纯化(-)-降龙涎香醚的方法与流程

1.本发明一般地涉及用于纯化粗香精(flavor)或香料(perfumery)或化妆品成分或中间体的方法，特别是用于纯化粗(-)-降龙涎香醚((-)-ambrox)的方法。本发明还涉及该方法的产品和所述产品的各种用途。
2.背景
3.下式(i)的(-)-降龙涎香醚为商业上重要的香料成分，
[0004][0005]
(-)-降龙涎香醚在商业上称作降龙涎香醚(芬美意(firmenich))、龙涎呋喃(ambroxan)(汉高(henkel))、龙涎呋喃(ambrofix)(奇华顿(givaudan))、龙涎醚(amberlyn)(奎斯特(quest))、左旋龙涎醚(芬美意)、降龙涎醚(ambermor)(阿罗莫尔(aromor))和/或norambrenolide ether(pacific)。
[0006]
(-)-降龙涎香醚对映异构体而非(+)-降龙涎香醚对映异构体提供了特别期望的感官益处。将(-)-降龙涎醚对映异构体的气味描述为麝香样、木香、暖香或琥珀香，而(+)-降龙涎香醚对映异构体具有相对弱的气味香型。
[0007]
wo2017/182542(其内容通过引用并入本文)公开了通过7e,3e/z-高法呢醇混合物的生物转化制备(-)-降龙涎香醚的方法。wo2017/182542的实施例4公开了用于纯化(-)-降龙涎香醚的下游工艺，其包括加热步骤(其中将生物转化培养基加热约80-85℃的温度下约15分钟期限以使生物催化剂失活)，此后将液体(-)-降龙涎香醚冷却至约20℃的温度，在此使其再次结晶。通过过滤使生物转化培养基与(-)-降龙涎香醚晶体分离，并在过滤器上用水洗涤以除去生物转化培养基残余物。将如此获得的粗(-)-降龙涎香醚提升至期望的化学和嗅觉品质需要许多连续步骤，其包括将晶体溶于乙醇中，净化，然后漂白如此获得的溶液，然后最终使(-)-降龙涎香醚重结晶。这是一个复杂且劳动密集型的过程，其使用多项设备。该方法还使用易燃的乙醇，该易燃的乙醇必须安全且正确地处理，并且在该方法结束时处理或升级以供再利用。
[0008]
因此，期望提供用于纯化(-)-降龙涎香醚的新的和改进的方法。特别地，期望提供用于简化(-)-降龙涎香醚的纯化的方法，例如通过使用更少的设备，避免重结晶，和避免产生必须再加工的包含(-)-降龙涎醚的母液浓缩物。
[0009]
相同的考量也适用于制备其他香料成分和中间体、粗香精成分和中间体以及粗化妆品成分和中间体，特别是通过生物转化反应(例如使用shc/hac酶或其他生物催化剂)制
备的结晶形式的香料成分和中间体以及粗香精成分和中间体。
[0010]
概述
[0011]
根据本发明的第一个方面，提供了用于纯化粗香精或香料或化妆品成分或中间体的方法，该方法包括：
[0012]
用含水酸洗涤；
[0013]
用含水表面活性剂洗涤；和
[0014]
任选地用含水碱洗涤。
[0015]
根据本发明的第一个方面的一个特定实施方案，提供了用于纯化粗(-)-降龙涎香醚的方法，该方法包括：
[0016]
用含水酸洗涤；
[0017]
用含水表面活性剂洗涤；和
[0018]
任选地用含水碱洗涤。
[0019]
本发明的第一个方面的洗涤步骤可以以适合于纯化粗香精或香料或化妆品成分或中间体例如粗(-)-降龙涎香醚的任意顺序进行。
[0020]
根据本发明的第一个方面的一个特定实施方案，提供了用于纯化粗香精或香料或化妆品成分或中间体的方法，该方法包括：
[0021]
(a)用含水酸洗涤粗香精或香料或化妆品成分或中间体；
[0022]
(b)用含水碱洗涤步骤(a)的产物；
[0023]
(c)用含水表面活性剂洗涤步骤(b)的产物。
[0024]
根据本发明的第一个方面的一个特定实施方案，提供了用于纯化粗(-)-降龙涎香醚的方法，该方法包括：
[0025]
(a)用含水酸洗涤粗(-)-降龙涎香醚；
[0026]
(b)用含水碱洗涤步骤(a)的产物；
[0027]
(c)用含水表面活性剂洗涤步骤(b)的产物。
[0028]
根据本发明的第二个方面，提供了香精或香料或化妆品成分或中间体，其通过或可通过本发明的第一个方面(包括其任意实施方案)的方法得到。
[0029]
根据本发明的第二个方面的一个特定实施方案，提供了(-)-降龙涎香醚，其通过或可通过本发明的第一个方面(包括其任意实施方案)的方法得到。
[0030]
根据本发明的第三个方面，提供了本发明的第二个方面(包括其任意实施方案)的香精或香料或化妆品成分例如(-)-降龙涎香醚作为香精或香料或化妆品成分的用途。
[0031]
根据本发明的第四个方面，提供了香料组合物，其包含本发明的第二个方面(包括其任意实施方案)的香料成分例如(-)-降龙涎香醚。
[0032]
根据本发明的第五个方面，提供了香精组合物，其包含本发明的第二个方面(包括其任意实施方案)的香精成分。
[0033]
根据本发明的第六个方面，提供了化妆品组合物，其包含本发明的第二个方面(包括其任意实施方案)的化妆品成分。
[0034]
根据本发明的第七个方面，提供了家庭护理、个人护理、洗衣护理或空气护理组合物，其包含本发明的第四个方面(包括其任意实施方案)的香料组合物。
[0035]
根据本发明的第八个方面，提供了食品或饮料产品，其包含本发明的第五个方面
(包括其任意实施方案)的香精组合物。
[0036]
根据本发明的第九个方面，提供了化妆品，其包含本发明的第六个方面(包括其任意实施方案)的化妆品组合物。
[0037]
根据本发明的第十个方面，提供了那斯克型(nutsche-type)搅拌和干燥过滤器，其被配置成用于通过本发明的第一个方面的方法来纯化粗香精或香料或化妆品成分或中间体，其中基于所述粗香料或香料或化妆品成分或中间体的湿重，所述粗香精或香料或化妆品成分或中间体包含约20wt％至约30wt％的水。
[0038]
根据本发明的第十一个方面，提供了用于纯化粗香精或香料或化妆品成分或中间体的方法，该方法包括在那斯克型搅拌和干燥过滤器中洗涤所述粗香精或香料或化妆品成分或中间体。该方法可以例如为本发明的第一个方面的方法(包括其任意实施方案)。
[0039]
本发明的某些实施方案例如与wo2017/182542中所述的方法相比，可以提供以下优点中的一个或多个：
[0040]
·
用于纯化粗香精或香料或化妆品成分或中间体例如粗(-)-降龙涎香醚的更简单的方法；
[0041]
·
用于纯化粗香精或香料或化妆品成分或中间体例如粗(-)-降龙涎香醚的成本更低的方法；
[0042]
·
用于纯化粗香精或香料或化妆品成分或中间体例如粗(-)-降龙涎香醚的劳动密集程度更低的方法；
[0043]
·
更绿色和更环保的方法；
[0044]
即使使用更简单、成本更低和劳动密集程度更低的方法，也可以实现以下优点：
[0045]
·
减少纯化粗香精或香料或化妆品成分或中间体例如粗(-)-降龙涎香醚所需的设备数量；
[0046]
·
避免对重结晶的需求；
[0047]
·
避免或显著减少了乙醇的使用；
[0048]
·
减少材料损耗；
[0049]
·
避免生成必须再加工的包含香精或香料或化妆品成分或中间体例如粗(-)-降龙涎香醚的母液浓缩物；
[0050]
·
使用较少步骤和需要较少时间来纯化(-)-降龙涎香醚的高收率方法(例如，基于粗原料，》95mol％)；
[0051]
·
产生适于嗅觉应用的(-)-降龙涎香醚。
[0052]
本文所述的更简单、成本更低和劳动密集程度更低的方法可以：
[0053]
·
去除或减少不溶性和/或颗粒材料；
[0054]
·
去除或减少有色杂质；
[0055]
·
去除或减少生物转化反应的副产物；
[0056]
·
去除或减少恶臭杂质。
[0057]
本文进一步描述关于本发明的任何特定的一个或多个所述方面提供的细节、实施例和优选方案，并且同样适用于本发明的所有方面。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖本文所述的实施方案、实施例和优选方案的所有可能变型的任意组合。
[0058]
附图简述
[0059]
图1显示了xrd图案，其中横坐标的标度为度2θ，而纵坐标是以计数为单位的强度。
[0060]
详细描述
[0061]
本文提供了用于纯化粗香精或香料或化妆品成分或中间体例如粗(-)-降龙涎香醚的方法，该方法包括：
[0062]
用含水酸洗涤；
[0063]
用含水表面活性剂洗涤；和
[0064]
任选地用含水碱洗涤。
[0065]
本发明的第一个方面的洗涤步骤可以以适合纯化粗香精或香料或化妆品成分或中间体例如粗(-)-降龙涎香醚的任意顺序进行。洗涤步骤各自涉及洗涤粗香精或香料或化妆品成分或中间体例如粗(-)-降龙涎香醚，或上述洗涤步骤的产物，该产物也可以称作粗香精或香料或化妆品成分或中间体例如粗(-)-降龙涎香醚。
[0066]
例如，本文提供了用于纯化粗香精或香料或化妆品成分或中间体的方法，该方法包括：
[0067]
(a)用含水酸洗涤粗香精或香料或化妆品成分或中间体；
[0068]
(b)任选地用含水碱洗涤步骤(a)的产物；和
[0069]
(c)用含水表面活性剂洗涤步骤(a)的产物或步骤(b)的产物(如果存在)，
[0070]
例如，本文提供了用于纯化粗(-)-降龙涎香醚的方法，该方法包括：
[0071]
(a)用含水酸洗涤粗(-)-降龙涎香醚；
[0072]
(b)任选地用含水碱洗涤步骤(a)的产物；和
[0073]
(c)用含水表面活性剂洗涤步骤(a)的产物或步骤(b)的产物(如果存在)。
[0074]
例如，本文提供了用于纯化粗香精或香料或化妆品成分或中间体的方法，该方法包括：
[0075]
(a)用含水酸洗涤粗香精或香料或化妆品成分或中间体；
[0076]
(b)用含水碱洗涤步骤(a)的产物；和
[0077]
(c)用含水表面活性剂洗涤步骤(b)的产物。
[0078]
例如，本文提供了用于纯化粗(-)-降龙涎香醚的方法，该方法包括：
[0079]
(a)用含水酸洗涤粗(-)-降龙涎香醚；
[0080]
(b)用含水碱洗涤步骤(a)的产物；和
[0081]
(c)用含水表面活性剂洗涤步骤(b)的产物。
[0082]
例如，本文提供了用于纯化粗香精或香料或化妆品成分或中间体的方法，该方法包括：
[0083]
(a)用含水表面活性剂洗涤粗香精或香料或化妆品成分或中间体；
[0084]
(b)用含水酸洗涤步骤(a)的产物；和
[0085]
(c)任选地用含水碱洗涤步骤(b)的产物。
[0086]
例如，本文提供了用于纯化粗(-)-降龙涎香醚的方法，该方法包括：
[0087]
(a)用含水表面活性剂洗涤粗(-)-降龙涎香醚；
[0088]
(b)用含水酸洗涤步骤(a)的产物；和
[0089]
(c)任选地用含水碱洗涤步骤(b)的产物。
[0090]
例如，本文提供了用于纯化粗香精或香料或化妆品成分或中间体的方法，该方法
包括：
[0091]
(a)用包含含水酸和含水表面活性剂的组合物洗涤粗香精或香料或化妆品成分或中间体；和
[0092]
(b)任选地用含水碱洗涤步骤(a)的产物。
[0093]
例如，本文提供了用于纯化粗(-)-降龙涎香醚的方法，该方法包括：
[0094]
(a)用包含含水酸和含水表面活性剂的组合物洗涤粗(-)-降龙涎香醚；和
[0095]
(b)任选地用含水碱洗涤步骤(a)的产物。
[0096]
在本文所述的步骤(a)、(b)和/或(c)中的每一个之前或之后，可以存在一个或多个另外的方法步骤，例如一个或多个另外的洗涤步骤。例如，该方法可以包括在步骤(a)、(b)和/或(c)中的每一个之前或之后用水洗涤一次或更多次。当在步骤(a)、(b)和/或(c)中的每一个之前或之后存在一个或多个另外的方法步骤时，“步骤(a)的产物”是指步骤(a)和在进行步骤(b)之前进行的任何另外的方法步骤的产物，并且“步骤(c)的产物”是指步骤(b)和在进行步骤(c)之前进行的任何另外的方法步骤的产物。
[0097]
粗香精或香料或化妆品成分或中间体原料
[0098]
所谓“粗香精或香料或化妆品成分或中间体”是指包含香料成分或香料成分的中间体或香精成分或香精成分的中间体或化妆品成分或化妆品成分的中间体以及杂质的材料。
[0099]
如本文所用，术语“香料成分”是指可以用于组合物中以提供期望的气味的化合物。
[0100]
如本文所用，术语“香精成分”是指可以用于组合物中以提供期望的味道的化合物。
[0101]
如本文所用，术语“化妆品成分”是指当施用于受试者(例如人受试者)，特别是受试者的皮肤时，可用作化妆品组合物中的活性成分以提供期望的外观的化合物。这可以包括天然产物，其可以例如为结晶的。
[0102]
如本文所用，术语“香料中间体”是指可以用于制备香料成分的化合物。
[0103]
如本文所用，术语“香精中间体”是指可以用于制备香精成分的化合物。
