具有多个用于基因插入的Dock的细胞系的制作方法

本发明涉及含有多个用于核酸构建体并且特别地表达外源目的基因的核酸构建体插入的dock位点的宿主细胞系。

背景技术：

1、治疗性蛋白质药物是为最需要新型疗法的患者提供服务的一类重要药物。已开发出近期获得批准的重组蛋白治疗剂来治疗多种临床适应症，包括癌症、自身免疫性/炎症、暴露于传染物和遗传病症。蛋白质工程技术的最新进展使药物开发人员和制造商可以微调和利用目的蛋白的理想功能特性，同时保持(在某些情况下提高)产品安全性或功效或两者。

2、治疗性蛋白质的制造和生产是高度复杂的过程。例如，典型的蛋白质药物可能包括超过5000个关键工艺步骤，是制造小分子药物所需步骤数量的许多倍。

3、类似地，包括单克隆抗体以及大的蛋白质或融合蛋白在内的蛋白质治疗剂的大小可以比分子量超过100kda的小分子药物大几个数量级。另外，蛋白质治疗剂表现出必须维持的复杂的二级和三级结构。蛋白质治疗剂不能完全通过化学工艺来合成，并且必须在活细胞或生物体中制造；因此，细胞系、物种来源和培养条件的选择都会影响最终产品的特性。而且，大多数的生物活性蛋白需要翻译后修饰，当使用异源表达系统时，这些修饰可能会受到损害。另外，由于产品是由细胞或生物体合成的，因此涉及复杂的纯化过程。此外，还实施病毒清除过程，诸如通过使用过滤器或树脂去除病毒颗粒，以及通过使用低ph值或清洁剂的灭活步骤，以防止蛋白质药物物质病毒污染的严重安全性问题。考虑到治疗性蛋白质在其大分子尺寸、翻译后修饰以及制造过程中涉及的多种生物材料方面的复杂性，增强特定功能属性同时保持通过蛋白质工程策略实现的产品安全性和功效的能力是非常合乎需要的。

4、尽管整合新颖策略和方法来修饰蛋白质药物产品并非易事，但是潜在的治疗优势已推动在药物开发过程中增加这类策略的使用。当前正在使用多种蛋白质工程平台技术来增加新的治疗性蛋白质药物的循环半衰期、靶向性和功能性，以及提高产量和产品纯度。例如，蛋白质缀合和衍生化方法，包括fc融合、白蛋白融合和peg化，目前正用于延长药物的循环半衰期。

5、蛋白质药物(生物制剂)的生产昂贵且耗时。在本领域中需要更有效的工具和方法来生产这类重要药物。

技术实现思路

1、本发明涉及含有多个用于核酸构建体并且特别地表达外源目的基因的核酸构建体插入的dock位点的宿主细胞系。

2、在一些优选的实施方式中，本发明提供了包括基因组的宿主细胞(或宿主细胞群)，该基因组包括1至1000个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，基因组包括1至500个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，基因组包括5至500个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，基因组包括5至250个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，基因组包括5至100个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，基因组包括5至50个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，整合的对接位点独立地定位在整个基因组中。

3、在一些优选的实施方式中，dock位点插入元件被选自由整合酶、重组酶、核酸酶和切口酶组成的组的酶靶向。在一些优选的实施方式中，dock位点插入元件选自由重组酶dock位点插入元件和hdr dock位点插入元件组成的组。在一些优选的实施方式中，dock位点插入元件是重组酶dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，重组酶dock位点插入元件包括附着位点(att)。在一些优选的实施方式中，附着位点(att)选自由attb和attp组成的组。在一些优选的实施方式中，附着位点(att)选自由attr和attl组成的组。在一些优选的实施方式中，重组酶dock位点插入元件包括loxp序列。在一些优选的实施方式中，重组酶dock位点插入元件是flp重组靶点(frt)位点。在一些优选的实施方式中，dock位点插入元件是hdr dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，hdr dock位点插入元件包括一个或两个dock位点同源臂。在一些优选的实施方式中，hdr dock位点插入元件还包括一个或多个与指导rna序列同源的序列。在一些优选的实施方式中，dock位点同源臂的长度为约30至1000个碱基。在一些优选的实施方式中，整合酶dock位点插入元件包括aavs1安全港基因座(safe harbor locus)序列。

4、在一些优选的实施方式中，每个对接位点侧翼为外源整合载体序列。在一些优选的实施方式中，外源整合载体序列选自由病毒载体序列和转座子载体序列组成的组。在一些优选的实施方式中，每个对接位点还包括可操作地连接至启动子的编码选择标记的序列。

