用于耐药性筛选的方法和组合物与流程

本技术所涉及的发明是一种新的诊断方法和引物和/或药物敏感性测试(dst)试验。尤其地，本发明涉及新型引物和它们在识别和/或检测来自疑似或确诊结核病的受试者的样品中的耐药性突变的存在的方法中的用途。

背景技术：

1、分枝杆菌和结核病

2、主要由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)1,2导致的结核病(tb)是对全球健康有影响的疾病3–5。在结核分枝杆菌复合群(mtbc)中结核分枝杆菌和相关细菌出现于至少11000年前，并且自那时起一直与它们的宿主共同进化6,7。这一历史导致了高传染性细菌分类群，其在它们的宿主中长期存在并且具有先进的免疫系统逃逸方法7。

3、由于这种共同进化，现代结核分枝杆菌(m.tuberculosis)和mtbc的成员共有许多特征，并且与非结核分枝杆菌(ntm)群7,8的成员共同存在于每个已知环境中(极地区域除外)。mtbc由10种能够在它们的宿主中导致tb或类似tb的疾病的分枝杆菌组成，其中三种专属人类的tb物种是狭义结核分枝杆菌、卡氏分枝杆菌(mycobacterium canettii)和非洲分枝杆菌(mycobacterium africanum)1,7,9。此外，从牛(牛分枝杆菌(mycobacteriumbovis))、山羊和绵羊(mycobacterium caprae)、海豹和海狮(mycobacterium pinnipedii)和啮齿动物(田鼠分枝杆菌(mycobacterium microti))传播到人类，反之亦然的人畜共患tb的传播被充分证实4,6,7。目前，新增了三个物种，牛和羚羊中的mycobacterium orygis7,10、狐獴中的mycobacterium suricattae7,11和獴科中的mycobacterium mungi7,12。

4、目前的研究发现，mtbc成员是高度基因同质的，具有高达99.7％的核苷酸同源性，并且具有相同的16s序列7。mtbc成员主要是克隆的，具有较少水平基因转移，这使得在遗传水平上很难区分不同物种，也不可能采用显微镜法2,4,6,13。

5、分枝杆菌是革兰氏阳性抗酸杆菌，约2μm长，其主要通过气溶胶传播；它们是完全在细胞内的，并且在它们特有的宿主之外没有已知的环境库1,7,14。富含脂质的细胞壁和肽聚糖层、脂聚糖层、分枝菌酸层和蜡质层形成极其顽强的微生物7,14。许多分枝杆菌和mtbc的全部成员的典型特征是在培养基中和体内挑剔并且生长速度缓慢2,6,15,16。

6、结核病最常表现为肺部疾病(约80％的情况)，尽管肺外和弥散性疾病的形式也有发生1,2,17。分枝杆菌疾病对全球中低收入和发展中国家(lmics)造成高疾病负担3,6,18。据世界卫生组织(who)估计，三分之一的人口携带潜伏性tb(ltbi)，每年有900万至1100万例tb病例19。全球每年死于tb的人数估计在150万至200万，这使得tb成为感染相关死亡的最大单一威胁6,20,21。

7、分枝杆菌耐药性

8、who定义耐药性为微生物对曾经能够治疗该微生物感染的抗菌药物的抵抗力。tb的耐药性(dr)菌株的出现很大程度上是治疗方案的不一致实践、延迟治疗和/或患者在长期治疗过程中违约的结果，这导致耐药性的阳性选择和宿主间抗性菌株转移的更高发生率3,22,23。

9、目前有几种类型的耐药性tb：多重耐药(mdr)型，其至少对利福平和异烟肼有耐药性；广泛耐药(xdr)型，其增加了对任何氟喹诺酮类药物和至少一种二线注射用药有耐药性，超出了在mdr中发现的耐药性；极端耐药(xxdr)型，其对所有一线和二线药物有耐药性；和全耐药(tdr)型，其对目前所有tb药物有耐药性16,24。此外，在mtbc中的一些物种具有谱系特有的内在耐药性，例如牛分枝杆菌(m.bovis)和卡氏分枝杆菌(m.canettii)，如果其被误诊会使得控制耐药性的方法复杂化2,22,24。

