根结线虫抗性基因的制作方法

1.本发明涉及提供对根结线虫的抗性的核酸分子，包括所述核酸分子的茄科抗根结线虫植物，以及用于鉴定植物中所述核酸分子的存在的方法。本发明还涉及一种生产这种植物的方法以及用于鉴定和选择这样的植物的方法。本发明还涉及茄科的根结线虫抗性植物的种子。


背景技术：

2.种植茄科植物时遇到的问题之一是出现各种植物寄生线虫。已经鉴定出针对某些线虫物种的一些抗性基因，这些抗性通过育种被引入到合适的品种中。这使得种植者即使在生产过程中存在某种线虫也能获得良好的产量。然而，通常会发现新的线虫或已知线虫的新株，在某些情况下它们会破坏可供利用的抗性。例如，在番茄(solanum lycopersicum)中，已知的mi1-2抗性基因赋予对某些线虫的抗性，但不赋予对根结线虫
‑‑
象耳豆根结线虫(meloidogyne enterolobii,m.enterolobii)的抗性。本发明所涉及的线虫终生使用植物根，因此根结线虫如象耳豆根结线虫的感染导致根瘿，它们会导致被感染植株死亡或者产率降低。
3.令人惊讶的是，在广泛的研究后发现，nbs-lrr基因，本文称为mer1(象耳豆根结线虫抗性1，meloidogyne enterolobii resistant 1)在根中表达，并负责对茄科植物中的根结线虫抗性。


技术实现要素：

4.本发明涉及编码mer1蛋白的核酸分子，当其存在于茄科植物，特别是番茄植物中时，能够赋予对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性，其中所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
5.a)包含根据seq id no.2、3、4、5、6、7、8或9的编码序列或者与根据seq id no.2、3、4、5、6、7、8或9所述序列按增加的优先顺序具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
6.b)编码具有根据seq id no.10、11、12、13、14、15、16或17的氨基酸序列的蛋白质或者具有与根据seq id no.10、11、12、13、14、15、16或17所述氨基酸序列按增加的优先顺序有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列。
7.本发明特别涉及编码mer1蛋白的核酸分子，当其存在于茄科植物、特别是番茄植物中时，赋予对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性，其中所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
8.a)包含根据seq id no.2的编码序列或者与根据seq id no.2所述序列按增加的优先顺序具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
9.b)编码具有根据seq id no.10的氨基酸序列的蛋白质或者具有与根据seq id no.10所述氨基酸序列按增加的优先顺序有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；或者
10.a)包含根据seq id no.3的编码序列或者与根据seq id no.3所述序列按增加的优先顺序具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
11.b)编码具有根据seq id no.11的氨基酸序列的蛋白质或者具有与根据seq id no.11所述氨基酸序列按增加的优先顺序有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；或者
12.a)包含根据seq id no.4的编码序列或者与根据seq id no.4所述序列按增加的优先顺序具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
13.b)编码具有根据seq id no.12的氨基酸序列的蛋白质或者具有与根据seq id no.12所述氨基酸序列按增加的优先顺序有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；或者
14.a)包含根据seq id no.5的编码序列或者与根据seq id no.5所述序列按增加的优先顺序具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
15.b)编码具有根据seq id no.13的氨基酸序列的蛋白质或者具有与根据seq id no.13所述氨基酸序列按增加的优先顺序有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；或者
16.a)包含根据seq id no.6的编码序列或者与根据seq id no.6所述序列按增加的优先顺序具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
17.b)编码具有根据seq id no.14的氨基酸序列的蛋白质或者具有与根据seq id no.14所述氨基酸序列按增加的优先顺序有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；或者
18.a)包含根据seq id no.7的编码序列或者与根据seq id no.7所述序列按增加的优先顺序具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
19.b)编码具有根据seq id no.15的氨基酸序列的蛋白质或者具有与根据seq id no.15所述氨基酸序列按增加的优先顺序有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；或者
20.a)包含根据seq id no.8的编码序列或者与根据seq id no.8所述序列按增加的优先顺序具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
21.b)编码具有根据seq id no.16的氨基酸序列的蛋白质或者具有与根据seq id no.16所述氨基酸序列按增加的优先顺序有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；或者
22.a)包含根据seq id no.9的编码序列或者与根据seq id no.9所述序列按增加的优先顺序具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
23.b)编码具有根据seq id no.17的氨基酸序列的蛋白质或者具有与根据seq id no.17所述氨基酸序列按增加的优先顺序有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列。
