本发明涉及通过nhase酶催化来立体选择性制备α氨基酰胺化合物的新型生物催化方法。发明的另一方面涉及新型nhase酶以及进一步改善的nhase酶突变体、编码这些酶的核酸分子、适合制备这类酶及突变体的重组微生物。发明的另一方面涉及制备内酰胺化合物的化学生物催化方法，其包括通过nhase酶催化来制备α氨基酰胺化合物的新催化方法，以及通过应用某些化学氧化催化剂的α氨基酰胺化学氧化，所述催化剂适合在保留其立体化学构型下将α氨基酰胺转变成相应的内酰胺。新型化学生物催化方法特别适合有价值药物化合物的合成，例如尤其是(s)-左乙拉西坦。
背景技术：
：：1、腈水合酶(nhase；ec 4.2.1.84)催化腈水合作用成相应的酰胺[s.prasad,t.c.bhalla,nitrile hydratases(nhases):at the interface of academia andindustry,biotechnol.adv.28(2010)725–741]。能区分两种类型的nhase，即非含咕啉钴和非含血红素铁的nhase。这两种都由α-和β-亚基构成，并且功能性异源表达取决于辅助蛋白的作用[e.t.yukl,c.m.wilmot,cofactor biosynthesis through protein post-translational modification,curr.opin.chem.biol.16(2012)54–59.]。2、成功的异源表达已有描述：nhase，来自产酸克雷伯菌(klebsiella oxytoca)[f.-m.guo,j.-p.wu,l.-r.yang,g.xu,overexpression of a nitrile hydratase fromklebsiella oxytoca kctc 1686in escherichia coli and its biochemicalcharacterization,biotechnol.bioprocess eng.20(2015)995–1004]和芽孢杆菌属(bacillus sp.)rapc[r.a.cameron,m.sayed,d.a.cowan,molecular analysis of thenitrile catabolism operon of the thermophile bacillus pallidus rapc8,biochim.biophys.acta.1725(2005)35–46]，以及热稳定nhase，来自嗜热假单胞菌(pseudomonas thermophile)[a.miyanaga,s.fushinobu,k.ito,t.wakagi,crystalstructure of cobalt-containing nitrile hydratase,biochem.biophys.res.commun.288(2001)1169–1174]和橙色单胞菌(aurantimonasmanganoxydans)[x.pei,h.zhang,l.meng,g.xu,l.yang,j.wu,efficient cloning andexpression of a thermostable nitrile hydratase in escherichia coli using anauto-induction fed-batch strategy,process biochem.48(2013)1921–1927]。pei等人还在其中描述了如果来自橙色单胞菌(m.manganoxydans)的nhase在大肠杆菌中与伴侣蛋白groel/es或dnak/j-grpe共表达，则所表达蛋白以显著更高收率获得。3、在文献中，已经描述了来自不同生物体的对映选择性nhase，如嗜碱硝化菌(nitriliruptor alkaliphilus)、大豆根瘤菌(bradyrhizobium japonicum)和恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)[s.wu,r.d.fallon,m.s.payne,over-production ofstereoselective nitrile hydratase from pseudomonas putida 5b in escherichiacoli:activity requires a novel downstream protein,appl.microbiol.biotechnol.48(1997)704–708；j.l.tucker,l.xu,w.yu,r.w.scott,l.zao,n.ran,chemoenzymatic processes for preparation of levetiracetam,wo2009009117,2009；s.van pelt,m.zhang,l.g.otten,j.holt,d.y.sorokin,f.vanrantwijk,g.w.black,j.j.perry,r.a.sheldon,probing the enantioselectivity of adiverse group of purified cobalt-centred nitrile hydratases,org.biomol.chem.9(2011)3011]。