核酸片段。
[0023]
如本文所用，术语“表达盒”是指能够在适当的环境中驱动编码并入所述表达盒中的目的多肽的多核苷酸的表达的核酸序列。当引入宿主细胞时，表达盒尤其能够引导细胞的机器将编码目的多肽并入的多核苷酸转录成rna，然后通常进一步处理并最终翻译成目
的多肽。表达盒可以包含在表达载体中，下面将进一步详细描述。随后详细说明根据本发明的表达盒的各个元件。
[0024]
如本文所用，术语“启动子”是指促进目的多核苷酸转录的核酸序列。启动子可操作地与目的多核苷酸连接。启动子也可以形成启动子/增强子元件的一部分。尽管“启动子”和“增强子”元素之间的物理界限并不总是明确，但术语“启动子”通常是指核酸分子上rna聚合酶和/或任何相关因子结合的位点，以及转录起始的位点。增强子在时间和空间上增强启动子活性。现有技术中已知许多启动子在多种细胞类型中具有转录活性。
[0025]
如本文所用，术语“可操作连接”是指2个多核苷酸之间的连接，特别是表达调控序列(例如启动子)和目的多核苷酸之间的连接。
[0026]
如本文所用，术语“载体”是指能够将核酸序列转移至靶细胞的试剂(例如，非病毒载体、颗粒载体和脂质体)。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”是指能够引导目的核酸的表达并且能够将核酸序列转移到靶细胞的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆和表达载体以及病毒载体。
[0027]
如本文所用，术语“宿主细胞”可以是在生产外源多肽或蛋白质中常用的多种细胞中的任何一种，包括原核宿主细胞。
[0028]
如本文所用，术语“益生菌”意指活微生物，它们以足够的量整合，对传统的营养效果以外的健康、舒适和保健产生积极影响。益生菌微生物被定义为“当给予足够的量时，会给宿主带来健康益处的活微生物”(fao/who 2001)。
[0029]
如本文所用，术语“转染”是指通常用于将外源dna导入原核或真核宿主细胞的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、deae-葡聚糖转染等。宿主细胞可以通过本领域技术人员已知的任何常规手段使用本发明的载体进行“转染”。例如，转染可以是瞬时转染。
[0030]
如本文所用，术语“胆盐”在本领域具有一般含义，在肝脏中由胆固醇合成，与甘氨酸或牛磺酸缀合，并与胆固醇和卵磷脂一起在胆汁中分泌。示例性胆汁盐包括二羟基胆酸盐，如脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆碱、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸和牛磺苯脱氧胆碱酸，以及三羟基胆酸，如胆酸、甘胆酸和牛磺胆酸。碱性盐包括钠和钾。在一些实施方案中，胆盐是初级胆盐。示例性的初级胆盐包括二羟基胆酸盐，如鹅去氧胆酸、乙氧胆酸和牛磺苯脱氧胆酸，以及三羟基胆酸，如胆酸、甘胆酸和牛胆酸。
[0031]
如本文所用，术语“输出分子”是指响应于特定信号(如胆盐的存在)而表达的多核苷酸或多肽。
[0032]
如本文所用，术语“治疗性多肽”是指在受试者中发挥治疗作用的任何种类的蛋白质或多肽。术语“治疗性多核苷酸”是指在受试者中发挥治疗作用的任何种类的多核苷酸。
[0033]
如本文所用，本文所用术语“受试者”指任何哺乳动物有机体。术语主题一词包括但不限于人类、非人类灵长类动物，如黑猩猩和其他猿猴物种；农场动物，如牛、羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，如狗和猫；实验动物包括啮齿动物，如小鼠、大鼠和豚鼠等。该术语并不表示特定的年龄或性别。因此，成人和新生儿受试者以及胎儿，无论是男性还是女性，都将被涵盖在内。
[0034]
如本文所用，术语“样品”是指任何体积的液体和悬浮液，其中待测胆盐可以存在于溶液中。
[0035]
如本文所用，术语“肝功能障碍”或“肝功能不全”是指肝功能相对于正常状态降低
的状态。肝功能障碍是肝脏疾病的特征。
[0036]
如本文所用，术语“非酒精性脂肪性肝病”在本领域具有其一般含义，意在指无过度饮酒史的个体的肝细胞中脂肪积累导致的疾病谱。在最温和的形式中，nafld是指肝脂肪变性。nafld一词还意在包括更严重和晚期的非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝硬化、肝细胞癌和病毒诱导的(如hiv、肝炎)脂肪性肝病。
[0037]
如本文所用，术语“药物性肝病”或“毒性肝损伤”用于描述活性剂对肝脏造成损伤的情况。
[0038]
如本文所用，术语“酒精性肝病”或“酒精性肝损伤”是指至少部分由酒精摄入引起的肝细胞脂肪积聚引起的疾病。实例包括但不限于如酒精性单纯性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎(ash)、酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化等疾病。应该注意的是，酒精性脂肪性肝炎也称为酒精性脂肪肝炎，包括酒精性肝纤维化。
[0039]
如本文所用，本发明上下文中的术语“风险”涉及事件将在特定时间段内发生的概率，并且可以表示受试者的“绝对”风险或“相对”风险。绝对风险可以参考相关时间队列的实际观察后测量，或参考相关时间段内已跟踪的统计有效历史队列中得出的指标值来测量。相对风险是指受试者的绝对风险与低风险队列的绝对风险或平均人群风险相比的比率，其可能因临床风险因素的评估方式而异。比值，即给定测试结果中阳性事件与阴性事件的比例，也常用于无转换(比值根据公式p/(l-p)，其中p为事件概率，(1-p)为无事件概率)。在本发明的上下文中，“风险评估”或“风险评价”包括对事件或疾病状态可能发生的概率、几率或可能性、事件的发生率或从一种疾病状态到另一种疾病的转换进行预测。风险评估还可以包括对未来临床参数、传统实验室风险因子值或其他复发指数的预测，无论是相对于先前测量的人群的绝对值还是相对值。本发明的方法可用于对转化风险进行连续或分类测量，从而诊断和定义被称为有转化风险的一类受试者的风险谱。在分类方案中，本发明可用于区分正常受试者和其他风险较高的受试者队列。在一些实施例中，本发明可用于区分处于危险中的人和正常人。
[0040]
如本文所用，术语“肝移植”具有本领域的共同含义，包括部分和全部肝移植，其中供体的肝脏被部分或全部切除，并部分或全部移植到受体体内。部分肝移植按操作模式分为原位部分肝移植、异位部分肝移植等，本发明可应用于其中任何一种。在部分肝移植中，相当于受体正常肝体积的约30-50％的来自供体的肝移植或部分肝移植，通常作为移植物移植到其肝脏已被完全切除的受体中。
[0041]
