用于单细胞高通量靶标测序的方法和组合物与流程

本技术主要涉及分子生物学。更具体地说，本文提供了包括用于高通量单细胞靶标测序的方法、组合物、试剂盒和系统。

背景技术：

1、单细胞转录组技术得到了迅速发展。然而，目前的技术无法完全揭示转录组表达谱的完整性和复杂性。

技术实现思路

1、提供了包括用于单细胞靶向测序的方法、组合物和试剂盒，包括但不限于单细胞t细胞受体的核酸序列的高通量检测、宿主细胞中表达病毒序列的高通量检测、单细胞中癌症可成药突变(例如肺癌可成药突变)的检测以及单细胞靶向区和全转录组的同时检测。

2、本文公开的方法包括用于单细胞分析的方法。在一些实施方案中，一种用于单细胞分析的方法包括：将细胞和附着有多个条形码寡核苷酸的珠粒分配到分区中。多个条形码寡核苷酸的各条形码寡核苷酸可以包括细胞条形码和独特的分子标签(umi)，其中多个条形码寡核苷酸中的第一条形码寡核苷酸各自可以包括能够结合至第一信使核糖核酸(mrna)靶标的poly-a尾的poly-dt序列。多个条形码寡核苷酸的第二条形码寡核苷酸各自包括poly-dt序列和探针序列。探针序列是非poly-dt序列。探针序列能够在非poly-a序列的序列处与第二rna靶标结合。该方法可以包括将分区中的附着在珠粒上的第一条形码寡核苷酸和第二条形码寡核苷酸与rna靶标杂交，rna靶标与分区中的细胞相关。该方法可以包括逆转录与第一条形码寡核苷酸和第二条形码寡核苷酸杂交的rna靶标，以产生条形码互补脱氧核糖核酸(cdna)。该方法可以包括扩增条形码cdna。该方法可以包括分析扩增的条形码cdna或其产物。

3、在一些实施方案中，分析扩增的条形码cdna包括对扩增的条形码cdna进行测序以获得测序信息。在一些实施方案中，分析扩增的条形码cdna包括：使用测序信息中具有与rna靶标相关的不同序列的多个umi来确定一个或一个以上rna靶标中各自的表达谱。分析扩增的条形码cdna可以包括使用测序信息中具有与第二rna靶标相关的不同序列的多个umi来确定第二rna靶标的表达谱。表达谱可以包括绝对丰度或相对丰度。在一些实施方案中，分析扩增的条形码cdna包括：确定包括具有不同序列的umi的一个或一个以上rna靶标中各自的扩增的条形码cdna的数量。分析扩增的条形码cdna可以包括：确定包括具有不同序列的umi的第二rna靶标中的扩增的条形码cdna的数量。分析扩增的条形码cdna可以包括：确定包括具有不同序列的umi的第二rna靶标或其部分的扩增的条形码cdna的序列。

4、本文公开的方法包括用于单细胞测序的方法。在一些实施方案中，用于单细胞测序的方法包括将多个细胞和多个珠粒共分配到多个分区中。多个分区的分区各自可以包括多个细胞的单个细胞和多个珠粒的单个珠粒。多个分区的分区中的珠粒各自可以附着有多个条形码寡核苷酸。多个条形码寡核苷酸的各个条形码寡核苷酸可以包括(i)细胞条形码，(ii)独特的分子标签(umi)，和(iiia)poly-dt序列和/或(iiib)探针序列。poly-dt序列能够结合至第一核酸靶标的poly-a区。探针序列是非poly-dt序列。探针序列能够结合至第二核酸靶标。该方法可以包括使用分区中的附着在珠粒上的第一条形码寡核苷酸和第二条形码寡核苷酸使与分区的各个分区中的细胞相关联的核酸靶标条形码化，以产生条形码核酸。该方法可以包括对条形码核酸或其产物进行测序以获得测序信息。