24.在导致本发明的研究期间，在野生番茄物种、特别是在醋栗番茄(solanum pimpinellifolium)植物中已经发现了包含具有根据seq id no:1的基因组序列的核酸分子的mer1基因。当这种核酸分子被转移到对根结线虫敏感的番茄植物中时，番茄植物变成对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫有抗性。因此，mer1基因能够编码对茄科植物赋予针对根结线虫的抗性的蛋白质。特别地，mer1基因能够编码对番茄(solanum lycopersicum)植物赋予针对象耳豆根结线虫的抗性的蛋白质。包含seq id no:1的基因组序列导致8种不同的同工型，其包含选自seq id no:2、3、4、5、6、7、8和9的编码序列(cds序列)。这些同工型是该基因的不同剪接变体。在剪接后，包含本发明的mer1基因的seq id no:1的基因组序列产生这8种不同的同工型，所述同工型包含选自seq id no:2、3、4、5、6、7、8和9的本发明mer1基因的编码序列(cds序列)。这些cds序列编码包含选自seq id nos 10、11、12、13、14、15、16和17的氨基酸序列的蛋白质；seq id no.2编码具有包含seq id no.10的氨基酸序列的mer1蛋白，seq id no.3编码具有包含seq id no.11的氨基酸序列的mer1蛋白，seq id no.4编码具有包含seq id no.12的氨基酸序列的mer1蛋白，seq id no.5编码具有包含seq id no.13的氨基酸序列的mer1蛋白，seq id no.6编码具有包含seq id no.14的氨基酸序列的mer1蛋白，seq id no.7编码具有包含seq id no.15的氨基酸序列的mer1蛋白，seq id no.8编码具有包含seq id no.16的氨基酸序列的mer1蛋白，以及seq id no.9编码具有包含seq id no.17的氨基酸序列的mer1蛋白。
25.在导致本发明的研究期间，发现本发明的mer1基因与另一种称为nrc6的抗性基因一起分离。番茄植物的基因组可包含一个或多个nrc6基因，本文称为nrc6-2a、nrc6-2b等。核酸分子nrc6-2a、nrc6-2c、nrc6-2b、nrc6-3和nrc6-1a是nrc6基因的等位基因，其编码当与本发明的mer1基因一起存在时促进茄科植物对根结线虫的抗性的蛋白质。包含根据seq id no.18的基因组序列的核酸分子nrc6-2a编码当与本发明的mer1基因一起存在时促进茄科植物对根结线虫的抗性的蛋白质。本发明的nrc6-2a等位基因的cds序列包含seq id no.19并且编码具有包含seq id no:20的氨基酸序列的nrc6蛋白。包含根据seq id no.21的基因组序列的核酸分子nrc6-2c编码当与本发明的mer1基因一起存在时促进茄科植物对根结线虫的抗性的蛋白质。本发明的nrc6-2c等位基因的cds序列包含seq id no.22并且编
码具有包含seq id no:23的氨基酸序列的nrc6蛋白。包含根据seq id no.24的cds序列的核酸分子nrc6-2b编码具有包含seq id no:25的氨基酸序列的nrc6蛋白，其在与本发明的mer1基因一起存在时促进茄科植物对根结线虫的抗性。包含根据seq id no.26的cds序列的核酸分子nrc6-3编码具有包含seq id no:27的氨基酸序列的nrc6蛋白，其在与本发明的mer1基因一起存在时促进茄科植物对根结线虫的抗性。包含根据seq id no.28的cds序列的核酸分子nrc6-1a编码具有包含seq id no:29的氨基酸序列的nrc6蛋白，其在与本发明的mer1基因一起存在时促进茄科植物对根结线虫的抗性。
26.本发明还涉及编码nrc6蛋白的核酸分子，其在与如上所述的编码mer1蛋白的核酸分子一起存在于茄科植物、特别是番茄植物中时，有助于对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性，其中所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
27.a)包含根据seq id no.19的编码序列或者与根据seq id no.19的序列具有98％、优选99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
28.b)编码具有根据seq id no.20的氨基酸序列的蛋白质或者具有与根据seq id no.20的氨基酸顺序有98％、优选99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列。
29.在又一个实施方案中，本发明涉及编码nrc6蛋白的核酸分子，其在与如上所述的编码mer1蛋白的核酸分子一起存在于茄科植物、特别是番茄植物中时，有助于对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性，其中所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
30.a)包含根据seq id no.22的编码序列或者与根据seq id no.22的序列具有98％、优选99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
31.b)编码具有根据seq id no.23的氨基酸序列的蛋白质或者具有与根据seq id no.23的氨基酸顺序有98％、优选99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列。
32.在又一个实施方案中，本发明涉及编码nrc6蛋白的核酸分子，其在与如上所述的编码mer1蛋白的核酸分子一起存在于茄科植物、特别是番茄植物中时，有助于对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性，其中所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
33.a)包含根据seq id no.24的编码序列或者与根据seq id no.24的序列具有98％、优选99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
34.b)编码具有根据seq id no.25的氨基酸序列的蛋白质或者具有与根据seq id no.25的氨基酸顺序有98％、优选99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列。
35.在又一个实施方案中，本发明涉及编码nrc6蛋白的核酸分子，其在与如上所述的编码mer1蛋白的核酸分子一起存在于茄科植物、特别是番茄植物中时，有助于对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性，其中所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