[0104]
如本文所用，术语“化妆品成分”是指可以用于制备化妆品成分的化合物。
[0105]
如本文所用，术语“杂质”是指不是香精或香料或化妆品成分或中间体本身的任何固体或液体材料。这包括例如用于生产香精或香料或化妆品成分或中间体的未反应的原料，产生香精或香料或化妆品成分或中间体的反应的副产物，颗粒材料，细胞，细胞碎片，以及不溶于溶剂例如水、水混溶性溶剂和有机溶剂的各种杂质，例如不溶于乙醇的杂质，例如沉淀的矿物盐(mineral salts)和蛋白质。
[0106]
因此，所谓“纯化香精或香料或化妆品成分或中间体”是指除去并减少粗香精或香料或化妆品成分或中间体中杂质的量的方法。
[0107]
粗香精或香料或化妆品成分或中间体可以例如为固体形式。
[0108]
粗香精或香料或化妆品成分或中间体可以例如为结晶形式。
[0109]
粗香精或香料或化妆品成分或中间体可以通过生物转化过程，例如使用角鲨烯何帕烯环化酶/高法呢醇降龙涎香醚环化酶(shc/hac)酶制备。因此，本文所述的纯化方法还可以包括在本文所述的纯化步骤之前通过生物转化过程制备粗香精或香料或化妆品成分
或中间体的步骤。由生物转化过程(例如如本文所述)产生的生物转化培养基通常可以包含含有粗香精或香料或化妆品成分或中间体的固相和含有水和/或油相的一个或多个液相，例如其可以含有残留的未反应的原料和其他油性或油溶性杂质或副产物。
[0110]
术语“粗香精或香料或化妆品成分或中间体”可以指在本文所述的纯化方法之前在预纯化步骤(例如通过过滤)中从生物转化培养基中分离的材料。
[0111]
目前描述的纯化方法可以例如对固体形式的产物特别良好地起作用，其中杂质沉积在产物的表面上。这可能意味着它们可以通过本文所述的洗涤步骤容易地除去。
[0112]
用于制备粗香精或香料或化妆品成分或中间体的反应条件和任何预纯化步骤可以例如为本文关于粗(-)-降龙涎香醚原料(但使用正确的原料)所述的方法和预纯化步骤。
[0113]
粗香精或香料或化妆品成分或中间体可以例如选自(-)-降龙涎香醚、(-)-龙涎香-氧化物(ambra-oxide)、3a-乙基-6,6,9a-三甲基十二氢萘并[2,1-b]呋喃和(+)-龙涎缩醛。特别地，粗香精或香料成分或中间体可以为(-)-降龙涎香醚。
[0114]
粗(-)-降龙涎香醚原料
[0115]
所谓“粗(-)-降龙涎香醚”是指包含(-)-降龙涎香醚和杂质的材料。如本文所用，术语“杂质”是指不是(-)-降龙涎香醚的任何固体或液体材料。这包括例如用于生产(-)-降龙涎香醚的未反应的原料(例如高法呢醇)，生产(-)-降龙涎香醚的反应副产物(例如本文如表2中所述的式(ii)、(iii)和/或(iv)的化合物)，颗粒材料，细胞，细胞碎片，及不溶于溶剂如水、水混溶性溶剂和有机溶剂的各种杂质，例如不溶于乙醇的杂质，例如沉淀的矿物盐和蛋白质。
[0116]
因此，所谓“纯化(-)-降龙涎香醚”是指除去并减少粗(-)-降龙涎香醚中杂质的量的方法。
[0117]
粗(-)-降龙涎香醚可以通过使用角鲨烯何帕烯环化酶/高法呢醇降龙涎香醚环化酶(shc/hac)酶将高法呢醇转化成(-)-降龙涎香醚的生物转化过程制备(参见下文进一步的细节)。由生物转化过程(例如如本文所述)产生的培养基通常可以包含含有(-)-降龙涎香醚的固相和含有水的一个或多个液相和/或可含有残留的未反应高法呢醇和其他油性或油溶性杂质或副产物的油相。例如，一些式(ii)、(iii)和(iv)的化合物可以存在于这样的油相中。
[0118]
术语“粗(-)-降龙涎香醚”可以指在本文所述的纯化方法之前在预纯化步骤(例如通过过滤)中从生物转化培养基中分离的材料。
[0119]
从生物转化过程获得的固相(包括(-)-降龙涎香醚)可以通过过滤(例如离心过滤)或滗析/沉降与生物转化培养基的液相分离。通过选择具有适当筛孔尺寸的过滤器，还可以将固体形式的(-)-降龙涎香醚与生物转化培养基中存在的颗粒材料(例如细胞或细胞碎片)分离。与过滤类似，滗析/沉降利用颗粒物质和固体形式的(-)-降龙涎香醚之间的粒度和/或颗粒质量的差异以使得它们分离，前者保持悬浮在上清液中，其可以丢弃，而后者可以作为沉淀物分离，以回收并进行纯化步骤。用于从包括细胞碎片的生物转化培养基中分离(-)-降龙涎香醚的合适方法描述于wo2017/182542和wo2016/170106中，其内容通过引用并入本文。例如，可以首先通过加热或通过将生物转化培养基的ph增加至约10至11(碱化)来使生物催化剂失活。然后可通过物理手段如过滤从(-)-降龙涎香醚中除去细胞、细胞碎片、不溶性材料和/或其他颗粒材料。这可具有除臭效果，因为粘附于(-)-降龙涎香醚的
细胞和/或细胞碎片和/或不溶性材料和/或其他颗粒材料如果保留在粗(-)-降龙涎香醚产品中，则可能是令人不快的异味的原因。
[0120]
例如，可以通过升高生物转化培养基的温度来使生物催化剂失活。可以将温度升高至足够高以灭活细菌但低于(-)-降龙涎香醚的熔点(即低于约75至80℃)的温度。因此，(-)-降龙涎香醚不会变成液体。相反，在该温度(例如约50℃至约60℃，例如约55℃)下，(-)-降龙涎香醚略微溶解并且平均晶体尺寸减小。然后晶体在冷却阶段再次生长。这有助于通过过滤将它们与生物转化培养基的液相分离。
[0121]
例如，可以使生物转化培养基的温度增加至约50℃至约60℃的温度。例如，生物转化培养基的温度可以增加至约52℃至约58℃，或约54℃至约56℃的温度。例如，生物转化培养基的温度可以增加至约55℃的温度。
[0122]
或者，可以通过例如使用氢氧化钠将生物转化培养基的ph增加至约10至11来使生物催化剂失活。当与通过加热使生物催化剂失活相比时，这可以例如减少能量消耗和时间损失，减少絮凝(其可能阻碍过滤)，减少恶臭问题，和/或主要留下不溶于乙醇的矿物杂质，其可以通过过滤消除。
[0123]
因此，经历本文所述的纯化方法的粗(-)-降龙涎香醚在生物催化剂失活后可以基本上或完全不含完整细胞。
[0124]
在将(-)-降龙涎香醚与生物转化培养基的颗粒材料分离(例如通过过滤)之后，粗(-)-降龙涎香醚中存在的任何含水物质可以是来自最初培养细胞的培养基的残余物。粗(-)-降龙涎香醚可以例如在本文所述的纯化方法之前使用水进行进一步的预纯化洗涤步骤。在另外的用水预纯化洗涤步骤之后，粗(-)-降龙涎香醚中存在的任何含水物质可以是水。
[0125]
基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或小于约99wt％的(-)-降龙涎香醚。例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含等于或小于约98wt％，或等于或小于约97wt％，或等于或小于约96wt％，或等于或小于约95wt％的(-)-降龙涎香醚。
[0126]
基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或大于约80wt％的(-)-降龙涎香醚。例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含等于或大于约81wt％，或等于或大于约82wt％，或等于或大于约83wt％，或等于或大于约84wt％，或等于或大于约85wt％，或等于或大于约86wt％，或等于或大于约87wt％，或等于或大于约88wt％，或等于或大于约89wt％，或等于或大于约90wt％，或等于或大于约91wt％，或等于或大于约92wt％，或等于或大于约93wt％，或等于或大于约94wt％，或等于或大于约95wt％的(-)-降龙涎香醚。
[0127]
例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含约80wt％至约99wt％，或约85wt％至约97wt％，或约90wt％至约95wt％，或约93wt％至约97wt％的(-)-降龙涎香醚。
[0128]
基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或大于约1wt％的总杂质。例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含等于或大于约2wt％，或等于或大于约3wt％，或等于或大于约4wt％，或等于或大于约5wt％的总杂质。
[0129]
基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或小于约20wt％的总杂质。例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含等于或小于约19wt％，或等于或小于约18wt％，或等于或小于约17wt％，或等于或小于约16wt％，或等于或小于约15wt％，或等于或小于约14wt％，或等于或小于约13wt％，或等于或小于约12wt％，或等于或小于约11wt％，或等于或小于约10wt％，或等于或小于约9wt％，或等于或小于约8wt％，或等于或小于约7wt％，或等于或小于约6wt％的总杂质。
[0130]
例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含约1wt％至约20wt％，或约2wt％至约15wt％，或约3wt％至约10wt％的总杂质。
[0131]
粗(-)-降龙涎香醚的干含量是扣除水含量之后剩余的材料。例如，通过卡尔-费歇尔(karl-fischer)滴定测量的25％的水含量等于75％的干含量。干含量是固体，但可能存在少量油性残余物。油性残余物可以例如是如本文表2中所述的一种或多种式(ii)、(iii)和/或(iv)的化合物或任何未反应的高法呢醇。
[0132]
粗(-)-降龙涎香醚可以例如包含水。或者，粗(-)-降龙涎香醚可以是干燥的(即不包含任何水)。可能有利的是从粗(-)-降龙涎香醚中除去水以避免细菌生长和在粗物质中产生异味。
[0133]
基于所述粗(-)-降龙涎香醚的总湿重，所述粗(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或大于约2wt％的水。例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的总湿重，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含等于或大于约5wt％，或等于或大于约10wt％，或等于或大于约15wt％，或等于或大于约20wt％的水。
[0134]
基于所述粗(-)-降龙涎香醚的总湿重，所述粗(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或小于约50wt％的水。例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的总湿重，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含等于或小于约45wt％，或等于或小于约40wt％，或等于或小于约35wt％，或等于或小于约30wt％，或等于或小于约25wt％，或等于或小于约20wt％的水。
[0135]
例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的总湿重，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含约2wt％至约50wt％，或约10wt％至约25wt％，或约20wt％至约25wt％的水。
[0136]
基于所述粗(-)-降龙涎香醚的总湿重，所述粗(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或大于约50wt％的总干含量。例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的总湿重，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含等于或大于约55wt％，或等于或大于约60wt％，或等于或大于约65wt％，或等于或大于约70wt％的总干含量。
[0137]
基于所述粗(-)-降龙涎香醚的总湿重，所述粗(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或小于约100wt％，或等于或小于约99wt％，或等于或小于约98wt％，或等于或小于约95wt％，或等于或小于约90wt％，或等于或小于约85wt％，或等于或小于约80wt％，或等于或小于约75wt％的总干含量。
[0138]