10、耐药性tb(dr-tb)随着发病率的增加成为全球日益严重的问题21,22,25。令人担忧的是，耐药菌株将逆转在消灭tb方面取得的进展6,22,23。过去十年，全球范围内耐药tb的发病率增加了至少10倍，2009年仅4.9％的患者表现出耐药性，而2018年为51％19。在2018年，全球约1050万tb病例有近500000例是mdr，并且其中有31000(6.2％)是xdr19。

11、mdr-tb是最常见的耐药性类型16,24。mdr被定义为对异烟肼和利福平有耐药性的tb菌株25。mdr-tb菌株通常采用who认可的传统药物方案治疗，该方案需要6个月的一线和二线抗生素疗程。xdr-tb是增加对任何氟喹诺酮类和阿米卡星、卷曲霉素或卡那霉素的二线药物的耐药性的mdr菌株25,26。治疗xdr-tb的具体方案的选择可以在可行的情况下通过培养基或分子(例如基因型mtbdrsl-bruker)药物敏感性测试(dst)试验6,26,27进行指导。由于在诊断和治疗tb的mdr菌株和xdr菌株中的困难，这些病例的死亡率很高，mdr的死亡率约为50％，xdr-tb感染的死亡率超过70％25。

12、针对tb的一线治疗是抗生素的组合；利福平、异烟肼、乙胺丁醇和吡嗪酰胺使用超过6个月。对这些抗生素治疗方法的耐药性导致二线抗生素的使用(氟喹诺酮类药物、阿米卡星、卷曲霉素和卡那霉素)，其效果更差并且毒性更大24,25。这些治疗方法通常需要注射，这需要更先进的医疗设备和对治疗的监督24。

13、分枝杆菌中的耐药性是突变的，而不是可转移的，在过去十年中，许多单核苷酸多态性(snp)已经被报道与耐药性相关。然而，不是所有都在文献中有充足的证据来支持这种关联。世界卫生组织(who)和其他组织将已经报道的耐药性snp分为高、中和低置信等级28,29。

14、下一代靶向测序

15、who宣布了到2035年有效消灭tb的目标，并发布了如何在2015年实现这一目标的指导方针22,23,25,30。who确定的消灭战略的核心是呼吁采用新的诊断技术和更快速的药物敏感性测试(dst)能力23,30–32。进一步的要求是这些技术能够有效用于tb负担很高并且普遍缺乏医疗基础设施的高发病率、资源匮乏的国家6,21,30。

16、用于mtb检测和抗生素耐药性研究的非分子“金标准”是培养来自患者的样品。但是，培养需要训练有素的实验技术人员并且通常非常缓慢。目前用于mtb检测和利福平(rif)耐药性研究(mdr-tb的替代指标)的“金标准”分子试验是xpert mtb/rif测定法，这是一种能够快速给出结果的基于盒(cartridge-based)的核酸扩增测试。这个测试容易使用，但是它只能识别rif耐药性，因此不能诊断xdr-tb33。

17、find(创新诊断基金会)seq&treat项目(https://www.finddx.org/tb/seq-treat/)特别呼吁开发基于下一代靶向测序(tngs)的dr-tb测试，该测试可以由find评估并且有可能被who认可。基于测序的测试具有检测所有耐药性相关的snp的潜力，从而确定哪种药物对感染患者的mtb菌株最有效(kayomo et al.sci rep 10,10786(2020).https://doi.org/10.1038/s41598-020-67479-4)。

18、tngs能够采用下一代测序对基因组的特定区域进行测序，以检测感兴趣区域中的变异。有不同方法进行靶向测序，最常见的是扩增子测序，其使用pcr引物以扩增感兴趣的序列。

19、当待靶向多个基因时，多重聚合酶链式反应(多重pcr)可用于同时扩增几个不同dna靶标序列。这个过程在热循环仪中采用多重引物和温度调控的dna聚合酶在样品中来扩增dna。

20、由于耐药性snp存在于整个基因组的多个位点上，多个区域需要通过pcr被靶向。多重pcr对在单独反应中单个区域的扩增提供巨大优势，包括更高通量、节约成本(更少的脱氧核苷酸三磷酸腺苷、酶和其他所需消耗品)、周转时间和从有限的起始材料产生更多数据。

