用于治疗间皮素阳性癌症的组合物和方法与流程

本公开涉及过继性细胞疗法和癌症治疗学的领域。通过引用并入序列表序列表段落申请含有已经通过efs-web以ascii格式提交的序列表，并且通过引用将其全文并入本文。所述ascii副本创建于2021年8月17日，被命名为a2bi_019_03wo_seqlist_st25.txt，并且大小为1.08mb。

背景技术：

1、细胞疗法是治疗各种疾病，特别是癌症的有力工具。在常规过继性细胞疗法中，将免疫细胞工程化以表达特异性受体，例如嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)，其通过受体与靶细胞表达的配体的相互作用将免疫细胞的活性导向细胞靶。鉴定合适的靶分子仍然具有挑战性，因为许多靶分子在正常组织中表达。当移植细胞靶向表达靶分子的正常组织时，这种表达可能会导致毒性。因此，本领域需要用于通过过继性细胞疗法治疗疾病，特别是癌症的组合物和方法。

2、在1992年提出间皮素(msln)作为癌症靶(chang等人，《癌症研究(cancer res)》52:181-86)，然而仍然没有利用msln的可行疗法。它不仅在大多数间皮瘤上表达，而且在卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、胃癌、胰腺癌和肺腺癌的大亚型中也表达。(hassan等人《临床肿瘤学杂志(j clin oncol)》34:4171-79)在正常成人中，msln仅存在于间皮中，间皮本身可能是非必需的组织。已经测试了几种针对msln的研究疗法；例如，免疫毒素缀合物、抗体-药物缀合物、双特异性抗体、car-t和杂合tcr-scfv。

3、所有有效的全身施用疗法都是有毒的。因此，本领域需要与msln(+)癌症治疗相关的组合物和方法。

技术实现思路

1、本文提供了与msln(+)癌症治疗相关的组合物和方法。有利地，本文公开的组合物和方法可以利用杂合性丢失(loh)来解决msln(+)癌症。在一些情况下，本文公开的组合物和方法可以通过将msln靶向的活化剂受体与阻断剂受体配对来避免对正常组织的全身毒性。在不受理论束缚的情况下，由编码阻断剂抗原的基因座处的loh引起的阻断剂抗原在肿瘤和正常组织中表达的差异可赋予对肿瘤杀伤的高选择性。

2、本公开提供了免疫细胞，其包含：(a)第一受体，其包含对间皮素(msln)特异性的细胞外配体结合结构域；和(b)第二受体，其包含对msln+癌细胞中丢失的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中第一受体是响应于msln的活化剂受体；并且其中第二受体是响应于非靶抗原的抑制性受体。

3、在本公开的免疫细胞的一些实施例中，非靶抗原通过杂合性丢失而在msln+癌细胞中丢失。

4、在本公开的免疫细胞的一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合主要组织相容性复合物(mhc)蛋白的等位基因变体。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合hla-a、hla-b或hla-c蛋白的等位基因变体。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合hla-a*01、hla-a*02、hla-a*03、hla-a*11、hla-b*07或hla-c*07。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域特异性结合hla-a*02。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含如公开于表6中的互补决定区(cdr)cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3、cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3；或相对于表6或表7的cdr具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的cdr序列。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含seq id no:42-47或seq id no:48-53的互补决定区(cdr)cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3、cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3；或相对于seq id no:42-47或seq id no:48-53的cdr具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的cdr序列。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含选自表5中公开的多肽序列的多肽序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第二受体的细胞外配体结合结构域包含seq id no:30-41中任一个，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

5、在本公开的免疫细胞的一些实施例中，第一受体是嵌合抗原受体(car)。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含如公开于表2中的互补决定区(cdr)cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3、cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3；或相对于表2的cdr具有至多1、2或3个取代、缺失或插入的cdr序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含以下：包含表3中所示序列的可变重链(vh)部分和包含表4中所示序列的可变轻链(vl)部分；或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含可变重链(vh)部分，其包含seq id no:233或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列；以及可变轻链(vl)部分，其包含seq id no:279或与其具有85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含选自由seq id no:3-6、80和154-215组成的组的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一受体的细胞外配体结合结构域包含seq idno:171的scfv序列；或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