例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的总湿重，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含约50wt％至约100wt％，或约60wt％至约98wt％，或约70wt％至约95wt％，或约75wt％至约90wt％的总干含量。
[0139]
例如，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含约70wt％至约75wt％的干物质和约20wt％至约25wt％的水。所述粗(-)-降龙涎香醚中的干物质可以包含约5wt％至约10wt％的杂质。
[0140]
本文所述的方法特别适合于纯化通过使用角鲨烯何帕烯环化酶/高法呢醇降龙涎香醚环化酶(shc/hac)酶将e,e-高法呢醇转化成(-)-降龙涎香醚的生物转化过程制备的粗(-)-降龙涎香醚。术语“shc/hac酶”包括野生型shc/hac酶和野生型shc/hac酶的变体。用于通过使用shc酶的生物转化过程制备(-)-降龙涎香醚的合适的方法描述在例如wo2016/170106、wo2016/170099、wo2017/182542、wo2018/157021和eichhorn等人(2018)，adv.synth.catal.，360：2339-2351中，其内容通过引用并入本文。任意适合的生物转化过程可以用于制备粗(-)-降龙涎香醚。适合的shc/hac酶包括、但不限于wo2016/170099中的表13和14中公开的那些，例如shc/hac酶215g2 shc。
[0141]
粗(-)-降龙涎香醚可以通过包含培养宿主细胞以产生shc/hac酶并使宿主细胞和/或由宿主细胞产生的shc/hac酶与3e,7e-高法呢醇在适于促进3e,7e-高法呢醇转化成(-)-降龙涎香醚的条件下接触的方法制备。
[0142]
在开始生物转化步骤之前，可以将宿主细胞培养以产生足够的生物催化剂、收获并洗涤(并且任选地储存(例如冷藏、冷冻或冻干))。
[0143]
在某些实施方案中，(-)-降龙涎香醚为固体形式，如wo2016/170106、wo2016/170099和/或wo2017/182542中所述，其内容通过引用并入本文。
[0144]
由于其在水中的溶解度非常低，(-)-降龙涎香醚在生物转化过程中在培养基中结晶。一旦e,e-高法呢醇转化率超过约50％，就会发生这种情况。
[0145]
在某些实施方案中，在生物转化反应之后(即在生物转化过程中的第一次结晶之后)不需要重结晶步骤(即包括溶解(-)-降龙涎香醚晶体然后重结晶(-)-降龙涎香醚的步骤)来纯化粗(-)-降龙涎香醚。
[0146]
高法呢醇可以具有如下所示的异构现象。
[0147]
表1.高法呢醇异构体
[0148]
[0149][0150]
尽管高法呢醇可以作为四种异构体(3z,7z)、(3e,7z)、(3z,7e)和(3e,7e)异构体的混合物存在，但wo2016/170099的图12显示了当eeh用作原料(用于用野生型shc/hac和/或shc/hac变体进行生物转化)时产生的反应产物((-)-降龙涎香醚和化合物(iv))，以及当ee:ez用作原料时产生的反应产物((-)-降龙涎香醚和化合物(ii)、(iii)和(iv)(参见表2))。为了便于参比，化合物(i)至(iv)列于下表2中。eichhorn等人(2018)，adv.synth.catal.，360：2339-2351的方案2也显示(e,z)异构体(相当于3z,7e高法呢醇异构体)仅产生化合物(ii)和(iii)，但不产生(-)-降龙涎香醚。
[0151]
如本文所用，提及(3e,7e)-高法呢醇是指e,e-高法呢醇，其也称为eeh。
[0152]
用于本文所述的制备(-)-降龙涎香醚的方法的原料可以为例如(3e,7e)-高法呢醇或包含(3e,7e)-高法呢醇的混合物，例如包含(3e,7e)-高法呢醇的高法呢醇异构体的混合物。
[0153]
优选地，高法呢醇原料包含(3e,7e)和(3z,7e)的混合物，在本文中称为ee:ez异构体混合物。高法呢醇的ee:ez异构体混合物具有35826-67-6的cas编号。
[0154][0155]
e/z-混合物cas：35826-67-6
[0156]
例如，eeh:ezh的重量比为约100:00；99:01；98:02；97:03；96:04；95:05；94:06；93:07；92:08；91:09；90:10；89:11；88:12；87:13；86:14；85:15；84:16；83:17；82:18；81:19；80:20；79:21；78:22；77:23；76:24；75:25；74:26；73:27；72:28；71:29；70:30；69:31；68:32；67:33；66:34；65:35；64:36；63:37；62:38；61:39；60:40；59:41；58:42；57:43；56:44；55:45；54:46；53:47；52:48；51:49；或约50:50。例如，高法呢醇原料包含86:14的ee:ez重量比。例如，高法呢醇原料包含80:20的ee:ez重量比。
[0157]
存在的高法呢醇异构体的数量可以影响反应速度。shc/hac酶能够从高法呢醇异构体的复杂混合物(例如ee:ez:ze:zz)将e,e-高法呢醇转化成(-)-降龙涎香醚。然而，可以观察到较低的转化率，这与以下观点一致：除eeh之外的高法呢醇异构体可以与eeh竞争进入shc/hac酶活性位点，因此可以充当将eeh转化成(-)-降龙涎香醚的竞争性抑制剂和/或
还充当替代底物(参见例如，eichhorn等人(2018)adv.synth.catal.360：2339-2351，其内容通过引用并入本文)。因此，高法呢醇底物可以包含2至4种异构体、优选两种异构体的异构体混合物。
[0158]
高法呢醇(例如eeh)原料可能无法全部转化成(-)-降龙涎香醚或反应副产物。在纯化粗(-)-降龙涎香醚之前，可以例如通过过滤除去任何未反应的高法呢醇。然而，粗(-)-降龙涎香醚可以包含少量高法呢醇(例如eeh)。
[0159]
例如，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含等于或大于约0.05wt％的高法呢醇。例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含等于或大于约0.1wt％，或等于或大于约0.5wt％，或等于或大于约1wt％，或等于或大于约2wt％的高法呢醇。
[0160]
例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含等于或小于约5wt％的高法呢醇。例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含等于或小于约4wt％，或等于或小于约3wt％的高法呢醇。
[0161]
例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含约0.05wt％至约5wt％，或约0.1wt％至约4wt％，或约0.5wt％至约2wt％的高法呢醇。
[0162]
本文所述的生物转化过程可以产生式(i)的(-)-降龙涎香醚与一种或多种副产物，例如如下所示的式(ii)、(iii)和(iv)的化合物，
[0163]
表2.式(i)、(ii)、(iii)和(iv)的化合物的命名
[0164]
[0165][0166]
因此，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含式(ii)、(iii)和/或(iv)的一种或多种化合物。
[0167]
例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含等于或大于约1wt％的式(ii)、(iii)和/或(iv)的总化合物。例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含等于或大于约2wt％，或等于或大于约3wt％，或等于或大于约4wt％，或等于或大于约5wt％，或等于或大于约6wt％，或等于或大于约7wt％，或等于或大于约8wt％的式(ii)、(iii)和/或(iv)的总化合物。
[0168]
例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含等于或小于约15wt％的式(ii)、(iii)和/或(iv)的总化合物。例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含等于或小于约14wt％，或等于或小于约13wt％，或等于或小于约12wt％，或等于或小于约11wt％，或等于或小于约10wt％的式(ii)、(iii)和/或(iv)的总化合物。
[0169]
例如，基于所述粗(-)-降龙涎香醚的干含量，所述粗(-)-降龙涎香醚可以包含约1wt％至约15wt％，或约3wt％至约12wt％，或约5wt％至约10wt％的式(ii)、(iii)和/或(iv)的总化合物。
[0170]
平均而言，所述粗(-)-降龙涎香醚可以例如包含约73.5wt％的(-)-降龙涎香醚、2.5wt％(共产物和副产物—化合物(ii)、(iii)和(iv)以及高法呢醇原料的总和)、3wt％的外来醇不溶性材料(通过gc分析未检测到)和21wt％的水。
[0171]
粗(-)-降龙涎香醚典型地包含1.5至2.0wt％的共产物和副产物(iii)(9表-降龙涎香醚)和各自0.25至0.5％的共产物和副产物(ii)和(iv)。
[0172]
粗(-)-龙涎香-氧化物原料
[0173]
如本文所用，术语“(-)-龙涎香-氧化物”是指下式(x)的化合物。(-)-龙涎香-氧化物可以例如与一种或多种下式(xi)、(xii)或(xiii)的副产物组合制备。
[0174][0175]
(-)-龙涎香-氧化物可以如bolster等人，tetrahedron，2002，58(26)，5275-5285页中所述由(+)-落叶松醇(larixol)生产。
[0176]
还可以通过使用shc/hac酶(其可以为野生型shc/hac酶或野生型shc/hac酶的变体)将e,e-双高法呢醇(biseeh)或包含biseeh的双高法呢醇异构体的混合物酶促转化成(-)-龙涎香-氧化物或包含(-)-龙涎香-氧化物的混合物来产生(-)-龙涎香-氧化物。
[0177]
所谓“粗(-)-龙涎香-氧化物”是指包含(-)-龙涎香-氧化物和杂质的材料。如本文所用，术语“杂质”是指不是(-)-龙涎香-氧化物的任何固体或液体材料。这包括例如用于生产(-)-龙涎香-氧化物的未反应的原料(例如双高法呢醇)，生产(-)-龙涎香-氧化物的反应副产物(例如式(xi)、(xii)和/或(xiii)的化合物)，颗粒材料，细胞，细胞碎片，以及不溶于溶剂如水、水混溶性溶剂和有机溶剂的各种杂质，例如不溶于乙醇的杂质，例如沉淀的矿物盐和蛋白质。
乙基-6,6,9a-三甲基十二氢萘并[2,1-b]呋喃的任何固体或液体材料。这包括例如用于生产3a-乙基-6,6,9a-三甲基十二氢萘并[2,1-b]呋喃的未反应的原料(例如乙基高法呢醇)，生产3a-乙基-6,6,9a-三甲基十二氢萘并[2,1-b]呋喃的反应副产物(例如式(xxi)的化合物)，颗粒材料，细胞，细胞碎片，以及不溶于溶剂如水、水混溶性溶剂和有机溶剂的各种杂质，例如不溶于乙醇的杂质，例如沉淀的矿物盐和蛋白质。
[0188]
因此，所谓“纯化3a-乙基-6,6,9a-三甲基十二氢萘并[2,1-b]呋喃”是指除去和减少粗3a-乙基-6,6,9a-三甲基十二氢萘并[2,1-b]呋喃中杂质的量的方法。
[0189]
粗3a-乙基-6,6,9a-三甲基十二氢萘并[2,1-b]呋喃可以通过使用角鲨烯何帕烯环化酶/高法呢醇降龙涎香醚环化酶(shc/hac)酶(其包括野生型酶和野生型酶的变体)将乙基高法呢醇转化成3a-乙基-6,6,9a-三甲基十二氢萘并[2,1-b]呋喃的生物转化过程来制备。由例如如本文所述的生物转化过程产生的生物转化培养基通常可以包含含有3a-乙基-6,6,9a-三甲基十二氢萘并[2,1-b]呋喃的固相和含有水的一个或多个液相和/或可以含有残留的未反应原料和其他油性或油溶性杂质或副产物的油相。用于制备粗3a-乙基-6,6,9a-三甲基十二氢萘并[2,1-b]呋喃的生物转化过程可以例如使用上文关于(-)-降龙涎香醚描述的相同方法进行。
[0190]