21、但是，多重pcr的引物设计是复杂的。引物必须具有相同的退火温度，每一对都需要对其靶标是特定的，并且引物对应扩增相同大小的pcr产物以保证在反应中多个靶标之间相同的扩增效率。此外，由于多重反应中引物之间的相互作用会降低扩增效率，反应中的引物越多，这种情况越可能发生。设计高效、灵敏且特异的多重pcr是富有挑战的，并且不能保证成功。

22、由genoscreen开发的myc-tb是基于illumina短读测序34,35，用于预测对15种抗结核病药物的耐药性的靶向dr-tb测试的一个示例(已经开发了其他测试，但全部具有相似的灵敏度和周转时间)。这个测试花费约2天来进行并具有约1000个mtb细胞的检测限制。目前仍需要更快速且灵敏的测试。

23、本发明的目的在于解决上述问题并且满足上述需求。因此，本发明的目的在于提供一种使用tngs以快速且准确地检测和/或识别来自疑似或确诊tb的受试者的样品中耐药性突变的存在的方法。进一步的目的在于开发用于实现该目标的引物，聚焦于开发用于多重pcr的引物。本发明的另一个目的在于提供解决上述问题的试验或试剂盒。

技术实现思路

1、选择了已知赋予对一线和二线抗tb药物的耐药性的单核苷酸多态性(snp)，并且针对所选靶标开发了引物并优化了其在多重pcr中的使用。基因靶标是eis、embb、rrs、rv0678、fabg1、gyra、rpob、etha、rplc、katg、gidb、inha、rrl、pnca、rpsl、tlya。

2、因此，第一方面，提供了一种或多种寡核苷酸引物集，所述一种或多种寡核苷酸引物集用于扩增来自结核分枝杆菌复合群(m.tuberculosis complex)中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的一种或多种基因的部分，所述一种或多种基因选自包括或由eis、embb、etha、fabg1、gidb、gyra、inha、katg、pnca、rrl、rplc、rpob、rpsl、rrs、rv0678和tlya中的一种或多种组成的组，其中，每个集包括特异于所述部分的一对正向和反向引物，其中，每个引物具有如在seq id no.1-33所示的序列。优选地，所述一种或多种引物集选自seq id no.1-32。

3、在一些实施方式中，所述寡核苷酸引物集包括以下项或由以下项组成：seq idno.1和2；3和4；5和6；7和8；9和10；11和12；13和14；15和16；17和18；19和20；21和22；23和24；25和26；27和28；29和30；31和32；和19和33中的一种或多种。

4、在一些实施方式中，所述一种或多种基因的部分包括一种或多种突变，优选地，赋予耐药性的一种或多种突变，优选地其中，所述一种或多种突变是一种或多种赋予抗生素耐药性的单核苷酸多态性。在一些实施方式中，所述抗生素耐药性是对乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、链霉素、阿米卡星、贝达喹啉、卷曲霉素、环丙沙星、氯苯吩嗪、乙硫异烟胺、卡那霉素、利奈唑胺、莫西沙星、氧氟沙星和喹诺酮类中的一种或多种的耐药性。

5、在一些实施方式中，所述一种或多种基因来自mtbc。

6、在一些实施方式中，所述寡核苷酸引物集可用于多重pcr。因此引物集可分为多重组。在一些实施方式中，可以形成一个或多个多重组。在一些实施方式中，可以形成多重组，每个多重组都包括如seq id no.1-33中，优选地seq id no.1-32所示的一个或多个寡核苷酸引物集。在一些实施方式中，可以形成一个或多个多重组，每个多重组都包括寡核苷酸引物集，所述寡核苷酸引物集包括或由seq id no.1和2；3和4；5和6；7和8；9和10；11和12；13和14；15和16；17和18；19和20；21和22；23和24；25和26；27和28；29和30；31和32；和19和33中的一种或多种组成。

7、在一些实施方式中，多重组可包括用于扩增eis、embb、rrs、rv0678和fabg1(第1组)的部分的寡核苷酸引物集。在另一个实施方式中，多重组可包括用于扩增gyra、rpob、etha、rplc和katg(第2组)的部分的寡核苷酸引物集。在另一个实施方式中，多重组可包括用于扩增gidb、inha、rrl、pnca、rpsl和tlya(第3组)的部分的核苷酸引物集。因此，在一些实施方式中，所述寡核苷酸引物集的组包括以下项或由以下项组成：seq id no.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10(表7中的第1组)中的一种或多种；seq id no.11、12、13、14、15、16、17、18、19和20(表7中的第2组)中的一种或多种；和/或seq id no.21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32(表7中的第3组)中的一种或多种。

