甲基化DNA片段富集方法、组合物及套组与流程

本发明涉及用于富集多个甲基化dna片段的方法、组合物和套组。

背景技术：

1、dna中胞嘧啶的甲基化是各种疾病和病症的一个越来越重要的诊断标记。dna甲基化分析已被用作检测、诊断及/或表征癌症的诊断工具。这些诊断分析通常使用来自体液的细胞外片段化dna(cfdna)。在一些情况下，使用cfdna甲基化标记的测试可能需要使用昂贵的技术，例如nextgen定序，进行鉴定dna的多个高甲基化片段。此外，测试可能需要对大量目标和多个片段进行定序，以识别高甲基化片段。因此，需要提供富集甲基化或高甲基化片段的样本制备过程，从而减少进行后续加工，例如定序，的dna的量。

技术实现思路

1、本揭露提供了加工多个核酸片段的方法。这些方法可包括提供包括多个核酸片段的一输入样本，其中在所述多个核酸片段的至少一部分中，每个片段可包括一个或更多个甲基化胞嘧啶。所述方法可包括将所述输入样本的多个核酸片段的未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，产生转化的多个片段。所述方法可包括使用多个核酸的混合物对所述转化的多个片段进行复制，所述混合物包括结合部分修饰的胞嘧啶和缺乏结合部分的胞嘧啶的一混合物；结合部分修饰的鸟嘌呤和缺乏结合部分的鸟嘌呤；或者结合部分修饰的胞嘧啶、缺乏结合部分的胞嘧啶，结合部分修饰的鸟嘌呤，以及缺乏结合部分的鸟嘌呤。所述复制可产出多个结合部分修饰的片段和多个未修饰的片段的一混合物。所述方法可包括将至少一些所述结合部分修饰的片段结合到一基材上，产生多个结合片段和多个未结合的上清液片段。

2、所述核苷酸的混合物可以包括多个结合部分修饰的胞嘧啶。所述核苷酸的混合物可以包括多个结合部分修饰的鸟嘌呤。所述核苷酸的混合物可以包括多个结合部分修饰的胞嘧啶和多个结合部分修饰的鸟嘌呤。

3、所述方法可包括从所述多个未结合的上清液片段分离所述多个结合片段，产出富集一或多个甲基化胞嘧啶的多个片段的所述多个结合片段。所述方法可包括从所述多个未结合的上清液片段分离所述多个结合片段，产出富集两个或更多个甲基化胞嘧啶的多个片段的所述多个结合片段。

4、所述输入样本可以针对目标进行富集。所述输入样本可以在转化步骤之前针对目标进行富集。可以为一甲基化测定选定所述目标。可选择用于针对癌症、癌症类型、原始癌组织、癌症阶段或前述的组合的一甲基化测定的目标。

5、所述输入样本可以来自为诊断、疾病特征或使用一测试来评估多个高甲基化片段进行筛选的一受试者。所述输入样本可包括从一体液中分离的dna。所述输入样本可包括来自一cfdna样本的dna。所述输入样本可包括片段化基因组dna。

6、所述转化可通过包括对所述未甲基化胞嘧啶选择性脱氨基的方法来完成。所述转化可以通过将所述未甲基化胞嘧啶酶转化为尿嘧啶的方法来完成。

7、所述结合部分修饰的胞嘧啶可包括生物素修饰的胞嘧啶。所述结合部分修饰的鸟嘌呤可包括生物素修饰的鸟嘌呤。

8、所述基材可例如包括多个微粒珠(beads)或孔隙(wells)。

9、所述方法可产出多个结合片段，富集2个和更多的甲基化胞嘧啶的多个片段。所述方法可产出多个结合片段，富集5个或更多的甲基化胞嘧啶的多个片段。所述方法可产生多个结合片段，富集10个或更多的甲基化胞嘧啶的多个片段。

10、复制所述多个片段可包括在所述多个核苷酸的混合物存在下进行一第一引子延展反应。复制所述多个片段可包括在所述多个核苷酸的混合物存在下进行一第二引子延长反应。

11、提供所述输入样本可包括从一样本中获得，并且包括在所述输入样本中，可能包括多个cpg位点的多个核酸片段。提供所述输入样本可包括从一样本中获得，并且包括在所述输入样本中，可能包括1个或多个cpg位点的多个核酸片段。提供所述输入样本可包括从一样本中获取，并包括在所述输入样本中，可能包括2个或更多cpg位点的多个核酸片段。提供所述输入样本可包括从一样本中获得，并包括在所述输入样本中，可能包括3个或更多个cpg位点的多个核酸片段。提供所述输入样本可包括从一样本中获得，并且包括在所述输入样本中，相对于非癌症样本，在一癌症样本中高甲基化的多个核酸片段。提供所述输入样本可包括从一样本中获得，并且包括在所述输入样本中，相对于癌症样本，在非癌症样本中高甲基化的多个核酸片段。提供所述输入样本可包括从一样本中获得，并且包括在所述输入样本中，在特定目标组织中相对于其他组织高甲基化的多个核酸片段。