6、在本公开的免疫细胞的一些实施例中，第一受体包含铰链结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。在一些实施例中，铰链结构域包含cd8α铰链结构域。在一些实施例中，cd8α铰链结构域包含seq id no:7的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含cd28跨膜结构域。在一些实施例中，cd28跨膜结构域包含seq id no:11的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，细胞内结构域包含cd28共刺激结构域、4-1bb共刺激结构域和cd3ζ活化结构域。在一些实施例中，细胞内结构域包含seqid no:285的序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，第一受体包含seq id no:303的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

7、在本公开的免疫细胞的一些实施例中，第二受体包含lilrb1细胞内结构域或其功能变体。在一些实施例中，lilrb1细胞内结构域包含与seq id no:70至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。在一些实施例中，第二受体包含lilrb1跨膜结构域或其功能变体。在一些实施例中，lilrb1跨膜结构域或其功能变体包含与seq id no:74至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。在一些实施例中，第二受体包含lilrb1铰链结构域或其功能变体。在一些实施例中，lilrb1铰链结构域包含与seq id no:73至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。在一些实施例中，第二受体包含lilrb1细胞内结构域、lilrb1跨膜结构域、lilrb1铰链结构域、任何这些的功能变体或其组合。在一些实施例中，lilrb1铰链结构域、lilrb1细胞内结构域和lilrb1跨膜结构域包含seq id no:71或与seq id no:71至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或与其相同的序列。在一些实施例中，第二受体包含seq id no:348的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。

8、在本公开的免疫细胞的一些实施例中，msln+癌细胞是间皮瘤癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、结肠直肠癌细胞、食道癌细胞、头颈癌细胞、肾癌细胞、子宫癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、结肠直肠癌细胞或胆管癌细胞，或表达msln的任何癌细胞。在一些实施例中，msln+癌细胞是间皮瘤癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈细胞、子宫癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞或肺腺癌细胞。

9、在一些实施例中，msln+癌细胞是上皮癌细胞。上皮癌是起源于上皮细胞的癌症。在一些实施例中，msln+上皮癌是癌。

10、在本公开的免疫细胞的一些实施例中，msln+癌细胞是不表达hla-a*02的msln+/hla-a*02-癌细胞。在一些实施例中，msln+/hla-a*02-癌细胞通过在hla-a处的杂合性丢失导致hla-a*02丢失而衍生自msln+/hla-a*02+细胞。在一些实施例中，在具有杂合性丢失的msln+/hla-a*02-癌细胞存在下，第一受体和第二受体一起特异性活化免疫细胞。在一些实施例中，在未通过杂合性丢失而丢失hla-a*02的msln+细胞存在下，第一受体和第二受体一起不特异性活化免疫细胞。

11、在本公开的免疫细胞的一些实施例中，免疫细胞是t细胞。在一些实施例中，t细胞是cd8+cd4-t细胞。

12、在本公开的免疫细胞的一些实施例中，mhc i类基因的表达和/或功能已被降低或消除。在一些实施例中，mhc i类基因是β-2-微球蛋白(b2m)。在一些实施例中，免疫细胞进一步包含干扰rna，该干扰rna包含与b2m mrna的序列互补的序列。在一些实施例中，干扰rna包含选自表13所示序列组的序列，或相对于其具有至多1、2、3或4个取代、插入或缺失的序列。在一些实施例中，干扰rna能够诱导rnai介导的b2m mrna的降解。在一些实施例中，干扰rna是短发夹rna(shrna)。在一些实施例中，shrna包含：(a)第一序列，其从5'端至3'端具有与b2m mrna的序列互补的序列；以及(b)第二序列，其从5'端至3'端具有与第一序列互补的序列，其中第一序列和第二序列形成shrna。在一些实施例中，shrna由包含序列gcactcaaagcttgttaagatcgaaatcttaacaagctttgagtgc(seq id no:349)或gttaacttccaatttacataccgaagtatgtaaattggaagttaac(seq id no:350)或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列的序列编码。