8、因此，在一个实施方式中，提供寡核苷酸引物集的一个或多个多重组，所述寡核苷酸引物集用于扩增来自mtbc中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的基因的部分，所述基因选自包括以下项的作用或由以下项组成的组：eis、embb、etha、fabg1、gidb、gyra、inha、katg、pnca、rrl、rplc、rpob、rpsl、rrs、rv0678和tlya中的一种或多种，其中，每个寡核苷酸引物集包括特异于所述部分的一对正向和反向引物或由特异于所述部分的一对正向和反向引物组成，其中，所述寡核苷酸引物集的多重组包括以下项或由以下项组成或由seq idno.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10(表7中的第1组)中的一种或多种；seq id no.11、12、13、14、15、16、17、18、19和20(表7中的第2组)中的一种或多种；和/或seq id no.21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32(表7中的第3组)中的一种或多种。

9、在一些这种实施方式中，所述寡核苷酸引物集的多重组包括以下项或由以下项组成：seq id no.1和2；3和4；5和6；7和8；以及9和10(表7中的第1组)中的一种或多种；seq idno.11和12；13和14；15和16；17和18；以及19和20(表7中的第2组)中的一种或多种；和/或seq id no.21和22；23和24；25和26；27和28；29和30；以及31和32(表7中的第3组)中的一种或多种。在一些实施方式中，所述寡核苷酸引物集的多重组包括以下项或由以下项组成seqid no.1和2；3和4；5和6；7和8；以及9和10(表7中的第1组)中的一种或多种。在一些实施方式中，所述寡核苷酸引物集的多重组包括以下项或由以下项组成seq id no.11和12；13和14；15和16；17和18；以及19和20(表7中的第2组)中的一种或多种。在一些实施方式中，所述寡核苷酸引物集的多重组包括以下项或由以下项组成seq id no.21和22；23和24；25和26；27和28；29和30；以及31和32(表7中的第3组)中的一种或多种。

10、第二方面，提供一种多重pcr反应混合物，所述混合物包括寡核苷酸引物集的一个或多个组，所述寡核苷酸引物集用于扩增来自结核分枝杆菌复合群中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的一种或多种基因的部分，所述一种或多种基因选自包括以下项的组或由以下项组成的组：eis、embb、etha、fabg1、gidb、gyra、inha、katg、pnca、rrl、rplc、rpob、rpsl、rrs、rv0678和tlya中的一种或多种，其中，每个集包括特异于所述部分的一对正向和反向引物，其中，所述寡核苷酸引物集的组包括以下项或由以下项组成：seq id no.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10(表7中的第1组)中的一种或多种；seq id no.11、12、13、14、15、16、17、18、19和20(表7中的第2组)中的一种或多种；和/或seq id no.21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32(表7中的第3组)中的一种或多种。

11、在一些实施方式中，多重pcr反应混合物包括寡核苷酸引物集的组，所述寡核苷酸引物集包括以下项或由以下项组成：seq id no.1和2；3和4；5和6；7和8；以及9和10(表7中的第1组)中的一种或多种；seq id no.11和12；13和14；15和16；17和18；以及19和20(表7中的第2组)中的一种或多种；和/或seq id no.21和22；23和24；25和26；27和28；29和30；以及31和32(表7中的第3组)中的一种或多种。在一个实施方式中，多重pcr反应混合物包括寡核苷酸引物集的组，所述寡核苷酸引物集包括以下项或由以下项组成：seq id no.1和2；3和4；5和6；7和8；以及9和10(表7中的第1组)。在另一个实施方式中，多重pcr反应混合物包括寡核苷酸引物集的组，所述寡核苷酸引物集包括以下项或由以下项组成seq id no.11和12；13和14；15和16；17和18；以及19和20(表7中的第2组)中的一种或多种。在另一个实施方式中，多重pcr反应混合物包括寡核苷酸引物集的组，所述寡核苷酸引物集包括以下项或由以下项组成seq id no.21和22；23和24；25和26；27和28；29和30；以及31和32(表7中的第3组)。