36.a)包含根据seq id no.26的编码序列或者与根据seq id no.26的序列具有98％、优选99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
37.b)编码具有根据seq id no.27的氨基酸序列的蛋白质或者具有与根据seq id no.27的氨基酸顺序有98％、优选99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列。
38.在又一个实施方案中，本发明涉及编码nrc6蛋白的核酸分子，其在与如上所述的编码mer1蛋白的核酸分子一起存在于茄科植物、特别是番茄植物中时，有助于对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性，其中所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
39.a)包含根据seq id no.28的编码序列或者与根据seq id no.28的序列具有98％、
优选99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
40.b)编码具有根据seq id no.29的氨基酸序列的蛋白质或者具有与根据seq id no.29的氨基酸顺序有98％、优选99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列。
41.本发明的核酸分子mer1和nrc6各编码nbs-lrr蛋白，该蛋白也称为nlr蛋白，其包含核苷酸结合位点和富含亮氨酸的重复结构域。最近的研究表明，植物中的nbs-lrr蛋白经常相互通信以诱导对病原体的免疫应答，因此在植物基因组中存在所谓的“传感器”nbs-lrr蛋白，它们检测病原体，并且在病原体效应器与传感器nlr结合后需要“辅助”nbs-lrr来诱导免疫应答。茄科植物的基因组包含许多nbs-lrr蛋白，网络非常复杂。因此，很难预测nbs-lrr蛋白是辅助蛋白还是传感器蛋白，以及哪种nbs-lrr辅助蛋白与哪种nbs-lrr传感器蛋白相互作用。最近，adachi等人((2019)an n-terminal motif in nlr immune receptors is functionally conserved across distantly related plant species；elife.27；8)已经发现，所谓的辅助nlr蛋白包含特定的基序：mada基序(seq id no:30)。当分析nrc6的序列时，发现编码的蛋白质包含mada基序，因此可以表征为辅助nlr蛋白质。mer1蛋白不包含所述基序，因此可以被认为是能够与辅助nlr蛋白通信的传感器nlr蛋白的候选者。
42.本发明还涉及茄科植物，特别是番茄植物，其包含编码mer1蛋白的核酸分子，所述mer1蛋白当存在于茄科植物中时赋予对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性，其中所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
43.a)包含根据seq id no.2、3、4、5、6、7、8或9的编码序列或者与根据seq id no.2、3，4、5，6、7、8或9所述序列按增加的优先顺序具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
44.b)编码具有根据seq id no.10、11、12、13、14、15、16或17的氨基酸序列的蛋白质或者具有与根据seq id no.10、11、12、13、14、15、16或17所述氨基酸序列按增加的优先顺序有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；
45.和任选地至少一种编码nrc6-2a蛋白的核酸分子，其中所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
46.a)包含根据seq id no.19的编码序列或者与根据seq id no.19的序列具有98％、优选99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
47.b)编码具有根据seq id no.20的氨基酸序列的nrc6-2a蛋白或者具有与根据seq id no.20的氨基酸顺序有98％、优选99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；
48.和/或编码nrc6-2c蛋白的核酸分子，其中所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
49.a)包含根据seq id no.22的编码序列或者与根据seq id no.22的序列具有98％、优选99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
50.b)编码具有根据seq id no.23的氨基酸序列的nrc6-2c蛋白或者具有与根据seq id no.23的氨基酸顺序有98％、优选99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；
51.和/或编码nrc6-2b蛋白的核酸分子，其中所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
52.a)包含根据seq id no.24的编码序列或者与根据seq id no.24的序列具有98％、优选99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
53.b)编码具有根据seq id no.25的氨基酸序列的nrc6-2b蛋白，或者具有与根据seq id no.25的氨基酸顺序有98％、优选99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；
54.和/或编码nrc6-3蛋白的核酸分子，其中所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
55.a)包含根据seq id no.26的编码序列或者与根据seq id no.26的序列具有98％、优选99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
56.b)编码具有根据seq id no.27的氨基酸序列的nrc6-3蛋白或者具有与根据seq id no.27的氨基酸顺序有98％、优选99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；
57.和/或编码nrc6-1a蛋白的核酸分子，其中所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
58.a)包含根据seq id no.28的编码序列或者与根据seq id no.28的序列有98％、优选99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