术语“粗3a-乙基-6,6,9a-三甲基十二氢萘并[2,1-b]呋喃”可以指在本文所述的纯化方法之前在预纯化步骤(例如通过过滤)中从生物转化培养基中分离的材料。分离可以例如使用关于(-)-降龙涎香醚描述的相同方法进行。
[0191]
粗(+)-龙涎缩醛原料
[0192]
(+)-龙涎缩醛具有下式(xxx)中所示的结构的相对构型，其中r为甲基。
[0193][0194]
式(xxx)的化合物包含多个手性碳原子，因此还可以存在式(xxx)的化合物的一种或多种立体异构体，包括对映异构体和非对映异构体。式(xxx)的化合物可以例如与式(xxx)的化合物的一种或多种立体异构体组合制备。
[0195]
(+)-龙涎缩醛可以通过使用shc/hac酶(其可以为野生型shc/hac酶或野生型shc/hac酶的变体)将下式(xxxi)的羟基法呢基丙酮或羟基法呢基丙酮的异构体的混合物酶促转化成(+)-龙涎缩醛或包含(+)-龙涎缩醛的混合物来产生，
[0196][0197]
(5z,9e)-6-(羟基甲基)-10,14-二甲基十五碳-5,9,13-三烯-2-酮式(xxxi)。
[0198]
式xxx的化合物还可以通过包括使式(xxxia)的化合物与角鲨烯-何帕烯环化酶(shc)酶或酶变体接触的方法生产，
[0199][0200]
其中r为h、甲基或乙基。
[0201]
所谓“粗(+)-龙涎缩醛”是指包含(+)-龙涎缩醛和杂质的材料。如本文所用，术语“杂质”是指不是(+)-龙涎缩醛的任何固体或液体材料。这包括例如用于生产(+)-龙涎缩醛的未反应原料(例如羟基法呢基丙酮)，生产(+)-龙涎缩醛的反应副产物，颗粒物质，细胞，细胞碎片，和各种不溶于溶剂如水、水混溶性溶剂和有机溶剂的杂质，例如不溶于乙醇的杂质，例如沉淀的矿物盐和蛋白质。
[0202]
因此，所谓“纯化(+)-龙涎缩醛”是指除去和减少粗(+)-龙涎缩醛中的杂质的量的方法。
[0203]
粗(+)-龙涎缩醛可以通过使用角鲨烯何帕烯环化酶/高法呢醇降龙涎香醚环化酶(shc/hac)酶(其包括野生型酶和野生型酶的变体)将羟基法呢基丙酮转化成(+)-龙涎缩醛的生物转化过程制备。由生物转化过程(例如如本文所述)产生的生物转化培养基通常可包含含有(+)-龙涎缩醛的固相和含有水的一个或多个液相和/或可含有残留的未反应原料和其他油性或油溶性杂质或副产物的油相。用于制备粗(+)-龙涎缩醛的生物转化过程可以例如使用上文关于(-)-降龙涎香醚所述的相同方法进行。
[0204]
术语“粗(+)-龙涎缩醛”可以指在本文所述的纯化方法之前在预纯化步骤(例如通过过滤)中从生物转化培养基中分离的材料。分离可以例如使用关于(-)-降龙涎香醚描述的相同方法进行。
[0205]
洗涤
[0206]
本文提供的方法包括多个洗涤步骤。
[0207]
所谓“洗涤”是指使包含香精或香料或化妆品成分或中间体的固体材料例如包含(-)-降龙涎香醚的固体材料与液体接触以除去一种或多种杂质。例如，在步骤(a)中，所述液体可以为含水酸。例如，在步骤(b)中，所述液体可以为含水碱。例如，在步骤(c)中，所述液体可以为含水表面活性剂。
[0208]
使固体材料与液体接触可以将一种或多种杂质溶解在所述液体中，从而使得它们与包含香精或香料或化妆品成分或中间体的固体材料例如包含(-)-降龙涎香醚的固体材
料分离。特别地，使固体材料与含水酸接触可以将一种或多种杂质溶解在含水酸中，从而使得它们与包含(-)-降龙涎香醚的固体材料分离。
[0209]
使固体材料与含水表面活性剂接触可导致一种或多种杂质悬浮在液体中，从而使得它们与包含香精或香料或化妆品成分或中间体的固体材料例如包含(-)-降龙涎香醚的固体材料分离。
[0210]
使固体材料与含水碱接触可以例如中和来自所述含水酸洗涤步骤的任何存在的残留酸。
[0211]
洗涤可以通过将液体分配在包含香精或香料或化妆品成分或中间体的固体材料例如包含(-)-降龙涎香醚的固体材料的表面上来进行。然后可以使液体通过包含香精或香料或化妆品成分或中间体的固体材料例如包含(-)-降龙涎香醚的固体材料并除去，例如自然地或使用压力或真空。
[0212]
洗涤可例如包括将液体与包含香精或香料或化妆品成分或中间体的固体材料例如包含(-)-降龙涎香醚的固体材料混合。这可有助于使包含香精或香料或化妆品成分或中间体的固体材料例如包含(-)-降龙涎香醚的固体材料与液体之间的接触最大化。然后可以通过过滤使液体与包含香精或香料或化妆品成分或中间体的固体(例如包含(-)-降龙涎香醚的固体材料)分离。
[0213]
特别地，由每个洗涤步骤产生的任何滤饼可以在随后的洗涤步骤中重新悬浮，以提高随后的洗涤步骤的效率。
[0214]
所有洗涤步骤可以例如在单部设备中进行。
[0215]
本文所述的方法可以例如进一步包括在洗涤步骤之后干燥纯化的香精或香料或化妆品成分或中间体，例如进一步包括在洗涤步骤之后干燥纯化的(-)-降龙涎香醚。干燥步骤可以例如在与洗涤步骤相同的设备中进行。
[0216]
洗涤和/或干燥可以例如在那斯克型搅拌和干燥过滤器中进行。这是一部可以执行过滤和干燥功能的设备，并且包括用于搅拌容器内的材料的搅拌器(例如叶片)。搅拌器可以通过在平行于和/或垂直于轴的轴线上的运动来执行多个操作。例如，搅拌器可以保持浆料内容物流化直到大部分母液被过滤通过，可以有助于保持均匀的滤饼而没有裂缝，可以有助于将滤饼再浆化，和/或有助于将滤饼朝向排出口移动。典型的单元由具有多孔板的碟形容器组成。可以使用limpet夹套、带夹套的底盘和搅拌器(叶片和轴)将整个容器保持在所需温度，传热介质可以流过该搅拌器。容器可以制成完全防漏的，用于真空或压力服务。那斯克型搅拌干燥过滤器的干燥功能可以通过施加真空来实现。这排出了废液，使得滤饼准备好用于任何随后的洗涤步骤。
[0217]
与其他过滤器如带式过滤器相比，使用那斯克型搅拌和干燥过滤器可以提供优点。特别地，使用那斯克型搅拌和干燥过滤器可以改善固体材料的洗涤和再悬浮。例如，与其他类型的过滤器(例如带式过滤器)相比，使用那斯克型搅拌和干燥过滤器可以减少洗涤后产品中残留水和/或其他液体材料(以及残留水和/或其他液体材料中存在的杂质)的量。
[0218]
每个洗涤步骤(例如用含水酸洗涤、任选的用含水碱洗涤、用含水表面活性剂洗涤和/或任何任选的水洗涤步骤)可使用至少约1:1的洗涤液体(例如含水酸、含水碱、含水表面活性剂、水)与干燥的粗物质(例如干燥的粗(-)-降龙涎香醚)的重量比。例如，每个洗涤步骤可以使用至少约2:1或至少约3:1的洗涤液体与干燥的粗物质的重量比。干燥的粗物质
choh-choh-cooh)、葡糖酸(hoch
2-(choh)
4-cooh)和柠檬酸(c6h8o7)。
[0231]
酸可以例如为有机酸。酸可以例如为羧酸。
[0232]
有机酸的实例包括草酸(ho2c2o2h)、苯甲酸(c6h5cooh)、乙酸(ch3cooh)、丙酸(ch3ch3cooh)、卤代乙酸(例如一氯乙酸(clch2cooh)、二氯乙酸(cl2chcooh)、三氯乙酸(ccl3co2h)、一溴乙酸(brch2cooh)、二溴乙酸(br2chcooh)、二氟乙酸(c2h2f2o2)、三氟乙酸(c2hf3o2))、甲酸(hcooh)、乳酸(ch3ch(oh)cooh)、琥珀酸((ch2)2(co2h)2)、尿酸(c5h4n4o3)、苹果酸(c4h6o5)、马来酸(ho2cchchco2h)、酒石酸(hooc-choh-choh-cooh)、葡糖酸(hoch
2-(choh)
4-cooh)和柠檬酸(c6h8o7)。
[0233]
酸可以例如为弱有机酸。酸可以例如为弱羧酸。该可以例如为有机羧酸。酸可以例如为弱有机羧酸。
[0234]
在某些实施方案中，酸为柠檬酸。
[0235]
含水酸可以例如具有等于或大于约0.01wt％的浓度。例如，含水酸可以具有等于或大于约0.1wt％，或等于或大于约0.5wt％，或等于或大于约1.0wt％，或等于或大于约1.5wt％，或等于或大于约2.0wt％，或等于或大于约2.5wt％的浓度。
[0236]
含水酸可以例如具有等于或小于约15.0wt％的浓度。例如，含水酸可以具有等于或小于约12.5wt％，或等于或小于约10.0wt％，或等于或小于约7.5wt％，或等于或小于约5.0wt％，或等于或小于约4.0wt％，或等于或小于约3.0wt％的浓度。
[0237]
例如，含水酸可以具有约0.01wt％至约15.0wt％，或约0.5wt％至约10.0wt％，或约1.0wt％至约7.5wt％，或约2.0wt％至约3.0wt％的浓度。
[0238]
含水酸可以例如具有等于或大于约0.01wt％的浓度。例如，含水酸可以具有等于或大于约0.1wt％，或等于或大于约0.5wt％，或等于或大于约1.0wt％，或等于或大于约1.5wt％，或等于或大于约2.0wt％，或等于或大于约2.5wt％的浓度。含水酸可以例如具有等于或小于约5.0wt％的浓度。例如，含水酸可以具有等于或小于约4.5wt％，或等于或小于约4.0wt％，或等于或小于约3.5wt％，或等于或小于约3.0wt％的浓度。例如，含水酸可以具有约0.01wt％至约5.0wt％，或约0.5wt％至约4.0wt％，或约1.0wt％至约3.0wt％，或约2.0wt％至约3.0wt％的浓度。
[0239]
含水酸的温度可以例如等于或大于约5℃。例如，含水酸的温度可以等于或大于约10℃，或等于或大于约15℃，或等于或大于约17℃。
[0240]
含水酸的温度可以例如等于或小于约50℃。例如，含水酸的温度可以等于或小于约45℃，或等于或小于约40℃，或等于或小于约35℃，或等于或小于约30℃，或等于或小于约25℃，或等于或小于约23℃，或等于或小于约22℃，或等于或小于约21℃。
[0241]
例如，含水酸的温度可以在约17℃至约50℃，或约17℃至约40℃，或约17℃至约30℃，或约17℃至约25℃，或约18℃至约22℃，或约20℃至约22℃的范围。
[0242]
含水酸的温度可以例如等于或大于约17℃。例如，含水酸的温度可以等于或大于约18℃，或等于或大于约19℃，或等于或大于约20℃。含水酸的温度可以例如等于或小于约23℃。例如，含水酸的温度可以等于或小于约22℃，或等于或小于约21℃。例如，含水酸的温度可以在约17℃至约23℃，或约18℃至约22℃，或约20℃至约22℃的范围。
[0243]
所述用含水酸洗涤可以例如在下一步骤(例如用含水碱洗涤)之前重复一次或更多次。换句话说，在进行下一步骤(例如用含水碱洗涤)之前，所述用含水碱洗涤可以进行两
次或更多次。
[0244]
在重复所述用含水酸洗涤的情况下，在所述用含水酸洗涤两次或更多次之间可以不存在其他中间步骤。
[0245]
在重复所述用含水酸洗涤的情况下，在开始用含水酸的下一次(例如第二次)洗涤之前，可以将来自先前(例如第一次)用含水酸洗涤的至少约90wt％，例如至少约95wt％.或至少约98wt％。或至少约99wt％。或100wt％的含水酸与包含香精或香料或化妆品成分或中间体的固体材料例如包含(-)-降龙涎香醚的固体材料分离(例如通过过滤)。
[0246]
含水碱洗涤
[0247]
碱可以例如是任何合适的碱。特别地，碱可以是适于中和来自酸洗涤步骤的任何残留酸的任何碱。例如，碱可以是弱碱或强碱。
[0248]
特别地，碱可以例如是强碱。强碱是在水溶液中完全解离的碱，与在水溶液中仅部分解离的弱碱相反。
[0249]
强碱和弱碱可以通过测定pkb值来鉴定。在水溶液中能解离成离子(例如oh-和b
+
)的碱(例如boh)的pkb值可以使用以下等式确定。
[0250]
pkb＝-log
10
kb[0251]
kb＝[b
+
][oh-]/[boh]
[0252]
水溶液中pkb值小于0的碱被认为是强碱。在水溶液中pkb值为0或更大的碱被认为是弱碱。
[0253]
碱可以例如是氢氧化物(即当其在水溶液中解离时释放氢氧根离子)或碳酸盐或碳酸氢盐(碳酸氢盐)。
[0254]
碱的实例包括例如氢氧化锂(lioh)、氢氧化钠(naoh)、氢氧化钾(koh)、氢氧化钙(ca(oh)2)、碳酸锂(li2co3)、碳酸钠(na2co3)、碳酸钾(k2co3)、碳酸钙(caco3)、碳酸氢锂(lihco3)、碳酸氢钠(nahco3)、碳酸氢钾(khco3)碳酸氢钙(ca(hco3)2)。
[0255]
在某些实施方案中，碱为氢氧化钠。
[0256]
含水碱可以例如具有等于或大于约0.01wt％的浓度。例如，含水碱可以具有等于或大于约0.1wt％，或等于或大于约0.5wt％，或等于或大于约1.0wt％，或等于或大于约1.5wt％，或等于或大于约2.0wt％，或等于或大于约2.5wt％的浓度。
[0257]
含水碱可以例如具有等于或小于约15.0wt％的浓度。例如，含水碱可以具有等于或小于约12.5wt％，或等于或小于约10.0wt％，或等于或小于约7.5wt％，或等于或小于约5.0wt％，或等于或小于约4.0wt％，或等于或小于约3.0wt％的浓度。