5、本文公开的方法包括一种单细胞测序方法。在一些实施方案中，一种单细胞测序方包括将多个细胞和多个珠粒共分配到多个分区中。多个分区的分区各自可以包括多个细胞的单个细胞和多个珠粒的单个珠粒。多个分区的分区中的珠粒各自可以附着有多个条形码寡核苷酸。多个条形码寡核苷酸的各个条形码寡核苷酸可以包括(i)细胞条形码和(ii)独特的分子标签(umi)。该方法可以包括使用(a)延伸引物和/或探针序列、以及(b)分区中附着在珠粒上的第一条形码寡核苷酸和第二条形码寡核苷酸，使与分区的各个分区中的细胞相关的核酸靶标条形码化以产生条形码核酸。poly-dt序列能够结合至第一核酸靶标的poly-a区。探针序列是非poly-dt序列。探针序列能够结合至第二核酸靶标。可以将分区中的附着在珠粒上的第一条形码寡核苷酸和第二条形码寡核苷酸用作模板转换寡核苷酸，用于使核酸靶标条形码化。该方法可以包括对条形码核酸或其产物进行测序，以获得测序信息。

6、在一些实施方案中，核酸靶标包括核糖核酸(rna)、信使rna(mrna)和/或脱氧核糖核酸(dna)。核酸靶标可以包括细胞的核酸靶标、来自细胞的核酸靶标、细胞内的核酸靶标(其可在细胞裂解后从细胞中释放)和/或细胞表面的核酸靶标。

7、在一些实施方案中，该方法包括在使与细胞相关的核酸靶标条形码化之前从细胞中释放核酸。该方法包括裂解细胞以从细胞中释放核酸。

8、在一些实施方案中，使与细胞相关的核酸条形码化包括：将在分区的各个分区中附着在珠粒上的第一条形码寡核苷酸和第二条形码寡核苷酸与分区中的细胞相关联的核酸靶标杂交。使与细胞相关的核酸条形码化可以包括：使用核酸作为模板延伸附着在珠粒上并杂交至核酸靶标的第一条形码寡核苷酸和第二条形码寡核苷酸，以产生单链条形码核酸。使与细胞相关的核酸条形码化可以包括：从单链条形码核酸产生双链条形码核酸。延伸单链条形码核酸包括使用转换寡核苷酸的模板进一步延长单链条形码核酸。

9、在一些实施方案中，该方法包括在延伸第一条形码寡核苷酸和第二条形码寡核苷酸之前汇集珠粒。该方法可以包括在产生双链条形码核酸之前汇集珠粒。在一些实施方案中，延伸附着至珠粒并杂交至核酸靶标的第一条形码寡核苷酸和第二条形码寡核苷酸包括批量延伸附着至珠粒并杂交至核酸靶标的第一条形码寡核苷酸和第二条形码寡核苷酸。产生双链条形码核酸可以包括从单链条形码核酸批量产生双链条形码核酸。在一些实施方案中，该方法包括在延伸第一条形码寡核苷酸和第二条形码寡核苷酸以产生单链条形码核酸之后，汇集珠粒。该方法可以包括在产生双链条形码核酸之后汇集珠粒。在一些实施方案中，延伸附着在珠粒上并杂交至核酸靶标的第一条形码寡核苷酸和第二条形码寡核苷酸包括在分区中延伸附着在珠粒上并杂交至核酸靶标的第一条形码寡核苷酸和第二条形码寡核苷酸。产生双链条形码核酸可以包括由分区中的单链条形码核酸产生双链条形码核酸

10、在一些实施方案中，该方法包括扩增条形码核酸以产生扩增的条形码核酸。扩增条形码核酸可以包括使用聚合酶链式反应(pcr)扩增条形码核酸以产生扩增的条形码核酸。该方法可以包括处理扩增的条形码核酸以产生处理后的条形码核酸。对条形码核酸测序可以包括对处理后的条形码核酸测序。

11、在一些实施方案中，处理扩增的条形码核酸包括：将扩增的条形码核酸片段化以产生片段化的条形码核酸。将扩增的条形码核酸片段化可以包括对扩增的条形码核酸进行酶切片段化以产生片段化的条形码核酸。处理扩增的条形码核酸可以包括加入第二聚合酶链式反应(pcr)引物结合序列。第二pcr引物结合序列可以包括read 2序列。处理扩增的条形码核酸包括由片段化的条形码核酸产生包括测序引物序列的处理后的条形码核酸。测序引物序列包括p5序列和p7序列。