如本文所用，本文所用的术语“移植排斥”被定义为由于受体表达的主动免疫反应而导致器官的功能和结构退化，并且与器官功能障碍的非免疫学原因无关。移植排斥反应可能是急性或慢性的。本文中使用的术语“急性排斥”是指移植器官在移植后的5-60天后发生的排斥反应。这通常是细胞介导的免疫损伤的表现。据公知，迟发性超敏反应和细胞毒性机制都参与其中。免疫损伤是针对hla，以及可能由管状上皮和血管内皮表达的其他细胞特异性抗原。本文中使用的术语“慢性排斥”是指移植器官在移植后的30-120天后发生的排斥反应。术语“慢性排斥”还指移植后数月或数年发生的免疫损伤(如慢性排斥)和非免疫损伤(例如高血压性肾硬化症或免疫抑制剂如环孢素a的肾毒性)的综合后果，最终导致同种异体移植的纤维化和硬化，与进行性肾功能丧失相关。
[0042]
如本文所用，术语“疗法”或“治疗”是指预防性或预防性治疗以及治疗性或疾病改
变性治疗，包括治疗有感染疾病风险或疑似感染疾病的患者以及患病或被诊断患有疾病或身体状况的患者，并且包括抑制临床复发。该疗法可施用于患有医学疾病或最终可能获得该疾病的患者，以预防、治疗、延迟疾病或复发性疾病的发作、减轻其严重程度或改善其一个或多个症状，或延长患者的生存期，使其超过在没有这种治疗的情况下预期的生存期。“治疗方案”是指疾病的治疗模式，例如治疗期间使用的剂量模式。治疗方案可以包括诱导方案和维持方案。“诱导方案”或“诱导期”是指用于疾病初始治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的总体目标是在治疗方案的初始阶段向患者提供高水平的药物。诱导方案可采用(部分或全部)“负荷方案”，其中可能包括在维持方案期间给予比医生更大剂量的药物，在维持方案中给予比医生更加频繁的药物，或两者兼而有之。词组“维持方案”或“维持期”是指用于在疾病治疗期间维持患者的治疗方案(或治疗方案的一部分)，例如，使患者长期处于缓解状态(数月或数年)。维持方案可采用连续治疗(例如，以定期间隔(例如，每周、每月、每年等)施用药物)或间歇治疗(例如中断治疗、间歇治疗、复发治疗或在达到特定预定标准后的治疗(例如，疼痛、疾病表现等))。
[0043]
如本文所用，术语“有效量”是指原核宿主细胞足以达到有益效果的量。
[0044]
如本文所用，术语“生物传感器装置”在本领域具有其一般含义，是指将传感器和识别分子之间的相互作用转换为信号(如电信号)以测量或检测目标的装置。
[0045]
如本文所用，术语“内切酶”是指在多核苷酸链内裂解磷酸二酯键的酶。一些内切酶，如脱氧核糖核酸酶i，相对非特异性地切割dna(不考虑序列)，而许多内切酶，通常称为限制性内切酶或限制性酶，仅在非常特定的核苷酸序列上切割。基于核酸内切酶的基因组失活的机制通常需要dna单链或双链断裂的第一步，这可以触发dna修复的两种不同的细胞机制，可用于dna失活：易错的非同源末端连接(nhej)和高保真同源定向修复(hdr)。dna靶向内切酶可以是天然存在的内切酶(例如细菌巨核酸酶)，也可以是人工产生的(例如工程巨核酸酶、talens或zfns等)。如本文所用，术语“talen”在本领域具有其一般含义，并指转录激活剂效应核酸酶，一种可用于编辑靶基因的人工核酸酶。如本文所用，术语“zfn”或“锌指核酸酶”在本领域具有其一般含义，并指锌指核酸酶类，一种可用于编辑靶基因的人工核酸酶。如本文所用，术语“crispr相关核酸内切酶”在本领域具有其一般含义，并指相关的簇状规则间隔短回文重复序列，其为含有短重复碱基序列的原核dna片段。
[0046]
如本文所用，术语“食物”是指液体(即饮料)、固体或半固体饮食组合物，尤其是总食物组合物(食物替代物)，其不需要额外的营养摄入或食物补充组合物。如本文所用，术语“食品成分”或“进料成分”包括添加或可添加到功能性食品或食品中作为营养补充剂的配方。所谓“营养食品”或“营养保健”或“功能性”食品，是指含有对健康有益或能够改善生理功能的成分的食品。“食品补充剂”是指以完成正常饮食为目的的食品。
[0047]
多肽：
[0048]
本发明的第一个目的涉及具有seq id no:3所示的氨基酸序列的胆盐传感结构域，其中：
[0049]
x
47
表示n、d、w、y、t、v或f；
[0050]
x
48
表示y或f；
[0051]
x
49
表示e、g、v、i、l、s或k；
[0052]
x
50
表示q、v、h、a、t、d、l或s。
[0053]
seq id no:3胆盐结构域
[0054]
ygqwyqhelagithdlrdlarlpgitiqklseqkltfaidqhqcsv-x
47-x
48-x
49-x
50-ktlectkn
[0055]
在一些实施方案中，胆盐结构域包括表a中公开的seq id:25-33所示的氨基酸序列。
[0056]
在一些实施方案中，胆盐结构域不包含seq id no:24中所述的氨基酸序列。
[0057]
表a：
[0058][0059][0060]
本发明的另一个目的涉及具有seq id no:34所示序列的tcpp多肽，其中：
[0061]
x
47
表示n、d、w、y、t、v或f；
[0062]
x
48
表示y或f；
[0063]
x
49
表示e、g、v、i、l、s或k；
[0064]
x
50
表示q、v、h、a、t、d、l或s。
[0065]
seq id no:34
[0066]
vvpylvfsalyvallpviwws-ygqwyqhelagithdlrdlarlpgitiqklseqkltfaidqhqcsv-x
47-x
48-x
49-x
50-ktlectkn
[0067]
在一些实施方案中，tcpp多肽包含表b中公开的seq id:36-44所示的氨基酸序列。
[0068]
在一些实施方案中，tcpp多肽不包含表b中公开的seq id:35所示的氨基酸序列组成。
[0069]
表b：
[0070]
[0071][0072]
本发明的另一个目的涉及融合蛋白，其中，本发明的tcpp多肽与异源多肽融合。
[0073]
在一些实施方案中，异源多肽可以与本发明的tcpp多肽的n端或c端融合。
[0074]
在一些实施方案中，本发明的tcpp多肽直接或通过接头与异源多肽融合。
[0075]
在一些实施方案中，异源多肽是dna结合域。
[0076]
在一些实施方案中，异源多肽是大肠杆菌cadc转录激活剂dna结合结构域。在一些实施方案中，大肠杆菌cadc转录激活剂dna结合结构域包含与seq id no:45具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0077]
seq id no:45
[0078]
mqqpvvrvgewlvtpsinqisrngrqltleprlidllvffaqhsgevlsrdelidnvwkrsivtnhvvtqsiselrkslkdndedspvyiatvpkrgyklmvpviwy