[0258]
例如，含水碱可以具有在约0.01wt％至约15.0wt％，或约0.5wt％至约10.0wt％，或约1.0wt％至约7.5wt％，或约2.0wt％至约3.0wt％的范围内的浓度。
[0259]
含水碱可以例如具有等于或大于约0.01wt％的浓度。例如，含水碱可以具有等于或大于约0.1wt％，或等于或大于约0.5wt％，或等于或大于约1.0wt％，或等于或大于约1.5wt％，或等于或大于约2.0wt％，或等于或大于约2.5wt％的浓度。含水碱可以例如具有等于或小于约5.0wt％的浓度。例如，含水碱可以具有等于或小于约4.5wt％，或等于或小于约4.0wt％，或等于或小于约3.5wt％，或等于或小于约3.0wt％的浓度。例如，含水碱可以具有约0.01wt％至约5.0wt％，或约0.5wt％至约4.0wt％，或约1.0wt％至约3.0wt％，或约2.0wt％至约3.0wt％的浓度。
[0260]
含水碱的温度可以例如为等于或大于约5℃。例如，含水碱的温度可以等于或大于约10℃，或等于或大于约15℃，或等于或大于约20℃，或等于或大于约25℃，或等于或大于约30℃，或等于或大于约35℃，或等于或大于约36℃，或等于或大于约37℃，或等于或大于约38℃，或等于或大于约40℃。
[0261]
含水碱的温度可以例如为等于或小于约75℃。例如，含水碱的温度可以等于或小于约70℃，或等于或小于约65℃，或等于或小于约60℃，或等于或小于约55℃，或等于或小于约50℃，或等于或小于约45℃，或等于或小于约44℃，或等于或小于约43℃，或等于或小于约42℃，或等于或小于约41℃。
[0262]
例如，含水碱的温度可以在约5℃至约75℃，或约15℃至约70℃，或约20℃至约60℃，或约25℃至约50℃，或约35℃至约45℃，或约38℃至约42℃的范围。
[0263]
含水碱的温度可以例如为等于或大于约35℃。例如，含水碱的温度可以等于或大于约36℃，或等于或大于约37℃，或等于或大于约38℃，或等于或大于约39℃，或等于或大于约40℃.含水碱的温度可以例如为等于或小于约45℃。例如，含水碱的温度可以等于或小于约44℃，或等于或小于约43℃，或等于或小于约42℃，或等于或小于约41℃。例如，含水碱的温度可以在约35℃至约45℃，或约38℃至约42℃。
[0264]
所述用含水碱洗涤可以例如在下一步骤(例如用含水表面活性剂洗涤)之前重复一次或更多次。换句话说，所述用含水碱洗涤可以在进行下一步骤(例如用含水表面活性剂洗涤)之前进行两次或更多次。
[0265]
在重复所述用含水碱洗涤的情况下，在用含水碱洗涤两次或更多次之间可以不存在其他中间步骤。
[0266]
在重复所述用含水碱洗涤的情况下，在用含水碱开始下一次(例如第二次)洗涤之前，可以使至少约90wt％，例如至少约95wt％，或至少约98wt％，或至少约99wt％，或100wt％的来自先前(例如第一次)用含水碱洗涤的含水碱与包含香精或香料或化妆品成分或中间体的固体材料例如包含(-)-降龙涎香醚的固体材料分离(例如通过过滤)。
[0267]
含水表面活性剂洗涤
[0268]
表面活性剂可以例如是任何合适的表面活性剂。例如，表面活性剂可以是适于将一种或多种杂质与香精或香料或化妆品成分或中间体例如与(-)-降龙涎香醚分离的任何表面活性剂。例如，表面活性剂可以是阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂或非离子型表面活性剂。
[0269]
特别地，表面活性剂可以例如是阴离子型表面活性剂。阴离子型表面活性剂是在其头部含有阴离子官能团的表面活性剂。阴离子型表面活性剂包括例如磺酸盐、磷酸盐、硫酸盐和羧酸盐。
[0270]
阴离子型表面活性剂的实例包括例如烷基硫酸盐(例如月桂基硫酸铵、十二烷基硫酸钠(sds))、烷基醚硫酸盐(例如月桂基醚硫酸钠(sles)、肉豆蔻基硫酸钠)、烷基羧酸盐(例如硬脂酸盐，例如硬脂酸钠)、烷基苯磺酸盐、烷基磺酸盐、烷基醚磺酸盐、氟化脂肪酸盐、硅氧烷、脂肪醇硫酸盐、聚氧乙烯脂肪醇醚硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、聚氧乙烯脂肪醇磷酸酯醚、烷基醇酰胺、烷基磺酸乙酰胺、烷基琥珀酸酯磺酸盐、氨基醇烷基苯磺酸盐、环烷酸盐、烷基酚磺酸盐、丁二酸二辛基磺酸钠、全氟辛烷磺酸盐、全氟丁烷磺酸盐、烷基-芳基醚磷酸盐和烷基醚磷酸盐。
[0271]
在某些实施方案中，表面活性剂为十二烷基硫酸钠(sds)。
[0272]
非离子型表面活性剂的实例包括例如槐糖脂、脂肪醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物、脂肪酸乙氧基化物、乙氧基化胺和/或脂肪酸酰胺、泊洛沙姆、多羟基化合物的脂肪酸酯、甘油的脂肪酸酯、山梨醇的脂肪酸酯、蔗糖的脂肪酸酯、烷基多葡糖苷和氧化胺。
[0273]
含水表面活性剂可以例如具有等于或大于约0.01wt％的浓度。例如，含水表面活性剂可以具有等于或大于约0.05wt％，或等于或大于约0.1wt％，或等于或大于约0.2wt％，或等于或大于约0.3wt％，或等于或大于约0.4wt％，或等于或大于约0.5wt％的浓度。
[0274]
含水表面活性剂可以例如具有等于或小于约10.0wt％的浓度。例如，含水表面活性剂可以具有等于或小于约9.0wt％，或等于或小于约8.0wt％，或等于或小于约7.0wt％，或等于或小于约6.0wt％，或等于或小于约5.0wt％，或等于或小于约4.0wt％，或等于或小于约3.0wt％，或等于或小于约2.0wt％的浓度。
[0275]
例如，含水表面活性剂可以具有在约0.01wt％至约10.0wt％，或约0.05wt％至约8.0wt％，或约0.1wt％至约6.0wt％，或约0.5wt％至约5.0wt％，或约0.5wt％至约1.0wt％的范围内的浓度。
[0276]
含水表面活性剂可以例如具有等于或大于约0.05wt％的浓度。例如，含水表面活性剂可以具有等于或大于约0.1wt％，或等于或大于约0.2wt％，或等于或大于约0.3wt％，或等于或大于约0.4wt％，或等于或大于约0.5wt％的浓度。含水表面活性剂可以例如具有等于或小于约5.0wt％的浓度。例如，含水表面活性剂可以具有等于或小于约4.0wt％，或等于或小于约3.0wt％，或等于或小于约2.0wt％，或等于或小于约1.0wt％的浓度。例如，含水表面活性剂可以具有在约0.05wt％至约5.0wt％，或约0.2wt％至约4.0wt％，或约0.3wt％至约3.0wt％，或约0.4wt％至约2.0wt％，或约0.5wt％至约1.0wt％的范围内的浓度。
[0277]
含水表面活性剂的温度可以例如为等于或大于约5℃。例如，含水表面活性剂的温度可以等于或大于约10℃，或等于或大于约15℃，或等于或大于约20℃，或等于或大于约25℃，或等于或大于约30℃，或等于或大于约35℃，或等于或大于约40℃，或等于或大于约45℃，或等于或大于约50℃，或等于或大于约55℃，或等于或大于约60℃，或等于或大于约62℃，或等于或大于约64℃，或等于或大于约65℃，或等于或大于约66℃，或等于或大于约68℃，或等于或大于约70℃。
[0278]
含水表面活性剂的温度可以例如为等于或小于约75℃。例如，含水表面活性剂的温度可以等于或小于约74℃，或等于或小于约73℃，或等于或小于约72℃。
[0279]
例如，含水表面活性剂的温度范围可以为约5℃至约75℃，或约35℃至约75℃，或约50℃至约72℃，或约60℃至约75℃。
[0280]
含水表面活性剂的温度可以例如为等于或大于约60℃。例如，含水表面活性剂的温度可以等于或大于约62℃，或等于或大于约64℃，或等于或大于约65℃，或等于或大于约66℃，或等于或大于约68℃，或等于或大于约70℃。含水表面活性剂的温度可以例如为等于或小于约75℃。例如，含水表面活性剂的温度可以等于或小于约74℃，或等于或小于约73℃，或等于或小于约72℃。例如，含水表面活性剂的温度范围可以为约60℃至约80℃，或约65℃至约75℃，或约68℃至约72℃。
[0281]
所述用含水表面活性剂洗涤可以例如重复一次或更多次。换句话说，所述用含水表面活性剂洗涤可以进行两次或更多次。
[0282]
在重复所述用含水表面活性剂洗涤的情况下，在用含水表面活性剂的两次或更多次洗涤之间可以不存在其他中间步骤。
[0283]
在重复所述用含水表面活性剂洗涤的情况下，在开始用含水表面活性剂的下一次(例如第二次)洗涤之前，可以将来自先前(例如第一次)用含水表面活性剂洗涤的至少约90wt％，例如至少约95wt％，或至少约98wt％，或至少约99wt％，或100wt％的含水表面活性剂与包含香精或香料或化妆品成分或中间体的固体材料例如包含(-)-降龙涎香醚的固体材料分离(例如通过过滤)。
[0284]
另外的(任选的)步骤
[0285]
本文所述的方法可以进一步包括在所述用含水酸洗涤、所述任选的用含水碱洗涤和所述用含水表面活性剂洗涤之前和/或之后的一个或多个另外的步骤。例如，本文所述的方法可以进一步包括在所述用含水酸洗涤、所述任选的用含水碱洗涤和所述用含水表面活性剂洗涤之前和/或之后的一个或多个洗涤步骤。
[0286]
例如，本文所述的方法可以进一步包括在一次或更多次所述用含水酸洗涤、所述任选的用含水碱洗涤和所述用含水表面活性剂洗涤之间的用水洗涤。例如，本文所述的方法可以进一步包括在所述用含水酸洗涤、所述任选的用含水碱洗涤和/或所述用含水表面活性剂洗涤之前用水洗涤。例如，本文所述的方法可以进一步包括在任何任选的用含水碱洗涤之后用水洗涤。例如，本文所述的方法可以进一步包括在用含水酸洗涤之后用水洗涤。例如，本文所述的方法可以进一步包括在用含水表面活性剂洗涤之后用水洗涤。
[0287]
例如，本文所述的方法可以包括在本文所述的纯化方法之前用水洗涤粗香精或香料或化妆品成分或中间体作为第一步。
[0288]
例如，本文所述的方法可以包括用水洗涤粗(-)-降龙涎香醚作为第一步，然后进行本文所述的纯化方法。
[0289]
使用水的每个另外的洗涤步骤的水的温度可以例如等于或大于约5℃。例如，使用水的每个另外的洗涤步骤的水的温度可以例如等于或大于约10℃，或等于或大于约15℃，或等于或大于约20℃，或等于或大于约25℃，或等于或大于约30℃，或等于或大于约35℃，或等于或大于约40℃，或等于或大于约45℃，或等于或大于约50℃，或等于或大于约55℃，或等于或大于约60℃。
[0290]
使用水的每个另外的洗涤步骤的水的温度可以例如等于或小于约75℃。例如，使用水的每个另外的洗涤步骤的水的温度可以例如等于或小于约74℃，或等于或小于约73℃，或等于或小于约72℃，或等于或小于约71℃，或等于或小于约70℃。
[0291]
例如，使用水的每个另外的洗涤步骤的水的温度范围可以为约5℃至约75℃，或约20℃至约72℃，或约25℃至约70℃，或约40℃至约70℃，或约60℃至约70℃。
[0292]
例如，本文所述的方法可以进一步包括在所述用含水碱洗涤和所述用含水表面活性剂洗涤之间用水洗涤。换句话说，所述用含水碱洗涤的产物可以在用含水表面活性剂洗涤它之前用水洗涤一次或更多次。例如，所述用含水碱洗涤的产物可以在用含水表面活性剂洗涤之前用水洗涤两次。
[0293]
在用含水表面活性剂洗涤之前，用于洗涤用含水碱洗涤的产物的水的温度可以例如等于或大于约17℃。例如，水的温度可以等于或大于约18℃，或等于或大于约19℃，或等于或大于约20℃。
[0294]
在用含水表面活性剂洗涤之前，用于洗涤用含水碱洗涤的产物的水的温度可以例如等于或小于约23℃。例如，水的温度可以等于或小于约22℃，或等于或小于约21℃。
[0295]
例如，在用含水表面活性剂洗涤之前，用于洗涤用含水碱洗涤的产物的水的温度范围可以为约17℃至约23℃，或约18℃至约22℃，或约20℃至约22℃。
[0296]
例如，本文所述的方法可以进一步包括在所述用含水表面活性剂洗涤之后用水洗涤。换句话说，所述用含水表面活性剂洗涤的产物可以用水洗涤一次或更多次。例如，所述用含水表面活性剂洗涤的产物可以用水洗涤两次或更多次，或三次或更多次，或四次或更多次。例如，所述用含水表面活性剂洗涤的产物可以用水洗涤，直至滤液澄清。
[0297]