12、在一些实施方案中，该方法包括分析测序信息。在一些实施方案中，分析测序信息包括：使用在测序信息中具有与核酸靶标相关联的不同序列的多个umi来确定与细胞相关联的核酸靶标的一个或一个以上核酸靶标中各自的表达谱。分析测序信息可以包括使用测序信息中具有与第二核酸靶标相关联的不同序列的多个umi来确定第二核酸靶标的表达谱。分析测序信息可以包括确定与具有不同序列的umi相关的第二核酸靶标或其部分的序列。表达谱可以包括绝对丰度或相对丰度。表达谱可以包括rna表达谱、mrna表达谱和/或蛋白质表达谱。

13、在一些实施方案中，对条形码核酸或其产物的测序包括对条形码核酸的产物测序以获得测序信息，条形码核酸的产物各自包括p5序列、read 1序列、细胞条形码、umi、poly-dt序列、探针序列、核酸靶标或其部分的序列，read 2序列、样本索引(sample index)和/或p7序列。

14、在一些实施方案中，分区为液滴或微孔。多个分区可以包括微孔阵列的多个微孔。多个分区可以包括至少1000个分区。

15、在一些实施方案中，多个分区的至少50％的分区包括多个细胞中的单个细胞和多个珠粒中的单个珠粒。多个分区的最多10％的分区可以包括多个细胞中的两个或两个以上细胞。多个分区的最多10％的分区可以不包括多个细胞中的细胞。多个分区的最多10％的分区可以包括多个珠粒的两个或两个以上珠粒。多个分区的最多10％的分区可以不包括多个珠粒的珠粒。

16、在一些实施方案中，poly-dt序列的长度为至少10个核苷酸的长度。探针序列的长度可以为至少10个核苷酸的长度。在一些实施方案中，多个条形码寡核苷酸的第一条形码寡核苷酸各自包括poly-dt序列。poly-dt序列能够结合至第一核酸靶标的poly-a区。在一些实施方案中，附着在多个珠粒的珠粒上的多个条形码寡核苷酸的第一条形码寡核苷酸的poly-dt序列是相同的。附着在多个珠粒上的第一条形码寡核苷酸的poly-dt序列可以是相同的

17、在一些实施方案中，多个条形码寡核苷酸的第二条形码寡核苷酸各自包括探针序列。探针序列是非poly-dt序列。探针序列能够结合至第二核酸靶标。

18、在一些实施方案中，多个条形码寡核苷酸的第二条形码寡核苷酸各自包括poly-dt序列和探针序列。探针序列是非poly-dt序列。探针序列能够结合至第二核酸靶标。在一些实施方案中，多个条形码寡核苷酸的第二条形码寡核苷酸包括探针序列，该探针序列是非poly-dt序列。探针序列能够结合至相同的第二核酸靶标。在一些实施方案中，多个条形码寡核苷酸的第二条形码寡核苷酸包括探针序列，该探针序列是非poly-dt序列。探针序列能够结合至不同的第二核酸靶标。

19、在一些实施方案中，多个条形码寡核苷酸的条形码寡核苷酸的探针序列包括简并序列。简并序列的长度可以至少为3。简并序列可以跨越或对应于突变。在一些实施方案中，多个条形码寡核苷酸的条形码寡核苷酸的探针序列跨越目的区域。在一些实施方案中，其中探针序列与目的区域相邻。

20、目的区域可以包括t细胞受体(tcr)的可变区。tcr是tcr-α或tcr-β。在一些实施方案中，目的区域包括突变。在一些实施方案中，突变包括插入、删除或置换。置换可以包括单核苷酸变体(snv)或单核苷酸多态性(snp)。突变可以与癌症有关。

21、在一些实施方案中，附着在多个珠粒的珠粒上的多个条形码寡核苷酸的两个条形码寡核苷酸的细胞条形码包括相同的序列。附着在多个珠粒的两个珠粒上的两个条形码寡核苷酸的细胞条形码可以包括不同的序列。各个条形码寡核苷酸的细胞条形码长度可以至少为6个核苷酸。

22、在一些实施方案中，附着在多个珠粒的珠粒上的两个条形码寡核苷酸的umi可以包括不同的序列。附着在多个珠粒的两个珠粒上的两个条形码寡核苷酸的umi可以包括相同的序列。各个条形码寡核苷酸的umi长度可以至少为6个核苷酸。