12、多重pcr反应混合物可包括进行多重pcr所需的其他成分和试剂，例如缓冲液、碱磷酸去氧核苷酸(dntp)、dmso、水和dna聚合酶。

13、在多个实施方式中，所述引物可混合为0.2μm的工作浓度。此外，为了一致的靶标扩增，通常需要0.3μm的工作浓度的tlya除外。

14、在一些实施例中，来自结核分枝杆菌复合群中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的所述一种或多种基因的部分从来自疑似或确诊tb的受试者的样品中获得。样品可以是从受试者获得的一种或多种组织和/或体液，包括痰液；尿液；血液；血浆；血清；滑液；脓；脑脊液；胸膜液；心包液；腹水；汗液；唾液；泪液；阴道分泌物；精液；组织间液；支气管肺泡灌洗液；支气管冲洗液；胃灌洗液；胃冲洗液；经气管或支气管细针抽吸液；骨髓；胸膜组织；来自淋巴结、纵隔镜检查、胸腔镜检查或经支气管活检的组织中的一种或多种；或它们的组合；或从疑似有或确诊有tb的受试者获得的一种或多种组织和/或体液的培养标本。通常，样品包括来自结核分枝杆菌复合群中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的细胞和/或dna。

15、第三方面，提供一种检测和/或识别在包括来自结核分枝杆菌复合群中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的dna的样品中一种或多种突变的存在的方法，所述一种或多种突变赋予抗生素耐药性，所述方法包括以下步骤：

16、(a)从所述样品中分离或提取dna；

17、(b)采用根据第一方面所述的寡核苷酸引物集的一个或多个组通过多重聚合酶链式反应来扩增相关基因区域或扩增子；

18、(c)将扩增的基因区域或扩增子进行dna测序；以及检测一种或多种突变。

19、在一些实施方式中，所述突变发生在选自由eis、embb、etha、fabg1、gidb、gyra、inha、katg、pnca、rrl、rplc、rpob、rpsl、rrs、rv0678和tlya中的一种或多种组成的组的一种或多种基因中。

20、在一些实施方式中，所述突变是一种或多种单核苷酸多态性。

21、在一些实施方式中，所述抗生素耐药性是对乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、链霉素、阿米卡星、贝达喹啉、卷曲霉素、环丙沙星、氯苯吩嗪、乙硫异烟胺、卡那霉素、利奈唑胺、莫西沙星、氧氟沙星和喹诺酮类中的一种或多种的耐药性。

22、扩增步骤使用寡核苷酸引物集的一个或多个组。在一些实施方式中，所述寡核苷酸引物集的组包括一种或多种正向和反向引物对或由一种或多种正向和反向引物对组成，所述一种或多种正向和反向引物对选自seq id no.1和2；3和4；5和6；7和8；9和10；11和12；13和14；15和16；17和18；19和20；21和22；23和24；25和26；27和28；29和30；31和32以及19和33。

23、在一些实施方式中，所述寡核苷酸引物集的一个或多个组包括以下项或由以下项组成：seq id no.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10(表7中的第1组)中的一种或多种；seq idno.11、12、13、14、15、16、17、18、19和20(表7中的第2组)中的一种或多种；和/或seq id no.21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32(表7中的第3组)中的一种或多种。在一些实施方式中，所述扩增步骤使用由seq id no.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10(第1组)组成的寡核苷酸引物集的组。在一些实施方式中，所述扩增步骤使用由seq id no.11、12、13、14、15、16、17、18、19和20(第2组)组成的寡核苷酸引物集的组。在一些实施方式中，所述扩增步骤使用由seq idno.21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32(第3组)组成的寡核苷酸引物集的组。

24、检测到突变表明有抗生素耐药性。识别所述突变告知或允许对抗生素耐药性的性质的识别(即细菌对抗生素有耐药性)。

25、因此，第四方面，提供预测结核病患者是否会对乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、链霉素、阿米卡星、贝达喹啉、卷曲霉素、环丙沙星、氯苯吩嗪、乙硫异烟胺、卡那霉素、利奈唑胺和莫西沙星中的一种或多种的治疗产生反应的方法，所述方法包括在一种或多种基因中检测一种或多种耐药突变的存在的步骤，所述一种或多种基因选自包括来自所述患者的样品中获得的dna中的eis、embb、etha、fabg1、gidb、gyra、inha、katg、pnca、rrl、rplc、rpob、rpsl、rrs、rv0678和tlya中的一种或多种的组，所述方法包括：