[0079]
在一些实施方案中，本发明的tcpp多肽通过接头与大肠杆菌cadc转录激活剂dna结合结构域融合。
[0080]
在一些实施方案中，接头由seq id no:46所示的氨基酸序列组成。
[0081]
seq id no:46
[0082]
seeegeeimlsspppipeavpatdspshslniqntatppeqspvkskr
[0083]
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含seq id no:47所示的氨基酸序列，其中：
[0084]
x
47
表示n、d、w、y、t、v或f；
[0085]
x
48
表示y或f；
[0086]
x
49
表示e、g、v、i、l、s或k；
[0087]
x
50
表示q、v、h、a、t、d、l或s。
[0088]
seq id no:47
[0089]
mqqpvvrvgewlvtpsinqisrngrqltleprlidllvffaqhsgevlsrdelidnvwkrsivtnhvv
tqsiselrkslkdndedspvyiatvpkrgyklmvpviwy-seeegeeimlsspppipeavpatdspshslniqntatppeqspvkskr-vvpylvfsalyvallpviwws-ygqwyqhelagithdlrdlarlpgitiqklseqkltfaidqhqcsv-x
47-x
48-x
49-x
50-ktlectkn
[0090]
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含表c中公开的seq id no:48-57所示的氨基酸序列。
[0091]
表c：
[0092]
[0093]
[0094]
[0095][0096]
本文公开的多肽可以通过本领域本身已知的任何技术生产，例如但不限于任何单独或组合的化学、生物、遗传或酶技术。已知所需序列的氨基酸序列，本领域技术人员可以通过生产多肽的标准技术容易地生产所述多肽。例如，它们可以使用众所周知的固相法合成，优选使用市售的肽合成设备(例如由applied biosystems，foster city，california制造的设备)并遵循制造商的说明。或者，本发明的多肽和融合蛋白可以通过本领域已知的重组dna技术合成。例如，在将编码所需(多)肽的dna序列并入表达载体，并将这些载体引入将表达所需多肽的合适的真核或原核宿主中之后，可以获得这些片段作为dna表达产物，随后可以使用公知的技术从中分离。
[0097]
多核苷酸：
[0098]
本发明的另一个目的涉及编码本发明胆盐结构域的多核苷酸。
[0099]
本发明的另一个目的涉及编码本发明的tcpp多肽的多核苷酸。
[0100]
本发明的另一个目的涉及编码本发明融合蛋白的多核苷酸。
[0101]
本发明的另一个目的涉及一种表达盒，其包含编码本发明融合蛋白的多核苷酸，并可操作地与允许在原核宿主细胞中表达的控制序列连接。
[0102]
合适的表达控制序列包括适用于目标宿主生物体的启动子。这种启动子来自原核生物的不同宿主是本领域技术人员所熟知的，并在文献中进行了描述。例如，这种启动子可以从天然存在的基因中分离出来，或者可以是合成的或嵌合的启动子。同样，启动子可以已经存在于靶基因组中，并且将通过本领域已知的合适技术(例如同源重组)与多核苷酸连接。
[0103]
在一些实施方案中，启动子选自p14、p10或p9启动子，其分别具有seq id no:58、seq id no:59和seq id no：60所示的核酸序列。
[0104]
seq id no:58》p14
[0105]
ttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtgga
[0106]
seq id no:59》p10
[0107]
tttcaatttaatcatccggctcgtataatgtgtgga
[0108]
seq id no:60》p9
[0109]
ttgcctcttaatcatcggctcgtataatgtgtgga
[0110]
本发明的表达盒特别表明易于插入至靶多核苷酸如载体或基因组dna中。为此目的，表达盒优选在其5
′‑
和3
′‑
端提供核苷酸序列，以便于其从特定序列位置中移除和插入，例如，由重组酶催化的同源重组的限制性内切酶识别位点或靶序列。
[0111]
载体和宿主细胞：
[0112]
本发明的另一个目的涉及包含本发明的多核苷酸或表达盒的载体，特别是基因工程中常规使用的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。
[0113]
在一些实施方案中，本发明的载体适用于原核宿主细胞的转化。构建重组载体使用本领域技术人员熟知的方法。除了本发明的多核苷酸或表达盒之外，载体还可以含有其他基因，例如标记基因，其允许在合适的宿主细胞中和合适的条件下选择所述载体。通常，
载体还包含一个或多个复制起点。对于基因工程，例如在原核宿主细胞中，可以将本发明的多核苷酸或这些分子的一部分引入质粒中。表达载体已在文献中广泛描述。通常，它们不仅包含选择标记基因和确保在所选宿主中复制的复制起点，还包含细菌启动子，在大多数情况下，还包含转录终止信号。在启动子和终止信号之间，通常存在至少一个限制性位点或多接头，其能够插入编码核苷酸序列。可以使用确保基因组成性表达的启动子和允许有意控制基因表达的诱导性启动子。具有这些特性的细菌启动子序列在文献中有详细描述。文献中充分描述了在微生物(例如大肠杆菌)中表达的调控序列。诱导启动子也是可能的。这些启动子通常导致比组成型启动子更高的蛋白质产量。
[0114]
本发明的另一个目的涉及一种生产能够表达本发明融合蛋白的原核宿主细胞的方法，该原核宿主细胞包括具有本发明的上述多核苷酸、表达盒或载体基因工程化细胞。
[0115]
本发明的另一个目的涉及具有本发明的上述多核苷酸、表达盒或载体基因工程化的原核宿主细胞，以及来自这种转化细胞并含有本发明的多核苷酸、表达盒或载体的细胞，以及通过上述方法可获得的用于产生该多核苷酸、表达盒或载体的细胞。
[0116]
在一些实施方案中，原核宿主细胞选自革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。
[0117]
在一些实施方案中，原核宿主细胞选自非致病细菌。在一些实施方案中，原核宿主细胞选自源自正常内部生态系统(例如细菌群)的细菌。在一些实施方案中，原核宿主细胞选自来源于胃肠道正常内部生态系统的非致病细菌。作为胃肠道正常菌群一部分的非致病细菌的非限制性实例包括拟杆菌属、梭菌属、梭杆菌属、真杆菌属、瘤胃球菌属、消化球菌属、消化链球菌属、双歧杆菌属、埃希氏菌属和乳杆菌属的细菌。