59.b)编码具有根据seq id no.29的氨基酸序列的nrc6-1a蛋白或者具有与根据seq id no.29的氨基酸顺序有98％、优选99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列。
60.特别地，本发明涉及茄科植物，特别是番茄植物，其包含编码mer1蛋白的核酸分子，当存在于茄科植物中时，该mer1蛋白赋予对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性，其中所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
61.a)包含根据seq id no.2、3、4、5、6、7、8或9的编码序列或者与根据seq id no.2、3、4、5、6、7、8或9所述序列按增加的优先顺序具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
62.b)编码具有根据seq id no.10、11、12、13、14、15、16或17的氨基酸序列的蛋白质或者具有与根据seq id no.10、11、12、13、14、15、16或17所述氨基酸序列按增加的优先顺序有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；
63.和编码nrc6-2a蛋白的核酸分子，其中所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
64.a)包含根据seq id no.19的编码序列或者与根据seq id no.19的序列具有98％、优选99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
65.b)编码具有根据seq id no.20的氨基酸序列的nrc6-2a蛋白或具有与根据seq id no.20的氨基酸序列有98％、优选99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；
66.和编码nrc6-2c蛋白的核酸分子，其中所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
67.a)包含根据seq id no.22的编码序列或与根据seq id no.22的序列具有98％、优选99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
68.b)编码具有根据seq id no.23的氨基酸序列的nrc6-2c蛋白或具有与根据seq id no.23的氨基酸序列有98％、优选99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列。
69.本发明还涉及茄科植物，特别是番茄植物，其包含编码如本文所述的mer1蛋白的核酸分子以及如本文所述、选自nrc6-2a、nrc6-2c、nrc6-2b、nrc6-3和nrc6-1a的一个nrc6
基因，所述mer1蛋白当存在于茄科植物中时赋予对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性。
70.本发明还涉及茄科植物，特别是番茄植物，其包含编码如本文所述的mer1蛋白的核酸分子以及如本文所述、选自nrc6-2a、nrc6-2c、nrc6-2b、nrc6-3和nrc6-1a的两个nrc6基因，所述mer1蛋白当存在于茄科植物中时赋予对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性。
71.本发明还涉及茄科植物，特别是番茄植物，其包含编码如本文所述的mer1蛋白的核酸分子以及如本文所述、选自nrc6-2a、nrc6-2c、nrc6-2b、nrc6-3和nrc6-1a的三个nrc6基因，所述mer1蛋白当存在于茄科植物中时赋予对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性。
72.本发明还涉及茄科植物，特别是番茄植物，其包含编码如本文所述的mer1蛋白的核酸分子以及如本文所述、选自nrc6-2a、nrc6-2c、nrc6-2b、nrc6-3和nrc6-1a的四个nrc6基因，所述mer1蛋白当存在于茄科植物中时赋予对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性。
73.本发明还涉及茄科植物，特别是番茄植物，其包含编码如本文所述的mer1蛋白的核酸分子以及如本文所述、选自nrc6-2a、nrc6-2c、nrc6-2b、nrc6-3和nrc6-1a的五个nrc6基因，所述mer1蛋白当存在于茄科植物中时赋予对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性。
74.茄科植物可以是番茄(solanum lycopersicum)、辣椒(capsicum annuum)、茄子(solanum melongena)、马铃薯(solanum tuberosum)或烟草(nicotiana tabacum)物种的植物。
75.优选地，本发明还涉及一种番茄植物，该植物包含一种或多种如上文所定义的nrc6等位基因，所述等位基因在与本发明的mer1核酸分子一起存在于所述植物中时会促进对象耳豆根结线虫的抗性。在本技术中，术语番茄和solanum lycopersicum可互换使用。
76.本发明的表型以显性方式遗传。如本文所使用的，显性意味着当本发明的核酸分子杂合存在于植物中时，所述植物对根结线虫的抗性水平与本发明核酸分子在植物中纯合存在的情况相同。纯合地具有本发明核酸分子的番茄植物可以从以ncimb 43515保藏的种子中生长得到。这些植物表现出对象耳豆根结线虫的抗性。
77.包含本发明的mer1基因和两个nrc6等位基因(nrc6-2a和nrc6-2c)的番茄植物可以从其代表性样品以保藏号ncimb 43515保藏在ncimb中的种子生长而来。
78.对根结线虫的抗性的存在可以通过实施例1中所述的生物测定来确定。通过计算卵块数来确定番茄植物对象耳豆根结线虫的抗性。将要测试的番茄(solanum lycopersicum)植物播种在温室的托盘中，2周后将植物转移到装满沙土混合物的660cc花盆中。dometica rz被引入试验中作为易感对照植物，将从保藏物ncimb 43515的种子生长而来的植物引入试验中作为阳性对照。在根部旁边，用1ml移液管尖端钻孔，并用1ml悬浮液填充，所述悬浮液包含每株植物500个第二期幼象耳豆根结线虫(j2)接种物。接种后，植物在生长室(23℃，14小时光照)中生长，每周浇水三次。接种六周后，将植物从土壤中取出，并用自来水冲洗根部。对卵块进行计数，并根据表2所示的症状进行评分。当使用根据表2的评分时，对象耳豆根结线虫有抗性的番茄植株的评分为0、1或2，优选为0或1。