23、在一些实施方案中，多个条形码寡核苷酸的各条形码寡核苷酸包括第一聚合酶链式反应(pcr)引物结合序列。第一pcr引物结合序列可以包括read 1序列。

24、在一些实施方案中，多个条形码寡核苷酸的条形码寡核苷酸可逆地附着在珠粒上、共价地附着在珠粒上、或不可逆地附着在珠粒上。在一些实施方案中，珠粒为凝胶珠粒。凝胶珠粒在施加刺激时可以是可降解的。刺激可以包括热刺激、化学刺激、生物刺激、光刺激或其组合。在一些实施方案中，珠粒为固体珠粒。珠粒可以是磁珠。

25、在一些实施方案中，不同的第二核酸靶标的数量至少为10。在一些实施方案中，第二核酸靶标包括t细胞受体(tcr)或其rna产物(例如mrna)。探针序列能够结合至tcr的恒定区或其部分。tcr可以是tcrα或tcrβ。在一些实施方案中，细胞为癌细胞。第二核酸靶标是癌症基因或其rna产物(例如mrna)。

26、在一些实施方案中，细胞感染了病毒。第二核酸靶标是病毒的基因或其核酸产物(例如rna)。病毒可以是rna病毒。第二核酸靶标可以包括病毒基因的rna。因此该方法可以确定细胞的转录组谱和病毒的核酸(例如rna)谱。

27、在一些实施方案中，第二核酸靶标包括非poly-a尾和/或非poly-a区。在一些实施方案中，第二核酸靶标包括poly-a区。poly-a区可以是poly-a尾。

28、在一些实施方案中，杂交至第二条形码寡核苷酸(或使用第二条形码寡核苷酸条形码化)的第二核酸靶标的分子丰度高于杂交至第一条形码寡核苷酸(或使用第一条形码寡核苷酸条形码化)的第二核酸靶标的分子丰度。因此，该方法可以富集第二核酸靶标。

29、在一些实施方案中，第二核酸靶标的分子丰度包括第二核酸靶标分子的出现次数。在一些实施方案中，第二核酸靶标的分子丰度包括相对于第一条形码寡核苷酸的数值或第二条形码寡核苷酸的数值的第二核酸靶标的分子的出现次数。

30、在一些实施方案中，该方法包括使用一种或一种以上富集引物富集一种或一种以上的第二核酸靶标。富集第二核酸靶标包括使用富集引物组套富集第二核酸靶标。组套可以是可定制的组套。

31、本文的公开包括用于单细胞测序或单细胞分析的组合物。在一些实施方案中，用于单细胞测序或单细胞分析的组合物包括本公开的多个珠粒。附着在各个多个珠粒上的多个条形码寡核苷酸的细胞条形码可以是相同的。附着在多个珠粒的不同珠粒上的条形码寡核苷酸的细胞条形码可以是不同的。多个珠粒可以包括至少100个珠粒。

32、本文的公开包括用于单细胞测序或单细胞分析的试剂盒。在一些实施方案中，用于单细胞测序或单细胞分析的试剂盒包括含有本公开的多个珠粒的组合物。试剂盒可以包括使用组合物进行单细胞测序或单细胞分析的说明书。

33、本文的公开包括一种产生包括条形码寡核苷酸的珠粒的方法。在一些实施方案中，产生包括条形码寡核苷酸的珠粒的方法包括：提供各自附着有多个寡核苷酸条形码上的多个珠粒。多个条形码寡核苷酸的各个条形码寡核苷酸可以包括细胞条形码、独特的分子标签(umi)和poly-dt序列。该方法可以包括将非poly-dt序列且能够结合核酸靶标的探针序列添加到多个条形码寡核苷酸的各个条形码寡核苷酸的3'端。

34、在一些实施方案中，添加探针序列包括将探针序列化学添加到多个条形码寡核苷酸的各个条形码寡核苷酸的3'端。在一些实施方案中，添加探针序列包括使用酶将探针序列添加到多个条形码寡核苷酸的各个条形码寡核苷酸的3'端。在一些实施方案中，酶为连接酶。添加探针序列可以包括使用连接酶将包含探针序列的探针寡核苷酸连接到多个条形码寡核苷酸的各个条形码寡核苷酸的3'端。在一些实施方案中，酶为dna聚合酶。添加探针序列可以包括使用dna聚合酶在多个条形码寡核苷酸的各个条形码寡核苷酸的3'端合成探针序列。