4、(s)-选择性腈水合酶已经描述于wo2009009117的左乙拉西坦(3)生成的上下文中，然而，在外消旋2-(2-氧代吡咯烷-1-基)-丁腈(7)的经典酶动力学拆分(ekr)中，5、6、仅导致最高50％的理论收率(4)。7、本发明解决的第一个问题是提供新型合成方法，允许生成左乙拉西坦(4)和相关内酰胺，尤其是收率提高。8、本发明解决的另一个问题是发现(s)-选择性nhase能够使用2-(2-吡咯烷-1-基)-丁腈(1)，尤其是(s)-1作为底物。9、本发明解决的另一个问题是发现稳健的(s)-选择性nhase，以用于这类新方法。10、本发明仍解决的另一个问题是提供显示改善的特性的这类nhase酶突变体。更特定地，这类改善突变体应显示改进，如改善的对映选择性和/或改善的底物转化。技术实现思路1、尚未描述(s)-2-(吡咯烷-1-基)丁酰胺((s)-2)型杂环α氨基酰胺和具有环状叔氨基的结构上相关的杂环化合物的生物催化合成。2、本发明基于以下意外发现：可通过对映选择性(s)-腈水合酶以较高收率从相应的外消旋腈(rac-1)(或从相关腈)获得(s)-2-(吡咯烷-1-基)丁酰胺((s)-2)(或相关酰胺化合物)(方案1)。与wo2009009117所述的现有技术方法相反，本发明人意外观察到起始材料(rac-1)的动态动力学拆分(dkr)。在外消旋腈与其化学组分吡咯烷、丙醛和hcn之间形成平衡的合适条件下观察到(rac-1)的外消旋作用。由此，通过(s)-nhase作用从外消旋混合物中移出的(s)-1，经外消旋反应连续补充，最终产生高于50％的产品收率。3、4、方案1.(s)-左乙拉西坦(4)的化学酶反应途径。5、允许底物(rac)-1外消旋作用的反应条件在本发明之前是未确定的。6、与本发明nhase的底物相反，本领域的外消旋含氧底物2-(2-氧代吡咯烷-1-基)-丁腈(7)不允许外消旋作用，因为其不分解且不形成与其各组成物的平衡，所以不允许外消旋底物的dkr，而仅是动力学拆分。7、首先，建立nhase组，其包含17个co型和4个fe型nhase。19种腈水合酶在适用条件下以可溶形式表达且显示甲基丙烯腈水合作用的活性。7个候选物能够转化rac-1；co型ctnhase、konhase和nanhase以及fe型ghnhase、pknhase、pmnhase和pknhase。对这7个nhase更详细表征。8、温度和ph研究显示，co型nhase比fe型nhase更稳定。尤其是ctnhase对升高的温度和ph值更耐受。ctnhase是co型nhase中最有前景的酶，不仅仅是因为其高稳定性。野生型显示就(s)-2形成而言已有84％的ee值。9、最佳fe型nhase是ghnhase，其具有出色的rac-1转化水平，然而，稳定性和对映选择性低于ctnhase。最终，出于下列原因选择ctnhase用于突变实验：其趋向(s)-2的对映选择性高，它处理高底物浓度优于ghnhase，不受丙醛抑制且它的高起始稳定性对于突变研究是有利的。10、应用理性工程化改造以特异性改变ctnhase的底物结合袋。使用结构生物学方法，鉴定了对接的产物(docked product)内的氨基酸残基。通过位点饱和库靶向所有未参与金属结合或反应机制的位置：αq93、αw120、αp126、αk131、αr169、βm34、βf37、βl48、βf51和βy68。在液体试验中，对提高的(s)-2生成每个库筛选约200个克隆。βm34中的取代产生对映选择性增强的克隆，βf51突变体显示转化和ee值都增加。构建这2个位置的组合突变体，但未能获得进一步改善。最适当的理性设计突变体是ctnhase-βf51l，对于150mm rac-1的水合作用趋向(s)-2生成34.2％的2以及91.5％的对映体过量。11、4种沿着酶活性位点排列的序列延伸，通过随机工程化改造靶向。在β1:βl48、βf51和βg54区域发现对rac-1水合作用产生最有益影响的残基。就α1和α2、αv110i和αp121而言，每种延伸分别仅发现一个有益氨基酸交换。β2:βh146l/βf167y区域中显示有利的组合突变体。α亚基中的改变主要影响酶活性，β亚基中的氨基酸交换对于对映选择性有强烈影响。然而，对映选择性极高的突变体大多显示低转化水平。12、以我们所有关于关键残基的知识，更详细地来研究位置αp121、βl48和βf51，构建28ctnhase组合突变体。当βl48中的氨基酸交换彼此组合时，筛选rac-1转化发现了有极高对映选择性的ctnhase突变体。通过处于97.6％高对映体过量的ctnhase-αp121t/βl48r达到多至67％的rac-1转化。组合βg54c、βg54r或βg54v的突变体ctnhase-βl48p达到≥99.8％的极高ee值，在有额外丙醛的反应中转化率大于35.7％。这个成功可能主要归因于在筛选中使用(s)-选择性酰胺酶。当前第1页12当前第1页12