79.本发明的植物任选地是具有改进的、使其适合商业栽培的农艺特性的栽培植物。因此，这是一种农业上优良的植物。本发明还涉及从本发明植物收获的茄科植物的果实，其中所述果实在其基因组中包含本发明的核酸分子，所述核酸分子在所述植物中导致对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性。这种水果在本文中也称为“本发明的水果”。优选地，所述果实是番茄植物的番茄果实。
80.本发明涉及包含本发明核酸分子的茄科植物的砧木(rootstock)或接穗(scion)。所述砧木或接穗可用于嫁接过程中，以培育显示本发明表型的茄科嫁接植物，所述嫁接植物也是本发明的部分。在一个实施例中，本发明还涉及一种砧木，其由属于茄科不同物种的植物之间的种间杂交产生的，其中所述种间杂交的一个亲本植物优选是包含本发明核酸分子的番茄属物种的植物，另一个亲本选自下述中：野生番茄(solanum arcanum)、契斯曼尼番茄(solanum cheesmaniae)、智利番茄(solanum chilense)、克梅留斯基番茄(solanum chmielewskii)、多腺番茄(solanum corneliomulleri)、solanum galapagense、多毛番茄(solanum habrochaites)、solanum huaylasense、胡桃叶茄(solanum juglandifolium)、樱桃番茄(solanum lycopersicum cerasiforme)、类番茄茄(solanum lycopersicoides)、小花番茄(solanum neorickii)、赭黄茄(solanum ochrantum)、潘那利番茄(solanum pennellii)、秘鲁番茄(solanum peruvianum)、细叶番茄(solanum pimpinellifolium)和里基茄(solanum sitiens)。
81.本发明还涉及本发明植物在嫁接过程中的用途，其中本发明植物在嫁接过程中可以用作接穗或优选用作砧木。嫁接过程中使用的另一植物可以是茄科的任何植物，并且优选属于茄属。
82.本发明涉及一种生产对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫有抗性的茄科植物的方法，包括将本发明的核酸分子引入所述植物中。
83.当植物性相容时，本发明的核酸分子可以通过通常使用的育种技术(例如杂交和选择)从包含所述核酸分子的另一种植物中引入。这样的引入可以来自通常容易杂交的同一物种的植物，也可以来自相关物种的植物。杂交的困难可以通过本领域已知的技术来克服，例如胚胎拯救或顺式发生。用于鉴定核酸分子的合适方法用于跟踪核酸分子向另一植物的掺入。
84.或者，本发明的核酸分子可以例如通过使用转基因方法从另一种性不相容的植物转移或引入。可适当使用的技术包括本领域技术人员已知的一般植物转化技术，例如使用农杆菌介导的转化方法。基因组编辑方法如crispr/cas系统的使用也可用于获得本发明的植物。crispr/cas系统可以例如包含cas9、cpf1、cms1、mad7、c2c2、casx和/或casy蛋白。
85.本发明还涉及本发明的植物，其纯合或杂合地包含导致对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性的本发明的核酸分子，所述植物是近交系的植物、杂种、双倍单倍体或分离群体的植物。优选地，本发明的植物是非转基因植物。
86.本发明还涉及包含本发明的核酸分子的茄科植物的种子，其中由所述种子生长的茄科的植物是本发明的植物，其抗根结线虫，特别是抗象耳豆根结线虫。优选地，所述植物是番茄植物。本发明还涉及由本发明植物生产的种子，其中所述种子含有本发明的核酸分子，因此，由所述种子生长的植物是本发明的植物。
87.此外，本发明还涉及包含本发明的水果或其部分的食品或加工食品。食品可能已
经经历了一个或多个加工步骤。这种加工步骤可以包括但不限于以下处理或其组合中的任何一种：去皮、切割、洗涤、榨汁、烹饪、冷却。加工食品也可以是包含本发明果实的沙拉混合物。所述果实是茄科植物的果实，特别是辣椒、茄子、土豆和番茄。优选地，所述果实是本发明的番茄果实。所获得的加工形式也是本发明的一部分。
88.本发明还涉及适合于生产本发明植物的繁殖材料，其中所述繁殖材料适合于有性繁殖，并且特别选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞；或者适合于营养繁殖，并且特别选自切割、根、茎、细胞、原生质体；或适于再生细胞的组织培养，并且特别选自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、根尖、花药、花、种子、砧木和茎；其中由所述繁殖材料产生的所述植物包含赋予对根结线虫的抗性、优选对象耳豆根结线虫的抗性的本发明的核酸分子。本发明的植物可用作繁殖材料的来源。
89.本发明还涉及包含本文所定义的本发明核酸分子的细胞。本发明的细胞可以从本发明的植物中获得或存在于本发明的植株中。这样的细胞可以是分离的形式，或者是完整植物的一部分，或者来自其一部分，并且仍然构成本发明的细胞，因为这样的细胞包含编码对本发明的栽培植物赋予针对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性的蛋白质的核酸分子。本发明植物的每个细胞携带编码对植物赋予针对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性的蛋白质的核酸分子。本发明的细胞也可以是可再生成本发明的新植物的可再生细胞。
90.本发明还涉及本发明植物的植物组织，其包含本发明的核酸分子。该组织可以是未分化的组织或已经分化的组织。未分化的组织例如是茎尖、花药、花瓣、花粉，并且可以用于微繁殖以获得生长成本发明新植物的新植株。该组织也可以由本发明的细胞生长而来。
91.本发明还涉及本发明植物的组织培养物，其也是繁殖材料，并且在其基因组中包含本发明的核酸分子。组织培养物包括可再生细胞。这种组织培养物可以选自或衍生自植物的任何部分，特别是叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、根尖、花药、花、种子、茎或砧木。所述组织培养物可以再生成包含本发明核酸分子的本发明植物，其中所述再生植物表达对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性，并且也是本发明的一部分。
92.本发明还涉及本发明植物在植物育种中的用途。因此，本发明还涉及一种用于开发本发明的栽培植物的育种方法，所述栽培植物对根结线虫、特别是对象耳豆根结线虫具有抗性，其中使用包含本发明的核酸分子的植物，所述核酸分子用于对另一植物赋予所述抗性。优选地，用于植物育种的本发明植物是番茄植物。能够用于植物育种以开发对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫具有抗性的另一植物的植物代表性的番茄(solanum lycopersium)种子以登录号ncimb 43515保藏于ncimb。
93.本发明还涉及本发明的核酸分子用于开发对根结线虫具有抗性的植物的用途。优选地，所开发的植物是对象耳豆根结线虫具有抗性的番茄植物。