例如，所述用含水表面活性剂洗涤的产物可以用水洗涤一次或更多次，例如两次，使用具有等于或大于约50℃和/或等于或小于约70℃的温度的水，随后用水洗涤一次或更多次，例如两次，使用具有等于或大于约17℃和/或等于或小于约23℃的温度的水。所述具有等于或大于约50℃和/或等于或小于约70℃的温度的水可以例如具有等于或大于约52℃，或等于或大于约54℃，或等于或大于约55℃，或等于或大于约56℃，或等于或大于约58℃，或等于或大于约60℃的温度。所述具有等于或大于约50℃和/或等于或小于约70℃的温度的水可以例如具有等于或小于约68℃，或等于或小于约66℃，或等于或小于约65℃，或等于或小于约64℃，或等于或小于约62℃的温度。例如，所述具有等于或大于约50℃和/或等于或小于约70℃的温度的水具有等于或大于约50℃和/或等于或小于约70℃的温度的水可以在约50℃至约70℃，或约55℃至约65℃，或约58℃至约62℃的范围。所述具有等于或大于约17℃和/或等于或小于约23℃的温度的水可以例如具有等于或大于约18℃，或等于或大于约19℃，或等于或大于约20℃的温度。所述具有等于或大于约17℃和/或等于或小于约23℃的温度的水可以例如具有等于或小于约22℃，或等于或小于约21℃的温度。例如，所述具有等于或大于约17℃和/或等于或小于约23℃的温度的水可以例如具有范围为约17℃至约23℃，或约18℃至约22℃，或约20℃至约22℃的温度。
[0298]
用于任选的洗涤步骤的水可以例如为蒸馏水。
[0299]
最终的洗涤步骤，例如紧接在任何干燥步骤之前，可以例如使用醇和水的混合物，例如乙醇和水的混合物，例如乙醇和水的50:50w/w混合物。
[0300]
在洗涤步骤之后，可以将产品干燥以形成纯化的香精或香料或化妆品成分或中间体。例如，用含水表面活性剂洗涤(和任何其他任选步骤)的产物可以例如干燥以形成纯化的香精或香料或化妆品成分或中间体。例如，当所有洗涤步骤完成时，可以干燥产物。
[0301]
在洗涤步骤后，可将产物干燥以形成纯化的(-)-降龙涎香醚。例如，可以例如干燥用含水表面活性剂洗涤(和任何其他任选步骤)的产物以形成纯化的(-)-降龙涎香醚。例如，当所有洗涤步骤完成时，可以干燥产物。
[0302]
纯化的香精或香料或化妆品成分或中间体产物
[0303]
本文所述的方法的产物可以称作纯化的香精或香料或化妆品成分或中间体。本文提供了纯化的香精或香料或化妆品成分或中间体，其通过或可通过本文所述的方法(包括其所有实施方案)得到。
[0304]
纯化的(-)-降龙涎香醚产物
[0305]
本文所述的方法的产物可以称作纯化的(-)-降龙涎香醚。本文提供了纯化的(-)-降龙涎香醚，其通过或可通过本文所述的方法(包括其所有实施方案)得到。
[0306]
在某些实施方案中，纯化的(-)-降龙涎香醚为如wo2017/182542中所述的固体形式，其内容通过引用并入本文。
[0307]
基于干物质，纯化的(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或大于约98.0wt％(-)-降龙涎香醚。例如，基于干物质，纯化的(-)-降龙涎香醚可以包含等于或大于约98.5wt％，或等于或大于约99.0wt％(-)-降龙涎香醚。基于干物质，纯化的(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或小于约99.5wt％(-)-降龙涎香醚。例如，基于干物质，纯化的(-)-降龙涎香醚可以包含约98.0wt％至约99.5wt％，或约98.5wt％至约99.5wt％，或约99.0wt％至约99.5wt％(-)-降龙涎香醚。
[0308]
式(ii)、(iii)和(iv)的化合物和未反应的高法呢醇可以以嗅觉可接受的量存在于纯化的(-)-降龙涎香醚中。这意味着式(ii)、(iii)和(iv)的化合物以低于其气味检测阈值的量存在，或以不会以影响(-)-降龙涎香醚的嗅觉特征的方式贡献其嗅觉特征的量存在。包含嗅觉可接受量的任何这类化合物的纯化的(-)-降龙涎香醚对于熟练的调香师来说将是可识别的，因为具有商业级(-)-降龙涎香醚的气味特征，例如通过合成方法从香紫苏醇获得的并且可购自奇华顿的ambrofix
tm
。
[0309]
基于干物质，纯化的(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或大于约0.1wt％，或等于或大于约0.2wt％的式(ii)的化合物。基于干物质，纯化的(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或小于约0.4wt％，或等于或小于约0.3wt％的式(ii)的化合物。
[0310]
基于干物质，纯化的(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或大于约0.1wt％，或等于或大于约0.2wt％的式(iii)的化合物。基于干物质，纯化的(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或小于约0.4wt％，或等于或小于约0.3wt％的式(iii)的化合物。
[0311]
基于干物质，纯化的(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或大于约0.1wt％，或等于或大于约0.2wt％的式(iv)的化合物。基于干物质，纯化的(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或小于约0.8wt％，或等于或小于约0.6wt％，或等于或小于约0.4wt％的式(iv)的化合物。
[0312]
基于干物质，纯化的(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或大于约0.3wt％，或等于或大于约0.4wt％，或等于或大于约0.5wt％的式(ii)、(iii)和(iv)的总化合物。基于干物质，纯化的(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或小于约1.2wt％，或等于或小于约1.0wt％，或等于或小于约0.8wt％的式(ii)、(iii)和(iv)的总化合物。
[0313]
基于干物质，纯化的(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或大于约0.1wt％，或等于或大于约0.2wt％，或等于或大于约0.3wt％，或等于或大于约0.4wt％的未反应的高法呢醇。基于干物质，纯化的(-)-降龙涎香醚可以例如包含等于或小于约0.8wt％，或等于或小于约0.7wt％，或等于或小于约0.6wt％的未反应的高法呢醇化合物。
[0314]
纯化的(-)-降龙涎香醚中每种化合物的wt％可以通过气相色谱法测定。
[0315]
基于粗原料，本文所述的方法可以提供等于或大于约95mol％的收率的(-)-降龙涎香醚。例如，基于粗原料，本文所述的方法可以提供等于或大于约96mol％，或等于或大于约97mol％，或等于或大于约98mol％的收率的(-)-降龙涎香醚。例如，基于粗原料，本文所述的方法可以提供等于或小于约100mol％，或等于或小于约99mol％的收率的(-)-降龙涎香醚。
[0316]
纯化的(-)-降龙涎香醚可以例如通过x-射线衍射(xrd)分析。
[0317]
可以使用本领域众所周知的衍射仪设备以直接的方式收集粉末xrd数据。
[0318]
可以使用stoe stadi p x-射线衍射仪获得粉末xrd图案。系统描述：通过使用位置敏感检测器，衍射仪以透射模式使用(平坦样品架、弯曲锗(111)单色仪和cukal辐射1.54060埃)。发生器电压为40kv，电流为40ma。检测器：mythen ik。实验参数：在2θ＝约4
°
至26
°
之间进行图案测量。确定的衍射角的精度为约+/-2
°
2θ。
[0319]
纯化的(-)-降龙涎香醚可以例如表现出粉末x-射线衍射图案，其在衍射角2θ具有如下峰的至少一个：约15.6、16.2、16.7、17.0、17.4、18.3+/-0.2
°
。
[0320]
纯化的(-)-降龙涎香醚的固体形式的特征可以例如在于粉末x-射线衍射图案，其在衍射角2θ显示出如下峰：约15.6、16.2、16.7、17.0、17.4和18.3+/-0.2
°
。
[0321]
纯化的(-)-降龙涎香醚的固体形式可以例如通过基本上如下图1所示的粉末x-射线衍射图案来表征。
[0322]
晶体的形状可以根据本领域众所周知的方法通过显微镜检查来测定。
[0323]
晶体的平均直径测量可以通过激光粒度测定法测定。激光粒度测定法是本领域众所周知的技术。平均粒度可以在已知用于该目的的任何粒度分析仪上测定，例如cilas 1180no.516仪器。可以根据iso标准13320-1(2009修订版)使用fraunhofer方法用水作为载液和遮蔽指数24进行测量。
[0324]
纯化的(-)-降龙涎香醚的固体形式可以例如包含具有平均直径为10至400微米，例如40至400微米，例如100至400微米的细长晶体。
[0325]
纯化的(-)-降龙涎香醚的固体形式可以例如包含细长晶体，其沿着其最长尺寸为20至600微米，例如40至500微米，例如100至400微米，例如大于100微米，例如大于200微米，例如大于300微米测量的长度。
[0326]
纯化的(-)-降龙涎香醚包含(-)-降龙涎香醚作为主要化合物，但也可以包含其他化合物，其可以或可以不赋予生物转化混合物令人愉快的嗅觉香型，因此可以以积极或消极的方式有助于纯化的(-)-降龙涎香醚终产物的感官特性。因此，纯化的(-)-降龙涎香醚的感官分析可以使用由训练有素的专家(例如调香师)使用的公认的感官测试进行，使得该测试可以帮助确定化学相关的目标产品相对于参比产品是否也是嗅觉相关的最终产品。
[0327]
可以针对市售的(-)-降龙涎香醚参照物测试纯化的(-)-降龙涎香醚产品的嗅觉纯度、质量及其感官特征。专家还可以在应用研究中测试(-)-降龙涎香醚材料，以确定材料是否满足关于其感官特征的规格。(-)-降龙涎香醚的各种应用包括但不限于精细香料或消费品，例如织物护理、盥洗用品、美容护理和清洁产品，包括基本上所有商业上使用目前可用的降龙涎香醚成分的产品，包括但不限于：
[0328]
降龙涎香醚(芬美意)、龙涎呋喃(汉高)、龙涎呋喃(奇华顿)、龙涎醚(奎斯特)、左旋龙涎醚(芬美意)、降龙涎醚(阿罗莫尔)和/或norambrenolide ether(pacific)产品。
[0329]
本文所述的纯化的(-)-降龙涎香醚的参比产物可以例如是根据wo2017/182542中所述的方法制备的固体形式的(-)-降龙涎香醚，例如wo2017/182542的实施例4。
[0330]
本文所述的纯化的(-)-降龙涎香醚的参比产品可以例如是根据wo2018/154048中所述的方法制备的来自香紫苏内酯的(-)-降龙涎香醚薄片。
[0331]“香紫苏内酯”用作“(3ar,5as,9as,9br)-3a,6,6,9a-四甲基-1,4,5,5a,7,8,9,9b-八氢苯并[e]苯并呋喃-2-酮”的同义词。右旋或(+)-香紫苏内酯具有以下结构式：
[0332][0333]
香紫苏内酯，例如通过(3e/7e)-高法呢酸的环化酶催化转化，然后将其化学还原(例如通过lialh4或nabh4)形成降龙涎香醚-1,4-二醇[mookherjee等人；perfumer and flavourist(1990)，15:27]而得到。然后可以通过不同的方法将降龙涎香醚-1,4-二醇通过化学方式转化成(-)-降龙涎香醚(参见例如us5,274,134)。
[0334]
用于本文所述的纯化的(-)-降龙涎香醚的参比产品可以例如为通过本领域技术人员公知的任何方法制备的(-)-降龙涎香醚。
[0335]
例如，(-)-降龙涎香醚最初在鼠尾草(salvia sclarea l.)成分的化学转化后发现(参见m.hinder，m.stoll，hlv.chim.acta 1950，33，1308-1312)，随后被鉴定为龙涎香酒精酊剂的关键增香剂(参见b.d.mookherjee，r.r.patel，proceedings 7
th int.congr.ess.oils 1977，kyoto，japan，paper no 136)。
[0336]
降龙涎香醚在传统上由不同公司以》100t/a规模的组合通过从(-)-香紫苏醇(以下9.1.1)(一种从鼠尾草中分离的二萜二醇)经半合成来制造：
[0337][0338]
香紫苏内酯(9.1.2)的主要生产者avoca通过使用浅白隐球酵母(cryptococcus albidus)的生物催化过程代替(-)-香紫苏醇(9.1.1)化学氧化为(-)-香紫苏内酯(9.1.2)(参见m.i.farbood，j.a.morris，a.e.downey，us pat.appl.to iff，us 4970163，1989年8月28日之前)。