35、本文的公开包括一种产生包括条形码寡核苷酸的珠粒的方法，在一些实施方案中，产生包括条形码寡核苷酸的珠粒的方包括：提供各自附着有多个寡核苷酸条形码上的多个珠粒。多个条形码寡核苷酸的各个条形码寡核苷酸可以包括细胞条形码和独特的分子标签(umi)。方法可以包括向多个条形码寡核苷酸的各个条形码寡核苷酸的3'端添加(i)poly-dt序列和/或(ii)探针序列，探针序列是非poly-dt序列并且能够结合至核酸靶标。

36、本文的公开包括在单细胞水平上分析tcr序列的方法。例如，该方法可以包括：(a)用结合有探针序列的oligo-dt引物从单个细胞中捕获rna，探针序列与tcr rna序列结合；(b)用oligo-dt引物和tcr识别序列将rna逆转录为cdna；(c)扩增cdna；(d)扩增tcr序列；以及(e)分析扩增的cdna。在一些实施方案中，引物序列还包括充当标识各个单个细胞的细胞条形码的序列；可用作pcr引物结合序列的序列，所述pcr引物用于扩增cdna。

37、在一些实施方案中，引物序列包括可用于定量cdna的独特的分子索引(umi)序列。在一些实施方案中，通过使用酶添加探针序列。在一些实施方案中，探针序列以化学方式添加。在一些实施方案中，酶是连接酶，以向oligo-dt的3'添加特定序列。在一些实施方案中，酶是dna聚合酶，以向polyt的3'添加特定序列。在一些实施方案中，靶标富集方法是pcr。在一些实施方案中，用于靶标富集的pcr退火为tcr可变区域。在一些实施方案中，分析方法是测序。

38、本文的公开包括在单细胞水平上分析病毒序列的方法。例如，该方法可以包括：(a)用结合有探针序列的oligo-dt引物从单个细胞中捕获rna，探针序列与病毒rna序列结合；(b)用oligo-dt引物和病毒识别序列将rna逆转录为cdna；(c)扩增cdna；以及(d)分析扩增的cdna。

39、在一些实施方案中，引物序列还包括充当标识各单个细胞的细胞条形码的序列；可用作pcr引物结合序列用于扩增cdna的序列。在一些实施方案中，引物序列包括可用于定量cdna的独特的分子索引(umi)序列。在一些实施方案中，通过使用酶添加探针序列。在一些实施方案中，探针序列以化学方式添加。在一些实施方案中，酶是连接酶，以向磁捕获珠粒添加特定序列。在一些实施方案中，酶是dna聚合酶，以向磁捕获珠粒添加特定序列。在一些实施方案中，病毒rna序列可以来源于任何rna病毒。在一些实施方案中，分析方法是测序。

40、本文的公开包括在单细胞水平上分析靶区的方法。例如，该方法可以包括：(a)用结合有探针序列的oligo-dt引物从单个细胞中捕获rna，探针序列与靶序列结合；(b)用oligo-dt引物和靶向特异性引物将rna逆转录为cdna；(c)扩增cdna；(d)分析扩增的cdna；和(e)用特异性引物富集靶序列。

41、在一些实施方案中，oligo-dt引物序列还包括充当标识各单个细胞的细胞条形码的序列；可用作用于扩增cdna的pcr引物结合序列的序列。在一些实施方案中，oligo-dt引物序列包括可用于定量cdna的独特的分子索引(umi)序列。在一些实施方案中，通过使用酶添加探针序列。在一些实施方案中，探针序列以化学方式添加。在一些实施方案中，酶是连接酶，用于向磁捕获珠粒添加特定序列。在一些实施方案中，酶是dna聚合酶，以向磁捕获珠粒添加特定序列。在一些实施方案中，靶序列可以来源于任何rna。在一些实施方案中，分析方法是测序。在一些实施方案中，靶基因将通过定制组套富集。