[0118]
在一些实施方案中，原核宿主细胞选自厌氧细菌细胞(例如生长不需要氧气的细胞)。厌氧细菌细胞包括专性厌氧细胞，例如拟杆菌和梭菌属。如在人类中，厌氧细菌细胞最常见于胃肠道。
[0119]
在一些实施方案中，原核宿主细胞选自食品级细菌。在一些实施方案中，原核宿主细胞是益生菌。
[0120]
在一些实施方案中，原核宿主细胞是大肠杆菌。
[0121]
在一些实施方案中，原核宿主细胞以基因工程的方式，使其含有稳定整合到基因组中的引入的多核苷酸。用本发明的多核苷酸或载体转化原核宿主细胞可以通过标准方法进行。例如，氯化钙转染通常用于原核宿主细胞。原核宿主细胞在营养培养基中培养，该培养基满足所用特定原核宿主的要求，特别是ph值、温度、盐浓度、通风、抗生素、维生素、微量元素等方面的要求。
[0122]
在一些实施方案中，原核宿主细胞包含编码具有seq id no:2所示氨基酸序列的tcph多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸与具有seq id no:61所示核酸序列的启动子p5可操作地连接。
[0123]
seq id no:61》p5
[0124]
ttgacaattaatcatccggctcgtaatttatgtgga
[0125]
在一些实施方案中，本发明的原核宿主细胞包含编码输出分子的至少一种其他多核苷酸，其表达受本发明融合蛋白的控制。
[0126]
特别地，胆盐与融合蛋白的结合触发其寡聚，从而允许cadc转录激活剂dna结合结构域的寡聚化，该结构域随后可以激活编码cadba启动子控制下的输出分子的至少一种其
他多核苷酸的表达。
[0127]
因此，本发明的原核宿主细胞进一步包含编码与cadba启动子的输出分子可操作地连接的多核苷酸。cadba启动子的示例性核酸如seq id no:62所示。
[0128]
seq id no:62》pcadba
[0129]
atccattgtaaacattaaatgtttatcttttcatgatatcaacttgcgatcctgatgtgttaataaaaaacctcaagttctcacttacagaaacttttgtgttatttcacctaatctttaggattaatccttttttcgtgagtaatcttatcgccagtttgg
[0130]
在一些实施方案中，输出分子是多肽。
[0131]
在一些实施方案中，输出分子是可通过生物或物理手段检测的检测蛋白。
[0132]
在一些实施方案中，检测蛋白是荧光蛋白。荧光蛋白的出现使得无创细胞内标记成为可能，这种标记很容易通过光学手段检测。维多利亚aequorea victoria的绿色荧光蛋白(gfp)现在是多种生物体中使用最广泛的报告基因。已经开发了具有不同光谱特性的多种变体。在一些实施方案中，原核宿主细胞包括表现出能量转移的荧光蛋白的不同组合，以提供差异荧光。在一些实施方案中，检测蛋白选自发光蛋白。某些细菌(例如，费氏弧菌)具有表达荧光素酶的自诱导发光基因，该基因可引起荧光素的裂解和蓝光的发射。细菌产生信号分子，n-酰基同色内酯(ael)进入细菌细胞并诱导编码ahl合成酶的基因luxi和编码ahl依赖性转录激活剂的基因luxr的转录激活。细胞中足够高浓度的ahl引起与luxr激活剂的结合和发光基因的转录。
[0133]
或者，检测蛋白可以是具有可检测性质并且从细胞分泌的融合蛋白(例如绿色荧光蛋白fv)。因此，分泌可由结合本发明融合蛋白的胆盐触发。在这种情况下，检测蛋白产生过量，而不是与胆盐结合成比例。
[0134]
在一些实施方案中，可以使用特异性结合荧光探针的rna适配体进行检测。探针与适配体的结合增加了其荧光并允许检测基因表达。
[0135]
在一些实施方案中，输出分子是诱导可检测分子或治疗分子表达的转录因子。在一些实施方案中，输出分子是抑制可检测分子或治疗分子表达的抑制因子。
[0136]
在一些实施方案中，输出分子是核酸内切酶。在一些实施方案中，目的转基因产物是核酸内切酶，其提供基因功能的位点特异性敲除，例如，其中核酸内切酶敲除与遗传疾病相关的等位基因。例如，当显性等位基因编码基因的缺陷拷贝时，当野生型为结构蛋白和/或提供正常功能时，位点特异性核酸内切酶可以靶向缺陷等位基因并敲除缺陷等位。除了敲除有缺陷的等位基因外，位点特异性核酸酶还可以用于刺激与供体dna的同源重组，供体dna编码有缺陷等位基因编码的蛋白质的功能拷贝。因此，例如，本发明的原核宿主细胞可用于递送敲除缺陷等位基因的位点的特异性核酸内切酶，并可用于递递缺陷等位蛋白的功能拷贝，从而修复缺陷等位，提供功能蛋白的产生。在一些实施方案中，本发明的dna靶向核酸内切酶是talen。在一些实施方案中，本发明的dna靶向核酸内切酶是zfn。在一些实施方案中，本发明的dna靶向内切酶是crispr相关内切酶。在细菌中，crispr/cas基因座编码rna引导的针对移动遗传元件(病毒、转座元件和结合质粒)的适应性免疫系统。已经确定了三种类型(i-vi)的crispr系统。crispr簇包含间隔物，这些序列与先行移动元件互补。crispr簇被转录并加工成成熟的crispr(簇状的规则间隔的短回文重复序列)rna(crrna)。crispr相关的核酸内切酶cas9和cpf1属于ii型和v型crispr/cas系统，具有较强的切割靶dna的核
酸内切酶活性。cas9由一种成熟的crrna和一种反式激活的小rna(tracrrna)引导，该成熟的crrna-含有约20个独特靶序列的核苷酸(称为间隔物)，该反式激活小rna作为核糖核酸酶iii辅助前crrna加工的引导。crrna:tracrrna双链体通过crrna上的间隔物和靶dna上的互补序列(称为原间隔物)之间的互补碱基配对将cas9引导至靶dna。cas9识别三核苷酸(ngg)原间隔物相邻基序(pam)以指定切割位点(pam的第3或第4个核苷酸)。crrna和tracrrna可以单独表达，也可以通过合成茎环将其工程化为人工融合小引导rna(sgrna)，以模拟天然crrna/tracrrna双链。与shrna一样，这种sgrna可以被合成或体外转录用于直接rna转染或从u6或h1促进的rna表达载体表达。在一些实施方案中，crispr相关核酸内切酶是cas9核酸酶。cas9核酸酶可以具有与野生型产热链球菌序列相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，crispr相关核酸内切酶可以是来自其他物种的序列，例如其他链球菌物种，例如嗜热菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌或其他测序细菌基因组和古细菌，或其他原核微生物。或者，可以修改野生型化脓链球菌cas9序列。核酸序列可以进行密码子优化以在哺乳动物细胞中高效表达，即“人源化”。在一些实施方案中，crispr相关核酸内切酶是cpf1核酸酶。