13、在本公开的免疫细胞的一些实施例中，mhc i类基因的表达和/或功能已被降低或消除。在一些实施例中，mhc i类基因是β-2-微球蛋白(b2m)。在一些实施例中，免疫细胞包含对编码b2m的序列的一种或多种修饰，其中一种或多种修饰降低b2m的表达和/或消除其功能。在一些实施例中，一种或多种修饰包含编码b2m的内源性基因的一种或多种失活突变。在一些实施例中，一种或多种失活突变包含缺失、插入、取代或移码突变。在一些实施例中，用核酸引导的核酸内切酶在具有至少一种引导物核酸(gna)的复合物中引入一种或多种失活突变，该引导核酸特异性靶向编码b2m的内源性基因的序列。在一些实施例中，gna包含选自表12所示序列组的序列，或相对于其具有至多1、2、3或4个取代、插入或缺失的序列。

14、在本公开的免疫细胞的一些实施例中，mhc i类基因的表达和/或功能已被降低或消除。在一些实施例中，mhc i类基因是hla-a*02。在一些实施例中，免疫细胞包含多核苷酸，其包含干扰rna，该干扰rna包含与hla-a*02mrna的序列互补的序列。在一些实施例中，干扰rna能够诱导rna干扰(rnai)介导的hla-a*02mrna的降解。在一些实施例中，干扰rna是短发夹rna(shrna)，其包含：(a)第一序列，其从5'端至3'端具有与hla-a*02mrna的序列互补的序列；以及(b)第二序列，其从5'端至3'端具有与第一序列互补的序列，其中第一序列和第二序列形成shrna。在一些实施例中，shrna包含14中所示的序列。在一些实施例中，免疫细胞包含对编码hla-a*02的内源性基因的序列的一种或多种修饰，其中一种或多种修饰降低hla-a*02的表达和/或消除其功能。在一些实施例中，一种或多种修饰包含编码hla-a*02的内源性基因的一种或多种失活突变。在一些实施例中，用核酸引导的核酸内切酶在具有至少一种引导核酸(gna)的复合物中引入一种或多种失活突变，该引导核酸特异性靶向编码hla-a*02的内源性基因的序列。在一些实施例中，gna包含表11中所示的序列。

15、在本公开的免疫细胞的一些实施例中，第一受体包含seq id no:164的序列，并且第二受体包含seq id no:52的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，免疫细胞包含由包含gcactcaaagcttgttaagatcgaaatcttaacaagctttgagtgc(seq id no:349)或gttaacttccaatttacataccgaagtatgtaaattggaagttaac(seq id no:350)的序列或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列编码的shrna。在一些实施例中，第一受体和第二受体由单个多核苷酸编码，并且其中编码第一受体和第二受体的序列由编码自切割多肽的序列分开。在一些实施例中，自切割多肽包含t2a自切割多肽，其包含序列gsgegrgslltcgdveenpgp(seq id no:351)。

16、在本公开的免疫细胞的一些实施例中，免疫细胞是自体的。

17、在本公开的免疫细胞的一些实施例中，免疫细胞是同种异体的。

18、本公开提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的本公开的免疫细胞。在一些实施例中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

19、本公开提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的本公开的免疫细胞，用作治疗msln+癌症的药物。

20、本公开提供了一种多核苷酸或多核苷酸系统，其包含一种或多种多核苷酸，该多核苷酸包含编码以下的多核苷酸序列：(a)第一受体，其包含对间皮素(msln)特异性的细胞外配体结合结构域；和(b)第二受体，其包含对已经在msln+癌细胞中丢失的非靶抗原特异性的细胞外配体结合结构域，其中第一受体是响应于msln+癌细胞上的msln的活化剂受体；并且其中第二受体是响应于非靶抗原的抑制性受体。

21、在本公开的多核苷酸或多核苷酸系统的一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含用于生成本公开的免疫细胞的一种或多种多核苷酸，该多核苷酸包含编码第一受体和第二受体的多核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸或多核苷酸系统包含编码对b2m特异性的shrna的序列。在一些实施例中，编码第一受体、第二受体和对b2m特异性的shrna的序列由相同的多核苷酸编码。在一些实施例中，(a)编码对b2m特异性的shrna的序列包含gcactcaaagcttgttaagatcgaaatcttaacaagctttgagtgc(seq id no:349)或gttaacttccaatttacataccgaagtatgtaaattggaagttaac(seq id no:350)或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列；(b)编码第一受体的序列包含编码seq id no:303的多肽的序列，或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列；和(c)编码第二受体的序列包含编码seq id no:348的多肽的序列，或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同一性的序列。