5、在一些优选的实施方式中，宿主细胞系进一步包括可操作地连接至启动子的编码酶的外源序列。在一些优选的实施方式中，可操作地连接至启动子的编码酶的外源序列被插入到宿主细胞的基因组中。在一些优选的实施方式中，在dock位点处插入可操作地连接至启动子的编码酶的外源序列。在一些优选的实施方式中，在游离型表达载体中提供可操作地连接至启动子的编码酶的外源序列。在一些优选的实施方式中，游离型表达载体是质粒。在一些优选的实施方式中，所述酶选自由整合酶、重组酶、核酸酶和切口酶组成的组。在一些优选的实施方式中，核酸酶是cas核酸酶。在一些优选的实施方式中，切口酶是cas切口酶。

6、在一些优选的实施方式中，将dock位点插入元件定位成促进盒式交换。在一些优选的实施方式中，每个对接位点包括两个dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，将两个dock位点插入元件定位成促进盒式交换。在一些优选的实施方式中，两个dock位点插入元件位于编码选择标记、酶或其组合的序列的侧翼。

7、在一些优选的实施方式中，宿主细胞进一步包括在1个或多个对接位点处插入的核酸表达构建体。在一些优选的实施方式中，核酸表达构建体包括可操作地连接至编码目的蛋白的序列的第二(即内部)启动子。在一些优选的实施方式中，核酸表达构建体进一步包括可操作地连接的5'启动子(或第一启动子)和5'至选择标记。

8、在一些优选的实施方式中，核酸表达构建体还包括以下的以5'至3'顺序可操作的联接的元件：第一(或5')启动子序列；选择标记序列；第二(或内部)启动子序列；可操作地连接至内部启动子的编码第一目的蛋白的核酸序列；以及多聚a(poly a)信号序列。在一些优选的实施方式中，核酸构建体进一步包括至少一个插入元件，所述插入元件在选自由以下组成的组的一个或多个位置处：5'至第一启动子、3'至多聚a信号序列、在第一启动子和多聚a信号序列之间、在选择标记和第二启动子序列之间，以及5'至第一启动子和3'至多聚a信号序列两者。在一些优选的实施方式中，核酸表达构建体不包括在选择标记和第二启动子之间的多聚a信号序列。在一些优选的实施方式中，选择标记邻近第二启动子。在一些优选的实施方式中，第二启动子邻近编码第一目的蛋白的核酸序列。在一些优选的实施方式中，核酸构建体包括在第一启动子和选择标记之间的非编码区。在一些优选的实施方式中，非编码区包括多个潜在的kozak序列和/或atg翻译起始位点。在一些优选的实施方式中，核酸构建体包括在第一启动子和选择标记之间的延伸包装区(epr)。在一些优选的实施方式中，epr包括多个潜在的kozak序列和/或atg翻译起始位点。

9、在一些优选的实施方式中，第一启动子序列(即5'启动子序列)选自由以下组成的组：sin-ltr、sv40、ef1α、大肠杆菌lac、大肠杆菌trp、噬菌体λpl、噬菌体λpr、t3、t7、巨细胞病毒(cmv)即刻早期、单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶、α-乳清蛋白和小鼠金属硫蛋白-i启动子序列。在一些优选的实施方式中，第一启动子序列是弱启动子序列。在一些优选的实施方式中，第一启动子序列不是逆转录病毒ltr启动子。

10、在一些优选的实施方式中，整合的对接位点进一步包括整合的外源性启动子。在一些优选的实施方式中，启动子是弱启动子。在一些优选的实施方式中，整合的外源性启动子选自由以下组成的组：sin-ltr、sv40、ef1α、大肠杆菌lac、大肠杆菌trp、噬菌体λpl、噬菌体λpr、t3、t7、巨细胞病毒(cmv)即刻早期、单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶、α-乳清蛋白和小鼠金属硫蛋白-i启动子序列。在一些实施方式中，整合的启动子是逆转录病毒ltr。在一些优选的实施方式中，逆转录病毒ltr是sin ltr。在一些优选的实施方式中，每个对接位点包括对接位点的sin ltr epr 5'和对接位点的sin ltr 3'。在一些优选的实施方式中，宿主细胞进一步包括在具有整合的启动子的1个或多个对接位点处插入的核酸表达构建体。

