用于筛选胚胎的方法与流程

1.本发明总体上涉及分子生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及筛选胚胎的生存力和改善的产科结局的方法。2.相关技术描述尽管体外受精(in vitro fertilization，ivf)已经成功应用了数十年，但是不良产科结局(包括自然流产)仍然是ivf程序和患者的风险。存在对早期检测和预防不良的母体和胎儿产前结局的需要。虽然一些遗传筛选(例如筛选非整倍性)已是非常有帮助的，但这样的风险并没有被消除。需要另外的筛选技术来改善ivf情况的结局，包括在胚胎期可用于预测这样的结局的方法。

背景技术：

1、本技术要求于2020年7月31日提交的美国临时专利申请no.63/059,761和于2021年3月24日提交的美国临时专利申请no.63/165,221的权益，其整体通过引用并入本文。

2、根据37 c.f.r.1.821(c)，在此作为ascii兼容文本文件提交序列表，该文件命名为“shahp0002wo_st25.txt”，其创建于2021年7月30日，并且具有约1千字节的大小。前述文件的内容在此通过引用整体并入。

技术实现思路

1、本发明通过提供用于鉴定具有不良产科结局风险降低的胚胎的改进方法而克服了本领域在一些方面中的局限性。例如，在一些实施方案中，pappalysin-1(pappa，也称为妊娠相关血浆蛋白-a或papp-a)在胚胎组织(例如滋养外胚层细胞或合体滋养层细胞)中或在囊胚腔液中的表达降低，可表明不良产科结局的风险提高(例如，导致妊娠期间胚胎丧失)。在一些方面中，提供了选择用于体外受精(ivf)程序的胚胎的方法。在一些方面中，本文中提供的方法可用于植入前产前筛选(preimplantation prenatal screening，pps)。

2、在一些方面中，提供了体外检测胚胎活检、囊胚腔液和/或囊胚阶段植入前人胚胎的胚胎培养条件培养基中的pappa的方法。通过比较植入前囊胚阶段胚胎的pappa的mrna表达或蛋白质表达的程度，可以提供除整倍体状态之外的另外水平的胚胎选择，以选择用于移植至体外受精患者子宫的胚胎。

3、本公开内容的一个方面涉及在体外筛选胚胎的方法，其包括：(i)在体外获得处于囊胚发育阶段的胚胎，以及(ii)在一个或更多个胚胎细胞中、在囊胚腔液中和/或在用于储存或培养胚胎的胚胎培养液中测量妊娠相关血浆蛋白-a(pregnancy-associated plasmaprotein-a，pappa)的表达；其中pappa的表达降低至低于对照水平表明如果将胚胎植入到哺乳动物对象中时，则不良产科结局的风险提高。在一些实施方案中，在囊胚腔液中、在胚胎培养液中或者在一个或更多个胚胎细胞中测量pappa的表达。一个或更多个胚胎细胞可包含一个或更多个滋养层细胞或滋养外胚层细胞，或者由一个或更多个滋养层细胞或滋养外胚层细胞组成。一个或更多个滋养层细胞可包含合体滋养层细胞或由其组成。一个或更多个胚胎细胞可包含一个或更多个内细胞团细胞或由其组成。在一些实施方案中，不良产科结局是异常胎盘形成、自然流产、小于胎龄(small for gestational age，sga)、宫内生长受限(intrauterine growth restriction，iugr)、宫内胎儿死亡(intrauterine fetaldemise，iufd)或先兆子痫。在一些实施方案中，所述测量通过检测或测量编码pappa的mrna来进行。例如，所述测量可通过以下来进行：northern印迹分析、核酸酶保护测定(nucleaseprotection assay，npa)、原位杂交、逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，rt-pcr)或下一代mrna测序(mrna sequencing，mrna-seq)。在一些实施方案中，逆转录-聚合酶链反应(rt-pcr)进一步限定为逆转录定量pcr(rt-qpcr)或半定量pcr。在一些实施方案中，所述测量通过检测或测量pappa蛋白来进行，其是通过western印迹、高效液相色谱(high-performance liquid chromatography，hplc)、液相色谱-质谱(liquid chromatography–mass spectrometry，lc/ms)、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)、蛋白质免疫染色或电化学发光免疫测定(electrochemiluminescence immunoassay，eclia)来实现。在一些实施方案中，所述测量通过elisa来进行。所述方法还可包括测试胚胎的非整倍性(pgt-a)。所述方法还可包括选择用于植入到哺乳动物对象中的胚胎。在一些实施方案中，将胚胎植入到哺乳动物对象中作为体外受精(ivf)方法的一部分。在一些实施方案中，胚胎是由获自供体的卵母细胞和/或精子产生。供体是哺乳动物对象，例如人。在一些实施方案中，供体是第一人对象，并且其中所述哺乳动物对象是第二人对象。在一些实施方案中，哺乳动物对象是牛、绵羊、马、狗、猫、狮子、豹、雪貂(ferret)、山羊或猪。哺乳动物对象可以是家养动物。在一些实施方案中，哺乳动物对象是濒危物种。在一些实施方案中，哺乳动物对象是人。所述方法还可包括进行另外的遗传测试。另外的遗传测试可包含测试胚胎中遗传疾病的存在或由测试胚胎中遗传疾病的存在组成。在一些实施方案中，胚胎进一步限定为人胚胎，并且其中遗传疾病是亨廷顿病、镰状细胞贫血、肌营养不良、囊性纤维化(cystic fibrosis，cf)、brca1突变、brca2突变、脆性x综合征或泰-萨克斯病(tay-sachs disease)。

4、本文中使用的就指定组分而言“基本上不含”在本文中用于意指指定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。由组合物的任何意外污染引起的指定组分的总量优选低于0.01％(w/w)。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到指定组分之量的组合物。

5、如本文在说明书中所用的，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或更多个/种。如本文在权利要求书中所使用的，当与词语“包含/包括”结合使用时，没有数量词修饰的名词可以意指一个/种或多于一个/种。

6、除非明确地指出仅指替代方案或者替代方案相互排斥，否则权利要求书中术语“或/或者”的使用用于意指“和/或”，但是本公开内容支持指仅替代方案和“和/或”的定义。本文中使用的“另一”可意指至少第二个/种或更多个/种。

7、贯穿本技术中，术语“约”用于表示值包括用于装置、用来确定所述值的方法的固有误差变异，或者所述研究对象之间存在的变异。

8、通过以下详细描述，本发明的另一些目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解，虽然指示了本发明的优选实施方案，但是详细描述和具体实施例仅以示例说明的方式给出，因为对本领域技术人员而言，根据该详细描述，本发明的精神和范围内的多种变化和修改将变得明显。