26、(a)从所述样品中分离或提取dna；

27、(b)采用根据第一方面所述的寡核苷酸引物集的一个或多个组通过多重聚合酶链式反应来扩增相关基因区域或扩增子；

28、(c)将扩增的基因区域或扩增子进行dna测序；以及

29、检测所述一种或多种突变。

30、在一些实施方式中，所述方法是用于预测结核病患者是否对乙胺丁醇、异烟肼、链霉素、阿米卡星、贝达喹啉、卷曲霉素、氯苯吩嗪、乙硫异烟胺、卡那霉素中的一种或多种的治疗产生反应，其中所述一种或多种基因是eis、embb、rrs、rv0678和fabg1；以及所述寡核苷酸引物集的组由seq id no.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10(表7中的第1组)组成。

31、在一些实施方式中，所述方法是用于预测结核病患者是否对异烟肼、利福平、环丙沙星、乙硫异烟胺、利奈唑胺、莫西沙星、氧氟沙星和喹诺酮类中的一种或多种的治疗产生反应，其中所述一种或多种基因是gyra、rpob、etha、rplc和katg；以及所述寡核苷酸引物集的组由seq id no.11、12、13、14、15、16、17、18、19和20(表7中的第2组)组成。

32、在一些实施方式中，所述方法是用于预测结核病患者是否对吡嗪酰胺、链霉素、卷曲霉素和乙硫异烟胺中的一种或多种的治疗产生反应，其中所述一种或多种基因是gidb、inha、rrl、pnca、rpsl和tlya；以及所述寡核苷酸引物集的组由seq id no.21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32(表7中的第3组)组成。

33、在根据第三或第四方面的一些实施方式中，所述dna来自结核分枝杆菌。

34、在根据第三或第四方面的一些实施方式中，所述样品是临床样品。所属样品可以是从疑似有或确诊有tb的受试者获得的一种或多种组织和/或体液，包括痰液；尿液；血液；血浆；血清；滑液；脓；脑脊液；胸膜液；心包液；腹水；汗液；唾液；泪液；阴道分泌物；精液；组织间液；支气管肺泡灌洗液；支气管冲洗液；胃灌洗液；胃冲洗液；经气管或支气管细针抽吸液；骨髓；胸膜组织；来自淋巴结、纵隔镜检查、胸腔镜检查或经支气管活检的组织中的一种或多种；或它们的组合；或从疑似有或确诊有tb的受试者获得的一种或多种组织和/或体液的培养标本。通常，样品包括来自结核分枝杆菌复合群中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的细胞和/或dna。在一些实施方式中，所述样品是来自疑似或确诊有tb的受试者的痰液样品。

35、在一些实施方式中，样品经历机械破碎以破坏样品中的细胞并且实现细胞裂解。任何合适的方法都可以使用，例如珠磨破碎(bead beating)。

36、从样品中分离和提取dna的步骤可通过任何合适的方法进行，包括使用给定或标准方法来使用合适的试剂盒。例如，来自promega as1660的具有使用说明书的maxwell rsc纯食品病原体试剂盒(maxwell rsc purefood pathogen kit)。在一些实施方式中，可以使用来自promega as1660的maxwell rsc纯食品病原体试剂盒。在一些这种实施方式中，根据试剂盒说明书进行了以下调整：试剂盒教导使用800μl样品；在一些实施方式中，使用400μl珠磨破碎后的样品。试剂盒教导加入200μl裂解缓冲液a并且在56℃下伴随震荡孵育4min；在一些实施方式中，加入200μl裂解缓冲液a和40μl蛋白酶k，在65℃下孵育10min。试剂盒教导加入300μl裂解缓冲液，然后将样品放置在自动操作装置中；在一些实施方式中，加入300μl裂解缓冲液和400μl的pbs，然后将样品放置在自动操作装置中。