94.本发明还涉及对植物测试其基因组中是否存在本发明核酸分子的方法，包括检测植物基因组中本发明的核酸分子的存在情况。
95.对植物测试其基因组中是否存在编码赋予对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性的蛋白质的本发明核酸分子的方法任选地进一步包括选择包含所述核酸分子的植物作为对根结结线虫具有抗性的植物。
96.本发明涉及一种用于选择抗根结线虫茄科植物、特别是番茄植物的方法，其中所
述选择包括确定本发明核酸分子在茄科植物基因组中的存在情况，以及如果所述植物包含本发明的核酸分子，则选择所述植物。其中鉴定到所述核酸分子的植物随后被选为抗根结线虫的植物。在一个实施方案中，所述根结线虫是象耳豆根结线虫，其可通过实施例1中所述的生物测定来检测。通过这种方法获得的所选植物也是本发明的一部分。本发明还涉及一种用于选择携带本发明核酸分子的茄科植物、特别是番茄植物的方法，其中包括测定本发明的核酸分子的存在情况，这是通过测定植物基因组中其基因组核苷酸序列或其功能性部分而进行的，其中所述序列与选自由seq id no.1、18和21组成的组的seq id no按增加的优先顺序有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。
97.本发明还涉及一种用于选择携带本发明的核酸分子的茄科植物、特别是番茄植物的方法，其中包括测定本发明的核酸分子的存在情况，这是通过测定植物中其编码序列或其部分而进行的，其中所述序列与选自由seq id no.2、3、4、5、6、7、8、9、19、22、24、26和28组成的组中的seq id no.按增加的优先顺序有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。
98.本发明还涉及一种用于选择携带本发明核酸分子的茄科植物、特别是番茄植物的方法，其中包括测定本发明的核酸分子的存在情况，这是通过测定所编码的蛋白质的氨基酸序列而进行的，其中所述序列与选自由seq id no.10、11、12、13、14、14、16、17、20、23、25、27和29组成的组的seq id no.按增加的优先顺序有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性。
99.本发明还涉及一种生产植物的方法，所述植物抗根结线虫，特别是抗象耳豆根结线虫，所述方法包括：
100.a)将包含本发明核酸分子的本发明植物与另一植物杂交；
101.b)任选地对由所述杂交产生的植物进行一轮或多轮自交和/或杂交，以获得下一代群体；
102.c)从杂交产生的植物或从下一代群体中选择包含本发明的核酸分子的植物，所述植物对根结线虫、特别是对象耳豆根结线虫具有抗性。
103.通过将序列与选自seq id nos 1、2、3、4、5、6、7、8、9、18、19、21、22、24、26和28的序列中的任何一个进行比较，可以适当地选择包含本发明核酸分子的植物。可替代地，或另外地，所述植物可通过表型选择为具有对根结线虫的抗性，特别是通过进行对象耳豆根结线虫抗性的生物测定。
104.在本发明的一个实施方案中，用于生产抗根结线虫的植物的方法中的本发明植物是番茄植物。在本发明的另一个实施方案中，用于生产抗象耳豆根结线虫的番茄植物的方法中的本发明植物是从以ncimb登录号ncimb 43515保藏的种子生长的植物，或其后代植物，其是通过将从保藏种子生长的植物与其自身或与另一植物杂交一代或更多代而获得的直接或进一步后代。
105.本发明还提供了一种将另一种所需性状引入具有对根结线虫、特别是对象耳豆根结线虫的抗性的植物的方法，所述方法包括：
106.a)将包含本发明核酸分子的本发明植物与包含所述其它所需性状的第二植物杂交以产生f1后代；
107.b)任选地在f1中选择包括对根结线虫的抗性和其他期望性状的植物；
108.c)将所述任选选择的f1后代与任一亲本杂交以产生回交后代；
109.d)选择包括对根结线虫的抗性和其他期望性状的回交后代；和
110.e)任选地连续重复步骤c)和d)一次或多次，以产生所选的第四或更高代回交后代，其包含所述其他期望性状并且对根结线虫具有抗性。任选地进行回交，直到回交后代稳定并可用作亲本系，这可以在多达10次回交后达到。
111.在本发明的一个实施方案中，用于将另一种所需性状引入包含对根结线虫的抗性的植物的方法中的本发明植物是包含对象耳豆根结线虫的抗性的番茄植物。在本发明的另一个实施方案中，用于将另一种所需性状引入包含对象耳豆根结线虫的抗性的植物的方法中使用的本发明番茄植物是从以ncimb登录号ncimb 43515保藏的种子生长的植物，或其后代植物，其是通过将从保藏的种子生长的植物与其自身或与另一植物杂交一代或多代而获得的直接或进一步后代。
112.可选地，在任何杂交或回交步骤之后执行自交步骤。包含导致对根结线虫的抗性和其他所需性状的本发明核酸分子的植物的选择可替代地在本方法的任何杂交或自交步骤之后进行。所述其他所需性状可选自但不限于以下组：对细菌、真菌或病毒疾病的抗性、昆虫或害虫抗性、发芽率提高、植物大小、植物类型、保质期提高、水胁迫和热胁迫耐受性以及雄性不育性。本发明包括通过该方法生产的植物和由其获得的果实。
113.本发明还涉及通过使用营养繁殖、通过使用包含本发明的核酸分子的繁殖材料的组织培养物或通过使用加倍单倍体产生技术(doubled haploid generation technique)产生加倍单倍体系(doubled haploid line)生产包含本发明核酸分子的植物的方法，其中所述核酸分子的存在导致对根结线虫的抗性，所述方法包括将包含所述核酸分子的种子生长成所述植物。
114.本发明还涉及一种用于种子生产的方法，该方法包括从本发明的种子生长植物，允许所述植物产生具有种子的果实，收获果实，并提取种子。种子的生产适当地通过与自身杂交或与另一植物杂交来进行，所述另一植物任选地也是本发明的植物。如此产生的种子具有生长成包含本发明的核酸分子的植物的能力，并且对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫具有抗性。
115.本发明还涉及杂交种子和生产所述杂交种子的方法，包括将第一亲本植物与第二亲本植物杂交并收获所得杂交种子，其中第一亲本植物和/或第二亲本作物是包含本发明核酸分子的本发明植物。可由杂交种子生长的所得杂交植物包括所述核酸分子，所述杂交植物对根结线虫、特别是对象耳豆根结线虫具有抗性，也是本发明的植物。
116.提供对根结线虫(特别是象耳豆根结线虫)的抗性的亲本可以是直接从保藏的种子中生长的植物。亲本也可以是来自保藏种子的后代植物，其是通过与自身或与另一植物杂交一次或多次获得的直接或进一步后代，或来自种子的后代植物，其被鉴定为通过其他手段获得了本发明的核酸分子，从而获得了对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性。
117.如本文所用的本发明核酸分子的渗入是指通过标准育种技术将本发明的核酸分子从包含所述核酸分子的供体植物引入到不携带所述核酸的受体植物中，其中对包含本发明的核酸分子的植物的选择可以通过观察对根结线虫、特别是对象耳豆根结线虫的抗性的表型来进行，或者可以通过将序列与选自seq id nos 1、2、3、4、5、6、7、8、9、18、19、21、22、