12、所述多个核苷酸的混合物可以包括1％到20％的结合部分修饰的胞嘧啶，其余的胞嘧啶缺乏所述结合部分。所述多个核苷酸的混合物可包括2.5％到10％的结合部分修饰的胞嘧啶，其余的胞嘧啶缺乏所述结合部分。所述多个核苷酸的混合物可以包括1％到20％的结合部分修饰的鸟嘌呤，其余的鸟嘌呤缺乏所述结合部分。所述多个核苷酸的混合物可包括2.5％到10％的结合部分修饰的鸟嘌呤，其余的鸟嘌呤缺乏所述结合部分。所述多个核苷酸的混合物可以包括1％到20％的结合部分修饰的胞嘧啶和鸟嘌呤，其余的胞嘧啶和鸟嘌呤缺乏所述结合部分。所述多个核苷酸的混合物可包括2.5％到10％的结合部分修饰的胞嘧啶和鸟嘌呤，其余的胞嘧啶和鸟嘌呤缺乏所述结合部分。

13、相对于所述输入样本，所述分离可产出富集用于一甲基化测定的多个信息丰富片段的多个结合片段。相对于所述输入样本，所述分离可产出多个结合片段，所述多个结合片段具有一降低含量的用于一甲基化测定的多个无信息片段。

14、所述方法可包括冲提所述多个结合片段以产出一片段文集，相对于所述输入样本，所述片段文集富集用于一甲基化测定的多个信息丰富片段。所述方法可包括冲提所述多个结合片段以产出一片段文集，相对于所述输入样本，所述片段文集具有一降低含量的用于一甲基化测定的多个无信息片段。

15、所述方法可以包括从所述片段文集制备一定序文集。所述方法可以包括对所述定序文集进行定序。所述定序可以执行到一定序深度的范围从5至20百万个序列数(reads)。所述定序可以进行到一定序深度的范围从5至15百万个序列数。所述定序可以进行到一定序深度的范围从5至15百万个序列数。

16、本公开提供了制作一组合物的方法，所述方法可包括组合多个腺嘌呤、多个胸腺嘧啶、多个胞嘧啶以及多个鸟嘌呤以制造所述组合物。所述多个胞嘧啶可包括多个结合部分修饰的胞嘧啶和多个缺乏结合部分的胞嘧啶。所述多个鸟嘌呤可包括多个结合部分修饰的鸟嘌呤和多个缺乏结合部分的鸟嘌呤。所述多个胞嘧啶可包括多个结合部分修饰的胞嘧啶和多个缺乏结合部分的胞嘧啶，以及所述多个鸟嘌呤可包括多个结合部分修饰的鸟嘌呤和多个缺乏结合部分的鸟嘌呤。

17、所述方法可包括在一缓冲溶液中组合所述多个腺嘌呤、多个胸腺嘧啶、多个胞嘧啶以及多个鸟嘌呤。所述组合物可包括从1至20％的多个结合部分修饰的胞嘧啶以及其余缺乏所述结合部分的所述胞嘧啶。所述组合物可包括从2.5至10％的多个结合部分修饰的胞嘧啶以及其余缺乏所述结合部分的所述胞嘧啶。所述组合物可包括从1至20％的多个结合部分修饰的鸟嘌呤以及其余缺乏所述结合部分的所述鸟嘌呤。所述组合物可包括从2.5至10％的多个结合部分修饰的鸟嘌呤以及其余缺乏所述结合部分的所述鸟嘌呤。所述组合物可包括从1至20％的多个结合部分修饰的胞嘧啶和鸟嘌呤，以及其余缺乏所述结合部分的所述胞嘧啶和鸟嘌呤。所述组合物可包括从2.5至10％的多个结合部分修饰的胞嘧啶和鸟嘌呤，以及其余缺乏所述结合部分的所述胞嘧啶和鸟嘌呤。

18、本公开提供了包括多个腺嘌呤、多个胸腺嘧啶、多个胞嘧啶以及多个鸟嘌呤的组合物，其中所述多个胞嘧啶、多个鸟嘌呤，或多个胞嘧啶和多个鸟嘌呤两者都包括在多个结合部分修饰的核苷酸和多个缺乏结合部分的核苷酸的一混合物中。所述组合物可缺乏或实质上缺乏多个结合部分修饰的腺嘌呤，并且缺乏多个结合部分修饰的鸟嘌呤。所述组合物可被提供于一缓冲溶液中。所述多个结合部分修饰的核苷酸可包括多个结合部分修饰的胞嘧啶。所述多个结合部分修饰的核苷酸可包括多个结合部分修饰的鸟嘌呤。所述多个结合部分修饰的核苷酸和多个缺乏所述结合部分的核苷酸的混合物可以在特定实施例中范围从1至20％的多个结合部分修饰的核苷酸以及其余缺乏所述结合部分的核苷酸。所述多个结合部分修饰的核苷酸和缺乏所述结合部分的核苷酸的所述混合物可以在特定实施例中范围从2.5至10％的多个结合部分修饰的核苷酸以及其余缺乏所述结合部分的核苷酸。所述多个结合部分修饰的核苷酸可包括多个生物素修饰的核苷酸。

19、本发明提供套组。所述套组可包括本发明的任何组合物。在某些实施例中，所述套组可包括使用所述组合物的说明。在各种实施例中，所述套组可包括用于分离多个核酸的多个试剂。在各种实施例中，所述套组可包括用于捕获多个核酸的一基材。在各种实施例中，所述套组可包括用于从一基材冲提多个核酸的多个试剂。在各种实施例中，所述套组可包括用于将多个核酸片段的未甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶的多个试剂。用于将多个核酸片段的未甲基化胞嘧啶转化为多个尿嘧啶的所述多个试剂可例如包括用于将所述未甲基化胞嘧啶脱氨基的多个试剂。用于将多个核酸片段的未甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶的所述多个试剂可例如包括通过酶转化进行转化的多个试剂。