37、在根据第三和第四方面的实施方式中，其中多于一组的引物集用于扩增步骤，每组都可以作为单独的多重组模板运行。

38、标记的核苷酸或标记的引物可用于dna扩增，例如用于质量控制。例如，可以加入荧光dna结合染料，从而能够进行dna定量。可以使用任何合适的染料或具有染料的探针，例如具有荧光染料的探针，例如使用诸如roche480sybr green i master的sybrgreen试验。

39、在其中多于一组的引物集用于扩增步骤并且每组都可以作为单独的多重组模板运行的实施方式中，一种或多种多重组模板可以合并以制作用于dna定量和/或测序的单个模板。

40、然后样品可经历条形码连接(barcode ligation)和适配子连接(adaptorligation)以创造用于测序的库。当每个样品需要的数据的量小于可以产生的数据总量时，可以使用条形码：这能够合并多个样品并且将它们一起测序。可以使用任何合适的方法，包括使用给定或标准方案来使用条形码试剂盒。例如，牛津纳米孔科技(oxford nanoporetechnologies)提供具有无扩增条形码扩展试剂盒96(exp-nbd196和sqk-lsk109)的扩增子条形码，其包括使用说明书。在一些实施方式中，可以按照所提供的使用说明书使用具有无扩增条形码扩展试剂盒96(exp-nbd196和sqk-lsk109)的牛津纳米孔科技扩增子条形码。

41、dna测序步骤可以通过任何合适的方法进行。在优选实施方式中，dna测序是tngs或第三代测序(也被称为长读测序)。第三代测序可以使用牛津纳米孔科技的minion或pacbio的单分子实时测序平台(smrt)来进行。牛津纳米孔的测序技术是基于检测dna片段移动经过纳米孔时通过纳米孔的电流变化。电流随着碱基g、a、t和c以不同组合经过该孔产生可测量的变化。smrt是基于零模波导的特性。每个核苷酸以荧光发射的形式发出的信号通过被绑定在zl孔底部的dna聚合酶合并。在优选实施方式中，所述测序是长读纳米孔测序。

42、检测一种或多种突变的步骤可以通过任何合适的方法进行，例如合适的生物信息学工具和程序。在一些实施方式中，牛津纳米孔科技的tb工作流可在带有fastq tbresistance profile v2020.03.11的桌面软件epi2me中使用。

43、第一方面的寡核苷酸引物集、第二方面的pcr反应混合物和/或第三方面的方法可用于识别来自特定受试者的tb细菌的基因中耐药性突变的存在和身份。这些信息为关于药物管理的决策提供依据并且能够基于识别的突变为患者确定量身定制的治疗方案。

44、同样地，第五方面，提供一种用于为结核病患者确定合适的抗生素治疗方案的方法，所述方法包括根据第三方面检测和/或识别在来自患者的样品中一种或多种突变的存在，所述一种或多种突变赋予抗生素耐药性，以及基于检测/识别的突变确定合适的抗生素方案。本公开还提供一种为结核病患者安排一定数量的治疗途径中的一种，所述方法包括使用根据第三方面的方法检测和/或识别在来自患者的样品中一种或多种突变的存在，所述一种或多种突变赋予抗生素耐药性，以及基于检测/识别的突变为患者安排治疗方案。

45、第六方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包括根据第一方面的一种或多种寡核苷酸引物集或寡核苷酸引物集的组。所述试剂盒可用于执行根据第三方面的步骤(a)、(b)或(c)中的一种或多种的方法。所述试剂盒还可包括执行根据第三方面的步骤(a)、(b)或(c)中的一种或多种的方法所需的成分和试剂，包括缓冲液、dna聚合酶和核苷酸。在一些实施方式中，所述试剂盒还包括扩增引物中基因区域所需的试剂。所述试剂盒还可包括用于收集样品的样品收集容器。可根据第三方面的方法立即处理样品，或者可将它们在低温下储存，例如在进行该方法之前储存在冰箱或冰柜中。在进行该方法之前，可处理样品。例如，可进行沉降试验，和/或加入防腐剂和/或稀释剂。因此，样品收集容器可含有合适的处理溶液，例如缓冲液、防腐剂和稀释剂。

46、根据本公开的基因靶标和它们对应的引物对示于表1。

47、表1

48、

49、