[0137]
在一些实施方案中，输出分子是治疗分子，特别是治疗多肽或治疗多核苷酸。
[0138]
本发明意义上的治疗性多肽是自然界中存在的蛋白质，例如未修饰的生长因子，或者是设计的治疗性蛋白质，例如天然存在的蛋白质的单链可变片段或其变体。治疗多肽通过不同的愈合机制发挥其生物活性。治疗性多肽不仅是生长因子，也是具有生物活性的其他蛋白质，例如但不限于蛋白酶抑制剂或免疫受体拮抗剂。本发明中使用的治疗性多肽可以在氨基酸序列和蛋白质二级和三级结构上与天然存在的相同，或者可以被修饰或设计用于改善作用。例如，嵌合蛋白可以通过融合不同的治疗多肽而形成。治疗性多肽也是生物活性分子，在自然界中不存在，例如单链可变片段、重组抗体、用作拮抗剂的肽、抗体(例如中和抗体)、纳米体或可溶性受体。在一些实施方案中，治疗多肽是结合肿瘤坏死因子(tnf)或tnf受体的蛋白质、结合整合素或整合素受体的蛋白质或成纤维细胞生长因子19(fgf19)。结合tnf或tnf受体的蛋白质的实例包括adalimumumab(阿达木单抗)、certolizumab(赛妥珠单抗)、golimumab(戈利木单抗)、infliximab(英夫利昔单抗)和抗tnf纳米体。
[0139]
在一些实施方案中，输出分子是多核苷酸，特别是治疗分子。在一些实施方案中，输出分子是核糖核酸(rna)。在一些实施方案中，输出分子是干扰rna(rnai)。
[0140]
其他种类的输出信号包括通过特定的操纵子(如紫罗兰素操纵子，或将色氨酸转化为靛蓝的黄素单氧酶的表达)产生色素，或通过表达外源提供的底物转化为比色产物的酶，如酶β-半乳糖苷酶及其底物x-gal。
[0141]
使用细胞计算领域开发的技术，可以创建具有更高功能水平的更复杂的原核宿主细胞。在这些方法中，细胞充当生化计算机，使用内部逻辑门处理输入(如胆盐结合)以生成输出。已经设计了对多个输入的复杂条件响应，例如，通过在大肠杆菌细胞中实现and、not、or、xor和implies逻辑门。例如，这些门可以使用dna结合蛋白来调节重组载体的表达。可以使用其他系统，例如但不限于基于重组酶的逻辑门、基于核酸的逻辑门或基于蛋白质的逻辑门。关于细胞计算的更多信息，参阅r.weiss,“cellular computation and communications using engineered genetic regulatory networks,”ph.d.thesis,mit,
2001；m.l.simpson et al.,“whole-cell biocomputing,”trends biotechnol.19:317-323(2001)；yaakov benenson.,《biomolecular computing systems:principles,progress and potential》.《nature reviews genetics,13(7):455{468,2012.；bonnet et al.,“amplifying genetic logic gates”science,340(6132):599{603,2013.；brophy jan and voigt ca.《principles of genetic circuit design》.nature methods,11(5):508{520,2014.；其全部通过引用并入本文。
[0142]
诊断方法：
[0143]
本发明的原核宿主细胞构成全细胞生物传感器(“细菌传感器”)，其适用于检测和定量胆盐，特别是初级胆盐。
[0144]
因此，本发明的另一个目的涉及一种用于检测样品中存在的胆盐的方法，包括i)提供至少本发明的原核宿主细胞；b)将所述原核宿主细胞与疑似含有所述胆盐的样品接触足够的时间，以允许融合蛋白结合触发的寡聚，以及随后的检测蛋白的表达；和c)检测所述检测蛋白的表达水平，其中，所述表达水平与所述样品中存在的胆盐的量相关。
[0145]
在一些实施例中，样品是体液样品。在一些实施例中，样品选自由血液样品(包括血清或血浆样品)、尿液样品、脑脊液样品、泪液样品、唾液样品和滑膜样品组成的组。
[0146]
利用本发明的方法，可以在几个数量级的摩尔范围内测量溶解在样品中的胆盐的浓度。
[0147]
对检测蛋白进行分析和检测以定量胆盐，特别是初级胆盐。通常，当检测蛋白是荧光蛋白时，每个细胞上的荧光强度可以通过本领域已知的方法读取，例如流式细胞术、激光扫描细胞术或成像显微镜。以此方式，可以检测每个单个细胞上所有期望波长范围内的荧光强度。然后可以使用标准方法测定样品中胆盐的量或浓度。在一些实施方案中，当细胞与含有已知浓度胆盐的样品组合时，通过测量检测蛋白表达(即其荧光)来构建校准曲线。只要能够构造出可再现的曲线，响应就不必是线性的。然后可以使用校准曲线将测定期间检测蛋白的测量荧光强度与样品中的胆盐浓度相关联。
[0148]
本领域技术人员将理解，本发明的方法可用于生物和非生物样品中胆盐的检测、鉴定和定量，例如医学或兽医科学中的疾病诊断。这些应用可以是商业的(在常规分析的意义上)，也可以是纯粹的研究目的。因为本发明的方法可以使用几乎无限多种形式，所以它能够特异性地检测数千种不同的胆盐。在不破坏整个细胞传感器的情况下，它们可以重复使用。特别地，在体外测定的情况下，本发明的全细胞传感器用作医学诊断和疾病管理。
[0149]
特别地，本发明的全细胞传感器特别适合于诊断受试者的肝功能障碍。
[0150]
因此，本发明的另一个目的涉及一种用于确定受试者是否患有肝功能障碍或处于患有肝功能障碍的风险的方法，包括i)提供至少一种本发明的原核宿主细胞；b)将所述原核宿主细胞与从受试者获得的样品接触足够的时间，以允许融合蛋白结合触发的寡聚，以及随后的检测蛋白的表达；和c)检测所述检测蛋白的表达水平，其中，所述表达水平与所述样品中存在的胆盐的量相关，并且其中所述胆盐的量显示所述受试者是否患有肝功能障碍或处于患有肝功能障碍的风险。
[0151]
许多急性或慢性病理状况会导致肝功能障碍。这些包括但不限于肝脓肿、原发性或转移性肝癌、肝硬化(例如由饮酒引起的或原发性胆汁肝硬化)、阿米巴肝脓肿，自身免疫性肝炎、胆道闭锁、播散性球虫病、门脉高压肝感染(如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型
肝炎病毒，丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒)、血色素沉着症、肝细胞癌、化脓性肝脓肿、雷氏综合征、硬化性胆管炎、威尔逊氏病、药物诱导的肝毒性或暴发性或急性肝衰竭。在一些实施方案中，肝病是非酒精性脂肪性肝病。在一些实施方案中，肝病是药物诱导的肝病。在一些实施例中，肝病是酒精性肝病。