24、26和26的任一序列比较来进行，如本文所述。
118.本发明的核酸分子从茄科的另一种植物渗入茄科的植物中。在一个实施方案中，本发明的核酸分子从细叶番茄(solanum pimpinellifolium)植物中渗入番茄。在另一个实施方案中，所述核酸分子从包含本发明核酸分子的番茄植物渗入到缺乏本发明的核酸分子的番茄植物中。在本发明的另一个实施方案中，所述核酸分子从包含本发明核酸分子的番茄植物或细叶番茄(solanum pimpinellifolium)渗入到缺乏本发明的核酸分子的植物中，其中所述植物选自下组中：野生番茄(solanum arcanum)、契斯曼尼番茄(solanum cheesmaniae)、智利番茄(solanum chilense)、克梅留斯基番茄(solanum chmielewskii)、多腺番茄(solanum corneliomulleri)、solanum galapagense、多毛番茄(solanum habrochaites)、solanum huaylasense、胡桃叶茄(solanum juglandifolium)、樱桃番茄(solanum lycopersicum cerasiforme)、类番茄茄(solanum lycopersicoides)、小花番茄(solanum neorickii)、赭黄茄(solanum ochrantum)、潘那利番茄(solanum pennellii)、秘鲁番茄(solanum peruvianum)、细叶番茄(solanum pimpinellifolium)和里基茄(solanum sitiens)。特别地，本发明的mer1基因从茄科的另一种植物渗入茄科的植物中。在一个具体的实施方案中，本发明的mer1基因从细叶番茄植物中渗入番茄中。
119.如本文所用，“本发明的表型”、“本发明的抗性”是对根结线虫的抗性。优选地，所述对根结线虫的抗性是对根结线虫象耳豆根结线虫的抗性(yang&eisenback，1983)。象耳豆根结线虫的同义词是meloidogyne mayaguensis或m.mayaguensis.。
120.如本文所使用的，术语“核酸分子”用于指定基因或基因的等位基因的核苷酸序列，其是作为特定表型即本发明的表型连锁的基因的特定序列。任选地，所述核酸分子是分离的。如本文所用，“本发明的mer1基因”或“本发明的mer1核酸分子”用于指定mer1基因，其导致本发明的表型。本发明涉及编码导致所述抗性的功能蛋白的基因或等位基因。更具体地，“本发明的mer1基因”或“本发明的mer1核酸分子”用于指编码mer1蛋白的核酸分子，当存在于茄科植物中、特别是在番茄植物中时，其赋予对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性，其中所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
121.a)包含根据seq id no.2、3、4、5、6、7、8或9的编码序列或与根据seq id no.2、3、4、5、6、7、8和9的序列具有按增加的优先度90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
122.b)编码具有根据seq id no.10、11、12、13、14、15、16或17的氨基酸序列的蛋白质或者具有与根据seq id no.10、11、12、13、14、15、16或17所述氨基酸序列按增加的优先顺序具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列。
123.如本文所用，术语“nrc6等位基因”用于表示nrc6基因的等位基因，当与本发明的mer1基因一起存在时，该等位基因在植物中促进根结线虫抗性，特别是对象耳豆根结线虫的抗性。更具体地，“nrc6等位基因”用于指编码蛋白质的核酸分子，当存在于茄科植物、特别是番茄植物中时，其与本发明的mer1核酸分子一起促进对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫的抗性，其中所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
124.a)包含根据seq id no.19、22、24、26或28的编码序列或与根据seq id no.19、22、24、26或28的序列具有98％、优选99％序列同一性的编码序列的核苷酸序列；或
125.b)编码具有根据seq id no.20、23、25、27或29的氨基酸序列的蛋白质或者具有与根据seq id no.20、23、25、27或29的氨基酸序列具有98％、优选99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列。
126.通常，茄属植物，特别是番茄植物包含nrc6基因的nrc6等位基因。本文给出了等位基因的例子。在植物中单独存在nrc6基因不会导致象耳豆根结线虫抗性。为了使茄科植物，特别是番茄(solanum lycopersicum)抗根结线虫，特别是象耳豆根结线虫，至少本发明的mer1基因应存在于所述植物中，并且优选与nrc6基因组合。
127.如本文所使用的，序列同一性是两个序列在正确比对后相同的核苷酸或氨基酸的百分比。本领域技术人员知道如何比对序列，例如通过使用序列比对工具，例如其可用于核苷酸序列和蛋白质序列。为了获得最显著的结果，应获得给出最高序列同一性得分的最佳可能比对。通过在评估中对最短序列的长度进行比较来计算序列同一性百分比，由此在本例中，序列表示至少包括起始密码子和终止密码子的基因或等位基因，或由这种基因或等等位基因编码的完整蛋白质。
128.在本发明的上下文中，“本发明的核酸分子”用于指如上定义的定义为“本发明mer1基因”的核酸分子和如上定义的至少一个定义为“nrc6等位基因”的核酸分子，其可以是本文定义的nrc6-2a、nrc6-2c、nrc6-2b、nrc6-3或nrc6-1a等位基因或其任何组合。
129.如本文所用，“本发明的核酸分子”是指本发明的mer1基因或本发明的mer1基因任选地与至少一个nrc6等位基因组合，所述至少一个nrc6等位基因可以是本文所定义的nrc6-2a、nrc6-2c、nrc6-2b、nrc6-3或nrc6-1a等位基因或其任何组合。
130.如本文所使用的，“本发明的植物”是茄科植物，其包含本发明的核酸分子并且对根结线虫具有抗性，优选本发明的植物属于茄属植物，甚至更优选该植物是番茄植物，其对象耳豆根结线虫具有抗性。
131.如本文所用，“后代”旨在指来自与本发明植物的杂交的第一代和所有后续后代，其中杂交包括与自身杂交或与另一种植物杂交，并且其中确定为子代的后代包括本文所定义的本发明的核酸分子，其导致对根结线虫、特别是对象耳豆根结线虫的抗性。“子代”还包括携带本发明核酸分子并对根结线虫、特别是象耳豆根结线虫具有抗性的植物，其是通过营养繁殖或其他形式的繁殖从本发明的另一植物或植物后代获得的。