[0339]
香紫苏醇向香紫苏二醇(9.1.4)(一种9.1.3的更高级中间体)的直接转化由hyphozyma roseonigra实现，但该微生物对(-)-香紫苏醇(9.1.1)的抗微生物活性具有低耐受性(参见x.wang，x.zhang，q.yao，d.hua，j.qing，braz.j.microbiol.2018，49s，160-165)。
[0340][0341]
为了生产独立于植物来源材料的9.1.3(龙涎呋喃/降龙涎香醚/龙涎呋喃)，schalk等人将生物遗传香紫苏醇途径转移到大肠杆菌(e.coli)中(参见m.schalk，l.pastore，m.a.mirata，s.khim，m.schouwey，f.deguerry，v.pineda，l.rocci，l.daviet，j.am.chem.soc.2012，134，18900-18903)。来自香叶基香叶基二磷酸(ggpp)的生物合成涉及两种二萜环化酶(参见下面的方案)。相应的基因在经遗传修饰以过量产生ggpp的大肠杆菌菌株中功能性表达，其允许以1.5g/l产生(-)-香紫苏醇(9.1.1)。基于这些结果，开发了在酵母中的工业发酵方法，其导致降龙涎香醚的新品质，命名为“ambrox super”(不要与“superambrox”即5(6)-脱氢-降龙涎香醚混淆)(参见r.l.snowden，chem.biodiv.2008，5，958-969)。
[0342][0343]
ggpp＝香叶基香叶基二磷酸
[0344]
sslps：鼠尾草labdadienyl二磷酸合酶
[0345]
ssscs：鼠尾草香紫苏醇合酶
[0346]
纯化的产品的用途
[0347]
本文还提供了本文所述的纯化的香精成分作为香精成分的用途。香精成分可用于消费食品和饮料产品应用中。
[0348]
因此，本文还提供了包含本文所述的纯化的香精成分的香精组合物。“香精组合物”可以例如是包含纯化的香精成分的任何组合物。香精组合物可例如进一步包含其他香精成分、载体材料、稀释剂或其组合。
[0349]
本文还提供了包含如本文所述的香精组合物的食品或饮料产品。
[0350]
本文还提供了本文所述的纯化的化妆品成分作为化妆品成分的用途。化妆品成分可用于化妆品中。
[0351]
因此，本文还提供了包含本文所述的纯化的化妆品成分的化妆品组合物。“化妆品组合物”可以例如是包含纯化的化妆品成分的任何组合物。化妆品组合物可例如进一步包含其他化妆品成分、载体材料、稀释剂或其组合。
[0352]
本文还提供了一种化妆品，其包含如本文所述的香精成分或香精组合物。化妆品
可以例如是护肤产品(例如保湿剂)、化妆产品(例如粉底、遮瑕膏、唇膏、眼影、眼线膏)、护发产品(例如洗发剂、护发素、染料)、口腔卫生产品(例如牙膏、漱口水)或除臭剂。
[0353]
本文还提供了本文所述的纯化的(-)-降龙涎香醚作为香精成分的用途。
[0354]
本文还提供了本文所述的纯化的香料成分例如本文所述的纯化的(-)-降龙涎香醚作为香料成分的用途。香料成分可用于消费品应用和精细香料应用。
[0355]
因此，本文还提供了香料组合物，其包含本文所述的纯化的香料成分例如本文所述的纯化的(-)-降龙涎香醚。“香料组合物”可以例如是包含纯化的香料成分例如纯化的(-)-降龙涎香醚和基质材料的任何组合物。
[0356]
如本文所用，“基质材料”包括所有已知的香料成分，其选自广泛的天然产物和目前可获得的合成分子，例如精油、醇类、醛类和酮类、醚类和缩醛类、酯类和内酯类、大环类和杂环类，和/或与一种或多种通常与香料组合物中的增香剂结合使用的成分或赋形剂(例如载体材料、稀释剂和本领域常用的其他助剂)的混合物。
[0357]
本领域已知的香料成分可容易地从主要的香料制造商商购获得。这类成分的非限制性实例包括：
[0358]-精油和提取物，例如海狸香、广木香根油、橡苔净油、香叶油、树苔净油、罗勒油、果油如香柠檬油和橘子油、香桃木油、玫瑰草油、广藿香油、橙叶油、茉莉油、玫瑰油、檀香油、苦艾油、薰衣草油和/或依兰-依兰油；
[0359]-醇类，例如肉桂醇((e)-3-苯基丙-2-烯-1-醇)；顺式-3-己烯醇((z)-己-3-烯-1-醇)；香茅醇(3,7-二甲基辛-6-烯-1-醇)；二氢月桂烯醇(2,6-二甲基辛-7-烯-2-醇)；ebanol
tm
((e)-3-甲基-5-(2,2,3-三甲基环戊-3-烯-1-基)戊-4-烯-2-醇)；丁香酚(4-烯丙基-2-甲氧基苯酚)；乙基芳樟醇((e)-3,7-二甲基壬-1,6-二烯-3-醇)；法呢醇((2e,6z)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯-1-醇)；香叶醇((e)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯-1-醇)；super muguet
tm
((e)-6-乙基-3-甲基辛-6-烯-1-醇)；芳樟醇(3,7-二乙基辛-1,6-二烯-3-醇)；薄荷醇(2-异丙基-5-甲基环己醇)；橙花醇(3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇)；苯基乙醇(2-苯基乙醇)；rhodinol
tm
(3,7-二甲基辛-6-烯-1-醇)；sandalore
tm
(3-甲基-5-(2,2,3-三甲基环戊-3-烯-1-基)戊-2-醇)；松油醇(2-(4-甲基环己-3-烯-1-基)丙-2-醇)；或timberol
tm
(1-(2,2,6-三甲基环己基)己-3-醇)；2,4,7-三甲基辛-2,6-二烯-1-醇和/或[1-甲基-2(5-甲基己-4-烯-2-基)环丙基]-甲醇；
[0360]-醛类和酮类，例如茴香醛(4-甲氧基苯甲醛)；α戊基肉桂醛(2-亚苄基庚醛)；georgywood
tm
(1-(1,2,8,8-四甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢萘-2-基)乙酮)；羟基香茅醛(7-羟基-3,7-二甲基辛醛)；iso e(1-(2,3,8,8-四甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢萘-2-基)乙酮)；((e)-3-甲基-4-(2,6,6-三甲基环己-2-烯-1-基)丁-3-烯-2-酮)；3-(4-异丁基-2-甲基苯基)丙醛；麦芽酚；甲基柏木酮；甲基紫罗兰酮；马鞭草烯酮；和/或香草醛；
[0361]-醚类和缩醛类，例如(3a,6,6,9a-四甲基-2,4,5,5a,7,8,9,9b-八氢-1h-苯并[e][1]苯并呋喃)；香叶基甲基醚((2e)-1-甲氧基-3,7-二甲基辛-2,6-二烯)；玫瑰醚(4-甲基-2-(2-甲基丙-1-烯-1-基)四氢-2h-吡喃)；和/或(2',2',3,7,7-五甲基螺[双环[4.1.0]庚烷-2,5'-[1,3]二噁烷])；
[0362]-大环类，例如黄葵内酯((z)-氧杂环十七碳-10-烯-2-酮)；巴西酸亚乙酯(1,4-二氧杂环十七烷-5,17-二酮)；和/或(16-氧杂环十六烷-1-酮)；和
[0363]-杂环类，例如异丁基喹啉(2-异丁基喹啉)。
[0364]
如本文所用，“载体材料”是指从增香剂的角度来看实际上是中性的材料，即不会显著改变增香剂的感官特性的材料。
[0365]
所谓“稀释剂”是指通常与增香剂结合使用的任何稀释剂，例如邻苯二甲酸二乙酯(dep)、一缩二丙二醇(dpg)、肉豆蔻酸异丙酯(ipm)、柠檬酸三乙酯(tec)和醇(例如乙醇)。
[0366]
术语“助剂”是指由于与所述组合物的嗅觉性能不具体相关的原因而可用于香料组合物中的成分。例如，助剂可以是用作加工一种或多种香料成分或包含所述成分的组合物的助剂的成分，或者它可以改善香料成分或含有香料成分的组合物的处理或储存，例如抗氧化助剂。所述抗氧化剂可以选自例如tt(basf)、q(basf)、生育酚(包括其异构体，cas 59-02-9；364-49-8；18920-62-2；121854-78-2)，2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-甲基苯酚(bht，cas 128-37-0)和相关酚、氢醌(cas 121-31-9)。
[0367]
它也可以是提供额外益处(例如赋予颜色或质地)的成分。它也可以是赋予香料组合物中所含的一种或多种成分耐光性或化学稳定性的成分。
[0368]
通常用于包含助剂的香料组合物中的助剂的性质和类型的详细描述不是详尽的，但必须提及的是，所述成分是本领域技术人员众所周知的。
[0369]
本文还提供了一种消费品，其包含如本文所述的香料组合物，包括其任何实施方案。消费品可以例如是家庭护理(例如清洁)、个人护理(例如化妆品)、衣物护理或空气护理组合物。
[0370]
以下编号的段落定义了本发明的特定实施方案：
[0371]
1.用于纯化粗香精或香料或化妆品成分或中间体的方法，该方法包括：
[0372]
用含水酸洗涤；
[0373]
用含水表面活性剂洗涤；和
[0374]
任选地用含水碱洗涤。
[0375]
2.段落1的方法，其中所述粗香精或香料或化妆品成分或中间体为固体形式。
[0376]
3.段落1或2的方法，其中所述粗香精或香料或化妆品成分或中间体通过生物转化过程制备。
[0377]
4.任一前述段落的方法，其中通过生物转化过程，使用shc/hac酶制备所述粗香精或香料或化妆品成分或中间体。
[0378]
5.任一前述段落的方法，其中该方法为用于纯化粗(-)-降龙涎香醚、粗(-)-龙涎香-氧化物、粗3a-乙基-6,6,9a-三甲基十二氢萘并[2,1-b]呋喃或粗(+)-龙涎缩醛的方法。
[0379]
6.任一前述段落的方法，其中该方法包括：
[0380]
(a)用含水酸洗涤粗香精或香料或化妆品成分或中间体；
[0381]
(b)用含水碱洗涤步骤(a)的产物；
[0382]
(c)用含水表面活性剂洗涤步骤(b)的产物。
[0383]
7.任一前述段落的方法，其中所述酸为弱酸。
[0384]
8.任一前述段落的方法，其中所述酸为有机酸。
[0385]
9.任一前述段落的方法，其中所述酸为柠檬酸。
[0386]
10.任一前述段落的方法，其中所述含水酸具有等于或大于约0.01wt％和/或等于或小于约15.0wt％，例如约0.1wt％至约5.0wt％的浓度。
[0387]
11.任一前述段落的方法，其中所述含水酸的温度范围为约17℃至约50℃，例如约17℃至约23℃。
[0388]
12.任一前述段落的方法，其中在用含水碱洗涤之前，将所述用含水酸洗涤重复一次或更多次。
[0389]
13.任一前述段落的方法，其中所述碱为强碱。
[0390]
14.任一前述段落的方法，其中所述碱为氢氧化物。
[0391]
15.任一前述段落的方法，其中所述碱为氢氧化钠。
[0392]
16.任一前述段落的方法，其中所述含水碱具有等于或大于约0.01wt％和/或等于或小于约15.0wt％，例如约0.1wt％至约5.0wt％的浓度。
[0393]
17.任一前述段落的方法，其中所述含水碱的温度范围为约5℃至约75℃，例如约35℃至约45℃。
[0394]
18.任一前述段落的方法，其中在用含水表面活性剂洗涤之前，将所述用含水碱洗涤重复一次或更多次。
[0395]
19.任一前述段落的方法，其中所述表面活性剂为阴离子型表面活性剂。
[0396]
20.任一前述段落的方法，其中所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠(sds)。
[0397]
21.任一前述段落的方法，其中所述含水表面活性剂具有等于或大于约0.01wt％和/或等于或小于约10.0wt％，例如约0.1wt％至约5.0wt％的浓度。
[0398]
22.任一前述段落的方法，其中所述含水表面活性剂的温度范围为约5℃至约75℃，例如约60℃至约70℃。
[0399]
23.任一前述段落的方法，其中将所述用含水表面活性剂洗涤重复一次或更多次。
[0400]
24.任一前述段落的方法，进一步包括在所述用含水酸洗涤、所述用含水碱洗涤和/或所述用含水表面活性剂洗涤之前或之后的一个或多个用水洗涤的步骤。
[0401]
25.任一前述段落的方法，其中在用含水表面活性剂洗涤之前将用含水碱洗涤的产物用水洗涤。
[0402]
26.段落24或25的方法，其中水的温度范围为约5℃至约75℃，例如约17℃至约23℃。
[0403]
27.段落25或26的方法，其中在用含水表面活性剂洗涤之前将用含水碱洗涤的产物用水洗涤两次或更多次。
[0404]
28.任一前述段落的方法，其中将用含水表面活性剂洗涤的产物用水洗涤。