[0152]
在一些实施方案中，肝功能障碍可由病毒感染引起。例如，肝脏参与了嗜肝病毒的感染，这些嗜肝病毒在肝脏中复制，肝脏是其主要靶点。其中包括甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎和戊型肝炎病毒。在所有这些感染中，肝炎和肝功能障碍都是由于肝脏对病毒的免疫反应和修复机制(如纤维化)引起的。此外，由于病毒主要针对其他组织，特别是上呼吸道，肝脏可能会受到广泛宿主感染病毒的影响。病毒的实例包括疱疹病毒(epstein-barr病毒、巨细胞病毒[cmv]和单纯性疱疹病毒)、细小病毒、腺病毒和严重急性呼吸综合征(sars)相关冠状病毒(例如sars-cov-2)。
[0153]
在一些实施例中，本文所述的诊断方法应用于表现出肝功能障碍症状而未进行常规筛查以排除肝功能障碍的所有可能原因的受试者。本文所述的方法可以是对表现出肝功能障碍症状的受试者进行的常规测试的一部分，这些症状例如黄疸、腹痛和肿胀、腿部和脚踝肿胀、皮肤瘙痒、尿液颜色深、大便颜色苍白、大便血色、大便焦油色、慢性疲劳、恶心或呕吐、食欲不振、容易擦伤。除了其他诊断手段之外，还可以执行本发明的方法，这些诊断手段包括超声评估(例如弹性成像)、活检和/或至少一种其他生物标志物的定量，例如血液ast、alt、alp、ttt、ztt、总胆红素、总蛋白、白蛋白、乳酸脱氢酶、胆碱酯酶等的水平。
[0154]
在一些实施例中，受试者接受肝移植。因此，本发明特别适用于确定肝移植受试者是否具有或面临移植排斥的风险。
[0155]
在一些实施例中，本发明的方法特别适合于确定患有肝病的受试者是否实现对治疗的应答。因此，该方法特别适合于区分应答者和非应答者。在本公开的上下文中，应答者是指将实现应答的受试者，即处于缓解状态的受试者，更具体地说，是不患有肝功能障碍的受试者。非应答受试者包括治疗后疾病没有减轻或改善的受试者(例如，肝功能障碍保持稳定或减少)。根据本发明，治疗包括任何适合于治疗肝功能障碍的方法或药物。一些肝脏问题可以通过改变生活方式来治疗，例如停止饮酒或减肥，这通常是包括仔细监测肝脏功能的医疗计划的一部分。每一种肝病都有其特定的治疗方案。例如，甲型肝炎需要支持性护理来维持水分，同时身体的免疫系统对抗并解决感染。胆结石患者可能需要手术切除胆囊。其他疾病可能需要长期的医疗护理来控制和尽量减少其疾病的后果。对于肝硬化和终末期肝病患者，可能需要药物来控制饮食中吸收的蛋白质量。其他例子包括治疗门脉高压所需的手术。
[0156]
本发明的方法特别适用于监测治疗的效率。通常，结合能力的降低(例如，在不同时间间隔进行的测量之间)表明受试者没有获得治疗的应答。相反，结合能力的增加(例如，在不同时间间隔进行的测量之间)表明受试者对治疗有应答。
[0157]
本发明的方法还特别适用于在临床前或临床研究期间评估正在开发的药物在产生肝损伤中的作用。
[0158]
生物传感器：
[0159]
本发明的全细胞传感器还可以转换成生物传感器装置，该生物传感器装置可以使用本发明的整个细胞传感器形成，以部署在微环境或微流体装置中，或者在这些装置的集
合在多芯片模块或分布式无线网络中。生物传感器装置可响应一个或多个特定的化学和/或物理输入(例如热或电流)，产生检测蛋白形式的输出，并通过量热计、电化学或优选荧光生物发光装置与物理换能器通信。因此，生物传感器l可以包括检测部件和换能器部件，该检测部件包括整个传感器单元，该换能器用于将检测部件产生的物理变化或化学变化转换为电信号。根据生物标志物检测的机制，有五种类型的换能器可用于本发明的生物传感器：光学(比色、荧光、发光和干涉)换能器、基于质量的(压电和声波)换能器、基于磁场的换能器，电化学(安培、电势和电导)换能器，和热量换能器。在一些实施方案中，该装置可以包括用于测量另一目标参数的附加测量装置。典型地，该系统包括适于测量生理表型的附加装置。生理表型可以包括生理参数，例如体温、脉搏率、血压、呼吸率、水合状态等。在一些实施方案中，该系统包括输入/输出模块、分析模块和报告生成模块。输入/输出模块被配置为任选地通过相关联的通信设备与附加参数组合地接收胆盐的量。分析模块被配置为分析包括胆盐量的不同参数。报告生成模块被配置为基于对不同参数的分析来生成受试者的简档。在一些实施方案中，该系统包括共享模块，用于基于对所生成的受试者的简档的比较，与一个或多个利益相关者共享一个或更多个预格式化消息。在一些实施方案中，该系统包括向受试者提供建议，以提醒受试者有肝功能障碍的风险。在一些实施方案中，该系统包括能够向外部操作员(例如，医生)发送一个或多个消息，以提醒受试者患有或有患肝功能障碍的风险。因此，在一些实施方案中，该设备包括通信设备。通信设备的示例包括但不限于移动电话、平板电脑、台式计算机等。各种介质可用于连接，包括互联网、内联网、蓝牙、wi-fi等。在一些实施方案中，通信设备与服务器连接。由测量设备测量的一个或多个参数的测量值实际上可以无线传输到包括微处理器的手持设备。手持设备可以是智能手机、平板设备、手机、移动互联网设备、上网本、笔记本、个人数字助理、互联网电话、全息设备、全息电话、有线互联网设备、卫星互联网设备、互联网电视、dsl互联网设备和遥控器。
[0160]
试剂盒：
[0161]
本发明的另一个目的涉及用于执行本文公开的方法的试剂盒。该试剂盒包括一个或多个如上所述的全细胞传感器和用于确定检测蛋白表达水平的装置。也可以在本发明的试剂盒中提供用于特定类型测定的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包括诸如上述生物传感器的装置。此外，试剂盒可以包括各种稀释剂和缓冲剂、标记的缀合物或用于检测特异性免疫复合物的其他试剂。本领域技术人员可以容易地确定试剂盒的其他部件。
[0162]
治疗方法：
[0163]
原核宿主细胞也特别适用于治疗目的。特别地，本发明的工程化原核宿主细胞适于在肠道中操作，并且在到达胆盐存在的肠道微环境时将被特异性激活。所述原核宿主细胞特别适合于在肠道中表达治疗分子(多核苷酸或多肽)。在胆盐，特别是初级胆盐的存在下，可以触发输出治疗分子的表达。
[0164]
因此，本发明的另一个目的涉及在需要治疗的受试者中治疗的方法，包括向受试者施用有效量的本发明原核宿主细胞。
[0165]
可通过本发明方法治疗的疾病的实例包括但不限于肥胖、炎症性肠病、结直肠癌、肝病和肝胆疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病症是消化性溃疡病、肝硬化、炎症性肠病、感染、癌症、血管病症、药物的副作用或凝血病症。在一些实施方案中，受试者患有或有患炎症性肠病的风险。炎症性肠病(ibd)是指小肠和结肠的一组炎症性疾病。在一些实施方