22、本公开提供了一种载体，其包含本公开的一种或多种多核苷酸。

23、本公开提供了杀死在mhc i类基因座处具有杂合性丢失的msln+癌细胞的方法，其包含向受试者施用有效量的本公开的免疫细胞或药物组合物。

24、本公开提供了治疗患有在mhc i类基因座处具有杂合性丢失的msln+肿瘤的受试者体内msln+癌症的方法，其包含向受试者施用有效量的本公开的免疫细胞或药物组合物。

25、本公开提供了治疗受试者体内癌症的方法，其包含：(a)确定受试者的正常细胞和多种癌细胞的hla-a基因型或表达；(b)任选地，确定受试者的多种癌细胞中的msln的表达；以及(c)如果正常细胞表达hla-a*02并且多种癌细胞不表达hla-a*02，并且多种癌细胞是msln阳性的，则向受试者施用有效量的本公开的免疫细胞或药物组合物。

26、在本公开的方法的一些实施例中，受试者是患有表达msln(msln+)并且已经丢失hla-a*02表达的恶性肿瘤的杂合hla-a*02患者。在一些实施例中，受试者是患有表达msln并且已经丢失hla-a*02表达的复发性不可切除或转移性实体瘤的杂合hla-a*02患者。在一些实施例中，癌症包含

27、间皮瘤癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、头颈癌、肾癌、子宫癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、结肠直肠癌或胆管癌。在一些实施例中，癌症包含间皮瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、胃癌、胰腺癌或肺腺癌。在一些实施例中，癌症在受试者体内复发。在一些实施例中，癌症对一种或多种先前施用的抗癌疗法是难治性的。在一些实施例中，癌症是转移性的。

28、在本公开的方法的一些实施例中，癌细胞包含不表达hla-a*02的msln+/hla-a*02-癌细胞。在一些实施例中，msln+/hla-a*02-癌细胞通过在hla-a处的杂合性丢失导致hla-a*02丢失而衍生自mlsn+/hla-a*02+细胞。在一些实施例中，在msln+/hla-a*02-癌细胞存在下，第一受体和第二受体一起特异性活化免疫细胞。在一些实施例中，在未丢失hla-a*02的msln+细胞存在下，第一受体和第二受体一起不特异性活化免疫细胞。

29、在本公开的方法的一些实施例中，施用免疫细胞或药物组合物减小了受试者体内肿瘤的大小。在一些实施例中，肿瘤减小了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在一些实施例中，肿瘤被消除。

30、在本公开的方法的一些实施例中，施用免疫细胞或药物组合物阻止了受试者体内肿瘤的生长。

31、在本公开的方法的一些实施例中，施用免疫细胞或药物组合物减少了受试者体内肿瘤的数目。

32、在本公开的方法的一些实施例中，施用免疫细胞或药物组合物导致受试者体内癌细胞而非正常细胞的选择性杀伤。在一些实施例中，至少约60％的被杀死的细胞是癌细胞，约65％的被杀死的细胞是癌细胞，约70％的被杀死的细胞是癌细胞，约75％的被杀死的细胞是癌细胞，约80％的被杀死的细胞是癌细胞，约85％的被杀死的细胞是癌细胞，约90％的被杀死的细胞是癌细胞，约95％的被杀死的细胞是癌细胞，或约100％的被杀死的细胞是癌细胞。在一些实施例中，施用免疫细胞或药物组合物导致杀死受试者的至少约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或全部的癌细胞。

33、在本公开的方法的一些实施例中，与施用包含第一活化剂受体但不包含第二抑制性受体的其它方面等效的免疫细胞相比，施用免疫细胞或药物组合物对受试者产生更少的副作用。

34、本公开提供了制备多种免疫细胞的方法，其包含：(a)提供多种免疫细胞，以及(b)用本公开的多核苷酸、多核苷酸系统或载体转化多种免疫细胞。

35、本公开提供了试剂盒，其包含本公开的免疫细胞或药物组合物。在一些实施例中，试剂盒进一步包含使用说明书。