[0405]
29.段落28的方法，其中将用含水表面活性剂洗涤的产物用温度范围为约50℃至约70℃的水洗涤，然后用温度范围为约17℃至约23℃的水洗涤。
[0406]
30.段落28或29的方法，其中将用含水表面活性剂洗涤的产物用温度范围为约50℃至约70℃的水洗涤两次或更多次。
[0407]
31.段落28至31中任一项的方法，其中将用含水表面活性剂洗涤的产物用温度范围为约17℃至约23℃的水洗涤两次或更多次。
[0408]
32.任一前述段落的方法，其中在纯化方法之前使粗香精或香料或化妆品成分或
中间体例如粗(-)-降龙涎香醚与生物转化培养基分离。
[0409]
33.段落31的方法，其中粗香精或香料或化妆品成分或中间体例如粗(-)-降龙涎香醚的分离通过物理方式例如通过过滤进行。
[0410]
34.段落33的方法，其中在所述分离之前对所述生物转化培养基进行热灭活步骤或碱化步骤。
[0411]
35.段落34的方法，其中所述碱化通过将所述生物转化培养基的ph增加至约10至约11的ph来进行。
[0412]
36.段落34的方法，其中所述热灭活通过将所述生物转化培养基的温度升高至55℃的最高温度来进行。
[0413]
37.任一前述段落的方法，其中所有洗涤步骤在单部设备中进行。
[0414]
38.任一前述段落的方法，其中所有洗涤步骤在那斯克型搅拌和干燥过滤器中进行。
[0415]
39.段落38的方法，其中基于所述粗(-)-降龙涎香醚的湿重，所述粗香精或香料或化妆品成分或中间体例如粗(-)-降龙涎香醚包含约20wt％至约30wt％的水。
[0416]
40.香精或香料或化妆品成分或中间体，例如(-)-降龙涎香醚，通过或可通过段落1至39中任一项的方法得到。
[0417]
41.段落40的香精或香料或化妆品成分例如(-)-降龙涎香醚作为香精或香料或化妆品成分的用途。
[0418]
42.香料组合物，包含段落40的香料成分例如(-)-降龙涎香醚。
[0419]
43.香精组合物，包含段落40的香精成分。
[0420]
44.化妆品组合物，包含段落40的化妆品成分。
[0421]
45.家庭护理、个人护理、洗衣护理或空气护理组合物，包含段落42的香料组合物。
[0422]
46.食品或饮料产品，包含段落43的香精组合物。
[0423]
47.化妆品，包含段落44的化妆品组合物。
[0424]
48.那斯克型搅拌和干燥过滤器，其被配置成用于通过段落1至39中任一项的方法来纯化粗香精或香料成分或中间体例如粗(-)-降龙涎香醚，其中基于所述粗香精或香料成分或中间体例如粗(-)-降龙涎香醚的湿重，所述粗香精或香料成分或中间体例如粗(-)-降龙涎香醚包含约20wt％至约30wt％的水。
[0425]
49.用于纯化粗香精或香料成分或中间体的方法，该方法包括在那斯克型搅拌和干燥过滤器中洗涤所述粗香精或香料成分或中间体。
[0426]
50.段落47的方法，其中该方法根据段落1至39中任一项。
实施例
[0427]
实施例1
[0428]
粗(-)-降龙涎香醚的制备
[0429]
为避免疑义，对wt shc和shc变体的所有提及均涉及wt aacshc(seq id no.1)及其变体。
[0430]
seq id no.1：酸热脂环酸芽胞杆菌(alicyclobacillus acidocaldarius)shc(aacshc)的氨基酸序列
[0431]
maeqlveapayartldraveyllscqkdegywwgpllsnvtmeaeyvllchildrvdrdrmekirryllheqredgtwalypggppdldttieayvalkyigmsrdeepmqkalrfiqsqggiessrvftrmwlalvgeypwekvpmvppeimflgkrmplniyefgswaratvvalsivmsrqpvfplperarvpelyetdvpprrrgakggggwifdaldralhgyqklsvhpfrraaeiraldwllerqagdgswggiqppwfyalialkildmtqhpafikgweglelygveldyggwmfqasispvwdtglavlalraaglpadhdrlvkagewlldrqitvpgdwavkrpnlkpggfafqfdnvyypdvddtavvvwalntlrlpderrrrdamtkgfrwivgmqssnggwgaydvdntsdlpnhipfcdfgevtdppsedvtahvlecfgsfgyddawkvirraveylkreqkpdgswfgrwgvnylygtgavvsalkavgidtrepyiqkaldwveqhqnpdggwgedcrsyedpayagkgastpsqtawalmaliaggraeseaarrgvqylvetqrpdggwdepyytgtgfpgdfylgytmyrhvfptlalgrykqaierr
[0432]
与wt aacshc相比，215g2 shc变体包括突变m132r、a224v和i432t。
[0433]
生物催化剂生产
[0434]
方法1
[0435]
shc质粒制备
[0436]
将编码酸热脂环酸芽孢杆菌角鲨烯何帕烯环化酶变体215g2 shc的基因插入到质粒pet-28a(+)中，其中它在iptg诱导型t7-启动子的控制下用于大肠杆菌中的蛋白质生产。pet-28a(+)(5369bp)的质粒图谱显示于wo2016/170099的图5中。pet-28a(+)质粒的克隆和表达区域显示在wo2016/170099的图21中。使用标准热激转化方案将质粒转化到大肠杆菌菌株bl21(de3)中。
[0437]
锥形瓶培养
[0438]
对于蛋白质生产，使用复合(lb)或基本培养基。m9是基本培养基的一个实例，其被成功使用。
[0439]
培养基制备
[0440]
对于350ml培养物，如下制备默认选择的基本培养基：向35ml柠檬酸/磷酸盐储备溶液(133g/l kh2po4，40g/l(nh4)2hpo4，17g/l柠檬酸.h2o，ph调节至6.3)中加入307ml h2o，根据需要，用32％naoh将ph调节至6.8。高压灭菌后，加入0.850ml 50％mgso4，0.035ml微量元素溶液(下一节中的组合物)溶液、0.035ml硫胺素溶液和7ml 20％葡萄糖。
[0441]
shc生物催化剂生产(生物催化剂生产)
[0442]
在小规模生物催化剂生产(野生型shc或shc变体)中，从包含shc生产质粒的大肠杆菌菌株bl21(de3)的预培养物接种350ml培养物(补充有50μg/ml卡那霉素的培养基)。使细胞在37℃下在恒定搅拌(250rpm)下生长至约0.5(od
650nm
)的光密度。
[0443]
然后通过加入iptg至300μm的浓度，然后在持续振荡下再孵育5至6小时来诱导蛋白质产生。最后通过离心收集所得生物质，用50mm tris-hcl缓冲液ph 7.5洗涤。将细胞作为沉淀储存在4℃或-20℃直至进一步使用。通常，从1升培养物中获得2.5至4克细胞(湿重)，与所用的培养基无关。
[0444]
制备发酵并在750ml inforsht反应器中运行。向发酵容器中加入168ml去离子水。反应容器配备有所有需要的探针(po2、ph、取样、消泡)、c+n进料和氢氧化钠瓶并高压灭菌。
[0445]
高压灭菌之后向反应器中添加：
[0446]
20ml 10x磷酸盐/柠檬酸缓冲液
[0447]
14ml 50％葡萄糖
[0448]
0.53ml mgso4溶液
[0449]
2ml(nh4)2so4溶液
[0450]
0.020ml微量元素溶液
[0451]
0.400ml硫胺素溶液
[0452]
0.200ml卡那霉素储备溶液
[0453]
运行参数设置如下：ph＝6.95，po2＝40％，t＝30℃，以300rpm搅拌。级联：rpm设定点为300，min 300，max 1000，流量l/min设定点0.1，min 0，max 0.6。消泡剂对照：1:9。
[0454]
给发酵罐从种子培养物接种至od
650nm 0.4-0.5。该种子培养物在lb培养基(+卡那霉素)中在37℃、220rpm下生长8h。发酵首先以分批模式运行11.5h，此后开始用补料溶液(无菌葡萄糖溶液(143ml h2o+35g葡萄糖))进行c+n补料，灭菌后向其中加入17.5ml(nh4)2so4溶液，1.8ml mgso4溶液，0.018ml微量元素溶液，0.360ml硫胺素溶液，0.180ml卡那霉素储备溶液。进料以约4.2ml/h的恒定流速运行。葡萄糖和nh
4+
在外部进行测量以评估培养物中c-源和n-源的可利用性。通常葡萄糖水平保持非常低。
[0455]
使培养物总计生长约25小时，其中它们达到典型和od
650nm 40-45。然后通过加入iptg至约10％的浓度开始shc生产。在发酵罐中1mm(作为iptg脉冲或使用输注注射器在3-4小时的时间期限内)，将温度设定为40℃且po2至20％。shc产生的诱导在40℃持续16h。在诱导结束时，通过离心收集细胞，用0.1m柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液ph 5.4洗涤，并在4℃或-20℃下作为沉淀储存直至进一步使用。
[0456]
通常，在所有其他条件不变的情况下，与复合培养基相比，当使用基本培养基时，所产生的生物催化剂的比活性更高。在30或37℃下成功进行诱导。注意到当在40-43℃下进行诱导时，获得了更高比活性的生物催化剂。发酵典型地产生20至30克细胞(湿重)。
[0457]
在125g/l e,e-高法呢醇(eeh)的生物转化
[0458]
典型的eeh生物转化反应在0.1m琥珀酸/naoh缓冲液ph 5.4中包含125g/l eeh、250g/l湿重的产生215g2 shc的细胞、1.3％sds。
[0459]
将反应体系在35℃下在恒定搅拌下孵育。用于制备生物转化的细胞混悬液的细胞湿重浓度可以例如通过在10℃和17210g下离心该细胞混悬液的等分部分10min来确定，以便计算在eeh生物转化反应中将细胞浓度设定为250g/l所需的细胞混悬液的体积。eeh转化通常在反应72小时内完成。
[0460]
粗(-)-降龙涎香醚的纯化
[0461]
粗(-)-降龙涎香醚包含70-75wt％的干物质和20-25wt％的水。干物质包含5-10wt％的化学和不溶性杂质。
[0462]
通过以下方法纯化粗(-)-降龙涎香醚：
[0463]
1)用室温的2.5wt％含水柠檬酸洗涤两次；
[0464]
2)用40℃的0.1wt％含水氢氧化钠洗涤两次；
[0465]
3)用室温的水洗涤两次；
[0466]
4)用70℃的0.5wt％十二烷基硫酸钠(sds)洗涤两次；
[0467]
5)用60℃的水洗涤两次；
[0468]
6)用室温的水洗涤两次或三次(直至滤液澄清)；
[0469]
获得高纯度(通过gc分析》99％)的嗅觉级(-)-降龙涎香醚，基于粗原料，平均收率
为95mol％(认为归因于从洗涤反应器转移到布氏过滤器期间的机械损失，反之亦然)。
[0470]
实施例2
[0471]
通过实施例1中所述的相同方法得到粗(-)-降龙涎香醚。
[0472]
将包含77.9wt％的(-)-降龙涎香醚、18.2wt％的水和3.9wt％的化学和不溶性杂质的10kg粗(-)-降龙涎香醚加入到50升容量不锈钢那斯克型搅拌过滤器中，其配备有双叶片底部入口搅拌器和5微米滤布。通过以下方法纯化粗(-)-降龙涎香醚：
[0473]
1)每次用20kg环境温度的2.5wt％含水草酸洗涤2次，
[0474]
2)每次用20kg温热(40℃)的0.1wt％含水氢氧化钠洗涤2次，
[0475]
3)每次用20kg环境温度的水冲洗2次，
[0476]
4)用20kg温热(40℃)的0.5wt％含水十二烷基硫酸钠(sds)洗涤1次，
[0477]
5)每次用20kg温热(40℃)的水冲洗2次，
[0478]
6)每次用20kg环境温度的水冲洗3次，
[0479]
7)每次用20kg环境温度的50wt％含水乙醇最终冲洗2次。
[0480]
在每次洗涤期间将浆料搅拌30分钟，并且在每次冲洗期间搅拌15分钟。然后停止搅拌器，通过抽吸将含水废液完全排出过滤器，然后加入下一次洗涤或冲洗液。
[0481]
在最终的水-醇冲洗之后，在过滤器中干燥滤饼，间歇搅拌，在40至45℃的温度和5mbar的压力下干燥12小时。排出过滤器以基于粗原料的94mol％收率递送7.4kg 99.2gc％纯的嗅觉级(-)-降龙涎香醚。
[0482]
上述广泛地描述了本发明的某些实施方案，但不限于此。对于本领域技术人员显而易见的变化和变型旨在落入由所附权利要求中限定和由所附权利要求限定的本发明的范围内。