案中，ibd是crohn's疾病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、转移性结肠炎、疾病或不确定性结肠炎。
[0166]
在一些实施方案中，将原核宿主细胞施用到肠道中。
[0167]
在一些实施方案中，本发明的原核宿主细胞被包封，以保护其免受胃损伤。因此，在一些实施方案中，本发明的原核宿主细胞以包封形式配制成组合物，以显著提高其存活时间。在这种情况下，包封的存在尤其可以延缓或阻止原核宿主细胞在胃肠道中的降解。应当理解，本实施方案的组合物可以被封装到肠溶包衣的、延时释放的胶囊或片剂中。肠衣允许胶囊/片剂在通过胃肠道时保持完整(即未溶解)，直到到达肠道。封装活细菌细胞的方法在本领域是公知的(参见例如u.s.patents to general mills inc。例如u.s.pat.no.6,723,358)。例如，可以用肠溶包衣进行封装，肠溶包膜最好是甲基丙烯酸-丙烯酸烷基酯共聚物，如聚合物。聚(甲基)丙烯酸酯已被证明特别适合作为涂料。
[0168]
在一些实施方案中，将本发明的原核宿主细胞以食物组合物的形式给予受试者。在一些实施方案中，食物组合物选自完整的食物组合物、食物补充剂、营养组合物等。本发明的组合物可用作食品成分和/或饲料成分。根据用途和/或施用方式和/或给药方式，食品成分可以是溶液形式或固体形式。食品和食品补充剂组合物是例如发酵乳制品或乳基产品，其优选每日一次或多次口服施用或摄入。发酵乳制品在生产过程中可以直接使用本发明的细菌制备，例如通过使用本身已知的方法添加到食品基料中。在这种方法中，除了通常使用的微生物之外，还可以使用本发明的菌株，和/或可以替代通常使用的一种或多种或部分微生物。发酵乳制品包括乳基产品，例如(但不限于)甜点、酸奶、酸奶饮料、夸克、克菲尔、发酵乳基饮料、酪乳、奶酪、调味料、低脂酱料、新鲜奶酪、大豆饮料、冰淇淋等。或者，食品和/或食品补充剂组合物可以是非乳制品或乳制品非发酵产品(例如，在非发酵乳或其他食品培养基中的菌株或无细胞培养基)。非发酵乳制品可包括冰淇淋、营养棒和调味料等。非乳制品可包括粉状饮料和营养棒等。
[0169]
在一些实施方案中，包含本发明的原核宿主细胞的食品组合物含有至少一种益生元，即旨在促进本发明的原核宿主细胞在肠道中生长的食品物质。益生元可以选自低聚糖，并且任选地含有果糖、半乳糖、甘露糖、大豆和/或菊粉；和/或膳食纤维。
[0170]
在本发明的背景下，给予受试者的原核宿主细胞的量将取决于个体的特征，例如综合健康、年龄、性别、体重。本领域技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。例如，原核宿主细胞应能够产生足以对受试者具有有益影响的菌落。如果原核宿主细胞以食品的形式给药，则每克食品组合物的干重，其通常可包含103至10
12
cfu的本发明的原核宿主细胞。
[0171]
筛选方法：
[0172]
本发明的原核宿主细胞也特别适用于筛选目的。特别地，本发明的原核宿主细胞特别适合于筛选适合于例如抑制病原体信号通路的药物。在这种情况下，该系统是霍乱弧菌毒力激活途径的重组版本。由于该系统是在非致病性原核宿主细胞(如大肠杆菌)中重组的，并且通过检测可检测的输出分子可以很容易地监测其激活，因此该系统可以作为高通量筛选化合物文库的平台，以鉴定可作为治疗剂的霍乱弧菌毒力的新抑制剂(或激活剂)。
[0173]
因此，本发明的另一个目的涉及筛选多种测试物质的方法，包括i)在一定量胆盐的存在下，使本发明的原核宿主细胞群与所述多种测试物质接触，和ii)选择能够调节输出
分子表达的测试物质。
[0174]
本发明的测试物质可选自先前合成的物质的文库，或在数据库中确定其结构的物质的文库，或从头合成的物质的文库。测试物质可选自(a)蛋白质或肽、(b)核酸和(c)有机或化学物质。
[0175]
在一些实施方案中，该方法包括以下步骤：将输出分子(例如检测蛋白)的表达水平与在不存在测试物质的情况下确定的表达水平进行比较，并积极选择提供输出分子表达水平降低或增加的测试物质。
[0176]
本发明将通过以下附图和示例进一步说明。然而，这些示例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
[0177]
附图：
[0178]
图1：将毒力传感重新连接到模块化合成受体平台。
[0179]
从病原体霍乱弧菌分离胆盐感应模块tcpp和tcph的跨膜和周质结构域并将其重新连接到模块化大肠杆菌合成受体平台的示意图。检测胆盐的传感结构域tcpp插入合成受体，当存在胆盐时，该受体激活gfp表达。
[0180]
图2：组成性表达的合成cadc-tcpp-tcph受体平台的系统性能。(a)表达系统的架构。编码由组成型启动子控制的cadc-tcpp和tcph(tcpp为p14、p10、p9，tcph为p5)。(b)不同结构对胆盐(牛磺胆酸)浓度增加的反应。标有符号(δ)的区域表示健康人(4.8
±
0.6μm，δ)、慢性肝病患者(51.3
±
3.8μm、δδ)和药物性肝损伤患者(110
±
3.4μm，
△
δδ)的血清胆盐浓度。(c)在120μm牛磺胆酸存在下测量p14、p10和p9控制的cadc-tcpp的活化倍数。
[0181]
图3：重组tcpp-cadc系统在不同胆盐中的特异性测试。
[0182]
图4：所选tcpp功能变体的tcpp胆盐敏感域牛磺胆酸滴定曲线的敏感性工程。
[0183]
图5：胆盐细菌传感器在临床样品中的应答。(a)临床血清样品中携带合成p9-cadc-tcpp_p5-tcph受体的细菌细胞的应答。(b)临床尿样中携带合成p9-cadc-tcpp_p5-tcph受体的细菌细胞的应答。
[0184]
图6：用于细菌传感器介导的胆盐检测的比色法。利用sv_3-18-lacz传感器表征的tcpp sv_3-3-18变体的胆盐特异性谱。sv_3-3-18-lacz的应答被量化为δa580(在580nm(a580)处有或没有配体胆盐的吸光度差异)。条形图和误差对应于一式三份进行的三次实验的平均值。在流式细胞术分析之前，将指数期生长的细胞与胆盐孵育4小时。
[0185]
图7：临床样本中基于细菌传感器的病理性胆盐检测。将21份临床血清样品的分析结果与tcpp18lacz和胆盐检测试剂盒进行比较。tcpp sv_3-3-18-lacz的响应如左轴黑条所示。胆盐酶测定试剂盒测量的血清总胆盐浓度，用绿色星号(右轴)标记。
[0186]
实施例1：tcpp传感器
[0187]
肝脏是协调代谢、解毒和免疫过程的重要器官。包括肝炎、肝硬化、脂肪性肝病和癌症在内的肝病是主要的公共健康问题，需要大规模的筛查方法进行预防、诊断和治疗监测。肝功能通常通过定量血清酶活性和胆红素来监测，但这些标记物在损伤已经发生时是可检测的，并且不是完全特异的。由于缺乏特异性，通常通过同时定量几种酶活性来监测肝功能。血清和尿液胆盐是早期诊断肝功能不全的替代生物标志物，但它们目前的检测方法不切实际且难以推广。