132.本发明将在以下实施例中进一步说明，这些实施例仅用于说明目的。实施例无意以任何方式限制本发明。
133.保藏
134.纯合地包含本发明的核酸分子、产生象耳豆根结线虫抗性植物的番茄种子于2019年11月18日以保藏号ncimb 43515保藏于ncimb ltd,ferguson building,craibstone estate,bucksburn,aberdeen ab21 9ya,uk。
135.序列信息
136.表1序列信息
137.基因组序列对应于mrna，以及起始上游和终止下游+2kb。
138.139.140.141.142.143.144.145.146.147.148.149.150.151.152.153.154.155.156.157.158.159.160.161.162.163.164.165.166.167.168.169.170.171.172.173.174.175.176.177.178.179.180.[0181][0182]
附图
[0183]
本发明将在下面的实施例中进一步说明，这些实施例仅用于说明目的，而不以任何方式意图限定本发明的范围。在实施例中参考下图：
[0184]
图1：对具有本发明的经修饰的mer1基因的植物进行象耳豆根结线虫病检测的结果；示出了在来源的易感品系1和2以及具有导致非功能性mer1基因的缺失(δ)以及不具有功能性mer2基因缺失(+)的突变品系上的根结的数量。
实施例
[0185]
实施例1
[0186]
象耳豆根结线虫检测
[0187]
通过计算团块量(egg mass)来确定番茄植株的抗性。将要测试的番茄植株种植在温室中的托盘中，2周后将植株转移到装满沙土混合物的660cc花盆中。作为易感对照植物，将dometica rz引入试验中，作为正对照植物，将从保藏物ncimb 43515生长的植物引入试验中。在根部旁边，用1ml移液管尖端钻孔，并填充1ml包含象耳豆根结线虫接种物500j2的悬浮液。接种后，植物在生长室(23℃，14小时光照)中生长，每周浇水三次。接种六周后，将植物从土壤中取出，并用自来水冲洗根部以移除土壤。对团块量进行计数，并根据表2所示的症状进行评分。当使用根据表2的评分时，象耳豆根结线虫抗性的番茄植株的评分为0、1或2，优选为0或1。
[0188]
表2：象耳豆根结线虫抗性评分度量表
[0189]
评分团块数抗性类型00高度抗性11-3抗性24-20中间抗性321-100易感4》100高度易感
[0190]
实施例2
[0191]
鉴定能够赋予象耳豆根结线虫抗性的核酸分子
[0192]
各种内部培育的、象耳豆根结线虫抗性分离的番茄群体被精细地映射到染色体4上的一个仅包含10个潜在基因的小区域，这些基因可能与象耳豆根结线虫抗性有关。内部有用于开发这些群体的抗性和易感性品系的背景的全基因组序列。一些基因有一个过早的终止密码子，因此不会表达功能性蛋白质。只有感兴趣区域内存在的并表达功能性蛋白的基因被视为候选基因。在感兴趣区域中的其余基因中有本发明的mer1基因，其在易感材料和抗性材料之间具有各种多态性。分离材料显示本发明的mer1基因与抗性一起分离。通过表型和基因型分离的相关性分析，确定了mer1基因的特异性是抗性番茄(solanum lycopersicum)植物的象耳豆根结线虫抗性的原因。在分析过程中，还发现对于针对象耳豆根结线虫的抗性，nrc6与本发明的mer1基因一起分离。nrc6包含adachi等人((2019)an n-terminal motif in nlr immune receptors is functionally conserved across distantly related plant species；elife.27；8)公开的mada基序，因此被认为是nlr辅助蛋白。
[0193]
由本发明的mer1基因编码的mer1蛋白的表达通过对受感染植物以及对象耳豆根结线虫易感的番茄植物的未受感染植物和本发明植物的叶和根的材料进行rna测序来确定。由此得出了以下结论：mer1蛋白在植物的根中表达，而不存在于植物的叶中。
[0194]
实施例3
[0195]
修饰本发明的mer1基因
[0196]
植物中的功能性mer1蛋白对于具有对线虫的抗性、特别是对象耳豆根结线虫的抗性是必需的。因此，通过突变抗性植物的本发明mer1基因来抑制mer1蛋白的表达，将导致对
象耳豆根结线虫易感的植物。
[0197]
为了抑制mer1蛋白的表达，进行了crispr/cas实验。将两个设计的引导rna引入到质粒中。两个引导rna被设计成靶向mer1基因编码序列中的两个不同位置。番茄(solanum lycopersicum)幼苗在无菌环境中生长6天后用crispr/cas构建体进行根癌农杆菌介导的转化。该转化是在抗性植株上进行的，这些植株是通过将番茄来源与易感番茄系杂交获得f1代而得到的。随后，将f1植株回交3次以获得bc3群体，最后自交两次以获得f3bc3群体。
[0198]
在抗性植株中，发现并选择了一株在mer1基因编码序列中有236bp缺失的突变植株。该缺失导致非功能性mer1蛋白的表达，从而抑制其表达。对选择的植物进行自交以获得分离群体。通过使用简单的pcr实验来确认缺失。对于pcr实验，分离的基因组dna与正向引物aggatgtataaatactctgaca(seq id no:31)和反向引物gcctagcaactaatgtatct(seq id no:32)一起使用。所述引物对被设计为扩增具有和不具有所述突变的mer1扩增子。条件如下：
[0199]
具有seq id no:31和seq id no:32的引物对：
[0200]-95℃下3分钟(初始变性步骤)
[0201]-40个扩增循环，每个循环包括在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，在75℃下延长75秒。
[0202]-在72℃下10分钟(最终延伸步骤)。
[0203]
pcr产物在琼脂糖凝胶上显示；具有所述突变的植株的扩增子大小为820bp，没有所述突变的植株的扩增子大小为1100bp。
[0204]
通过该pcr实验，选择了对所述突变纯合的9株植物和具有野生型mer1基因的16株植物进行实验。
[0205]
通过计算根结的数量来测试纯合地包含mer1基因中的所述缺失的突变植物以及在相同遗传背景中包含功能性mer1基因的植物的抗性。计算根结的数量不同于实施例1中所述的计算团块质量，因为它是在接种后的不同时间进行的。将要测试的番茄植株播种在温室中的托盘中，2周后将植株转移到装满沙土混合物的900cc方形花盆中。在根部旁边，用1ml移液管尖端钻孔，并用1ml包含500j2象耳豆根结线虫接种物的悬浮液填充。接种后，植物在受控温室(23℃，至少14小时光照)中生长，每周浇水三次。接种后28天，将植物从土壤中取出，并将根尽可能地弹掉土壤。与具有相同背景但没有mer1基因缺失的植物相比，具有所述缺失的植物对象耳豆根结线虫的易感性显著增加，即根结数量增加。图1所示的结果表明，抑制抗性植物的功能性mer1基因的表达会导致更易感的植物。因此，本发明的mer1基因对番茄植物赋予针对象耳豆根结线虫的抗性。可以例如从保藏物ncimb 43515生长抗性番茄植物。