[0188]
在这里，我们设计了一种基于非致病性大肠杆菌的细菌生物传感器，用于检测临
床样品中胆盐的病理浓度。我们重新利用了霍乱弧菌的细菌单组分tcpp胆盐传感结构域，当病原体进入肠道时，该结构域控制毒力操纵子的激活。我们利用tcpp作为连接到大肠杆菌cadc系统的传感域，设计合成胆盐受体，该系统在二聚化时激活转录(图1)。针对不同选择的启动子分析了该系统的性能(图2a、b)，我们可以证明通过改变胆盐受体的表达水平可以达到精细的可调响应。我们还测试了不同胆盐的系统(图3)。我们测量了细菌传感器对十二种不同胆盐(包括初级和次级)的响应。有趣的是，虽然没有传感模块对单个胆盐物种具有特异性，但cadc-tcpp系统对初级共轭胆盐具有高度特异性，对次级胆盐没有反应。
[0189]
我们旨在确定决定tcpp传感模块敏感性的关键残基，并针对这些残基提高合成受体敏感性和lod。为此，我们将综合诱变与功能筛选和下一代测序(ngs)相结合，这是一种支持识别功能变异体以及局部结构基序内的序列决定因素的方法。tcpp单体之间从分子内二硫键到分子间二硫键的转变是tcpp对胆盐反应的关键决定因素，由两个半胱氨酸残基cys207和cys218介导。通过对不同的tcpp细菌同源物进行多重序列比对(数据未显示)，我们发现这两种半胱氨酸所代表的氨基酸具有显著的保守性(数据未示出)。使用rosetta建模套件(数据未显示)进行的二级结构预测和从头3d预测表明，每个半胱氨酸都位于由asn211和gln214之间的柔性环区分隔的刚性β片材中。这种形成转折的环倾向将允许两个β片材和半胱氨酸靠近并形成分子内二硫键。我们假设cys207和cys218之间的转折区的灵活性是控制两种状态之间转换速率的关键参数，并且改变其氨基酸组成可以改变系统对胆盐的敏感性。
[0190]
因此，我们构建了一个针对转弯内nyek残基的综合的突变库(nnk x 4，理论库复杂性≌1.05x106变型)，并将其克隆到组成型表达cadc-tcpp并响应胆盐产生gfp的质粒中(数据未显示)。用tca诱导产生的文库，并通过荧光激活细胞分选(facs)分离gfp阳性变体。我们进行了三轮富集(第一轮和第二轮选择中200μm的tca作为配体，第三轮选择中20μm的tca作为配体)，并观察到对不同配体浓度(20至80μm)有反应的细胞群比例增加(数据未显示)。我们收集、培养和测序了单个变异体，并测试了它们对tca的反应(数据未显示)。我们发现，对asn210至gln213残基的综合诱变可以改变我们的生物传感器的检测极限、灵敏度和活化倍数。sv_3-3-18和sv_3-3-22之间lod的差异为3.3倍(ec50从28.3到92.5μm)，表明通过突变tcpp传感模块的环路区域获得了广泛的灵敏度工程。进一步的动力学分析表明，该环区的序列变化改变了胆盐与合成受体的反应速度和系统相互作用，与wt-tcpp相比，变异体sv_3-3-18在低配体浓度下的配体效率提高了13倍，反应更快(数据未显示)。
[0191]
为了更好地理解影响tcpp对胆盐反应的序列特征，我们通过下一代测序(ngs)对整个富集变体库进行了测序。令人惊讶的是，功能变体的序列特征与天然tcpp同源物的序列特征不同(数据未显示)。首先，与wt-tcpp同源物相比，我们观察到211位长链带负电荷的氨基酸(asp和glu)以及长链极性氨基酸(asn和gln)的强消耗。211位的赖氨酸在功能性变体中似乎也被耗尽(尽管通常在其他tcpp同源蛋白的该位置发现)。其次，具有大体积芳香侧链(如phe和tyr)和疏水侧链(如leu)的氨基酸在选定的功能变体中高度保守，这强烈表明了c末端环区211位的疏水残基对霍乱弧菌tcpp功能的重要作用。最佳工程变体为sv_3-3-18。
[0192]
通过对tcpp传感器进行多轮定向进化，我们获得了较低检测限和较高灵敏度的变体集合(表1和图4)。最后，我们证明了我们的生物传感器可以检测肝功能障碍患者样本中
的病理性胆盐浓度(图5a、b)。
[0193]
表1：不同变体及其特征列表
[0194][0195][0196]
我们的工作为建立一个敏感、可扩展和价格合理的肝功能障碍筛查平台铺平了道路，该平台可以部署在护理点或家庭环境中，并实现对肝脏相关疾病的大规模监测。这项工作还展示了合成生物学如何帮助应对全球医疗挑战，同时提供破译和靶向基本细胞机制的工具，在这种情况下是病原体信号。
[0197]
实施例2：比色测定
[0198]
比色分析提供了一种简单直观的方法，用于通过肉眼对测试结果进行简单直接的估计。此外，比色分析支持使用智能手机平台直接开发定量分析，用于poc或家庭诊断。我们使用sv_3-318变体与报告β-半乳糖苷酶lacz(称为sv_3-3-18-lacz)及其底物氯酚红-β-d-吡喃半乳糖甙(cprg)偶联，以提供比色输出(数据未显示)。与配备gfp输出的生物传感器类似，sv_3-3-18-lacz系统的胆盐特异性指数从tca略微转移到gcdca(图6)。因此，我们评估了sv_3-3-18-lacz的lod和信号输出阈值对gcdca浓度增加的响应。我们还探索了不同细胞密度和培养时间的影响(数据未显示)。增加细胞密度或培养时间都提高了sv_3-3-18-lacz的动态范围和操作范围；然而，背景信号也增加了。优化后，sv_3-3-18-lacz在1小时内对浓度为0至40μm的gcdca表现出线性响应(数据未显示)。此外，调整细胞密度和孵育时间可使其阈值激活水平与特定肝脏相关疾病相关的各种临床水平相匹配。
[0199]
实施例3：细胞传感器介导的肝移植患者血清胆盐水平升高的检测
[0200]
我们在接受肝移植的患者样本上测试了传感器。肝移植后，主要并发症是胆管狭窄和急性细胞排斥反应。
[0201]
我们在来自肝移植患者的21份临床血清样本中测试了我们的细菌传感器(数据未显示)。这些患者在接受肝移植后在montpellier医院接受了随访，其中大多数患者在过去两年中接受了肝移植。这些患者因酒精相关性肝病或非酒精性脂肪性肝病、慢性胆管炎或
肝癌而接受了终末期肝病的肝移植。进行完整的肝脏检查，并使用酶测定法测量血清胆盐(数据未显示)。我们发现，肝移植后具有急性细胞排斥反应(acr)的可能性较高的患者(血清胆汁酸》37μm)在生物传感器检测中有明显可见的比色信号变化(数据未显示)。三名血清胆盐浓度升高的患者引起了我们的注意。其中两人的肝酶值(asat、alat、ggt、pal和胆红素)出现异常。对于这些患者，胆盐细菌传感器产生了肉眼容易检测到的最强比色变化(图7)。这些结果表明，我们的细菌传感器能够提供一种简单、可靠、有成本效益的方法来监测肝移植后患者的病情。
[0202]
参考文献：
[0203]
在本技术中，各种参考文献描述了本发明所属的技术状态。这些参考文献的公开内容通过引用并入本公开。