11、在一些优选的实施方式中，用于在对接位点中具有整合的外源启动子的细胞系中的核酸表达构建体包括可操作地连接至编码目的蛋白的序列的内部(或第二)启动子序列。在一些优选的实施方式中，核酸表达构建体包括以下的5'至3'顺序的可操作的联接的元件：选择标记序列；内部启动子序列；可操作地连接至内部启动子的编码第一目的蛋白的核酸序列；以及多聚a信号序列。在一些优选的实施方式中，核酸构建体还包括至少一个插入元件，其在选自由以下组成的组的一个或多个位置处：5'至选择标记序列、3'至多聚a信号序列、在选择标记序列和多聚a信号序列之间、在选择标记和内部启动子序列之间、以及5'至选择标记序列和3'至多聚a信号序列两者。在一些优选的实施方式中，核酸表达构建体不包括在选择标记和第二启动子之间的多聚a信号序列。在一些优选的实施方式中，选择标记邻近内部启动子序列。在一些优选的实施方式中，内部启动子序列邻近编码第一目的蛋白的核酸序列。在一些优选的实施方式中，内部启动子序列选自由以下组成的组：sv40、大肠杆菌lac、大肠杆菌trp、噬菌体λpl、噬菌体λpr、t3、t7、巨细胞病毒(cmv)即刻早期、单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶、α-乳清蛋白和小鼠金属硫蛋白-i启动子序列。

12、在一些优选的实施方式中，任何前述表达构建体中的选择标记序列是选自由谷氨酰胺合成酶(gs)序列和二氢叶酸还原酶(dhfr)序列组成的组的可扩增的选择标记序列。在一些优选的实施方式中，选择标记序列是选自由新霉素抗性基因(neo)、潮霉素b磷酸转移酶基因和嘌呤霉素n-乙酰转移酶基因序列组成的组的抗生素抗性标记序列。

13、在一些优选的实施方式中，任何前述表达构建体中的第二启动子序列选自由以下组成的组：sv40、大肠杆菌lac、大肠杆菌trp、噬菌体λpl、噬菌体λpr、t3、t7、巨细胞病毒(cmv)即刻早期、单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶、α-乳清蛋白和小鼠金属硫蛋白-i启动子序列。

14、在一些优选的实施方式中，编码目的蛋白的核酸序列编码选自由重链和轻链免疫球蛋白序列组成的组的蛋白质。

15、在一些优选的实施方式中，任何前述表达构建体中的插入元件选自由重组酶插入元件和hdr插入元件组成的组。在一些优选的实施方式中，表达构建体插入元件是与重组酶dock位点插入元件相容的重组酶表达构建体插入元件。在一些优选的实施方式中，重组酶表达构建体的插入元件是附着位点(att)。在一些优选的实施方式中，附着位点(att)选自由attp和attb组成的组。在一些优选的实施方式中，重组酶表达构建体插入元件是flp重组靶(frt)位点。在一些优选的实施方式中，重组酶表达构建体插入元件是loxp序列。在一些优选的实施方式中，表达构建体插入元件是与hdr dock位点插入元件相容的hdr表达构建体插入元件。在一些优选的实施方式中，hdr表达构建体插入元件包括与一个或两个dock位点同源臂相容或同源的一个或两个表达构建体同源臂。在一些优选的实施方式中，同源臂的长度为约30至1000个碱基。在一些优选的实施方式中，重组酶表达构建体包括定位在5'至第一启动子和3'至多聚a信号序列的两个同源臂。在一些优选的实施方式中，hdr表达构建体插入元件包括aavs1安全港基因座序列。在一些优选的实施方式中，

16、在一些优选的实施方式中，在任何前述实施方式中的核酸表达构建体进一步包括第一rna输出元件。在一些优选的实施方式中，第一rna输出元件位于3'或5'至编码目的蛋白的核酸序列。在一些优选的实施方式中，第一rna输出元件是前mrna加工增强子(ppe)。在一些优选的实施方式中，第一rna输出元件是转录后调节元件(pre)。在一些优选的实施方式中，pre rna输出元件是土拨鼠(woodchuck)肝炎病毒转录后调节元件(wpre)。

17、在一些优选的实施方式中，在前述实施方式中描述的核酸表达构建体还包括编码至少第二目的蛋白(例如，包括第三、第四、第五等目的蛋白)的核酸序列。在一些优选的实施方式中，编码第二目的蛋白的核酸序列与选自由第三启动子、内含子、第二rna输出元件和ires序列及其组合组成的组的构建体元件可操作地联接。在一些优选的实施方式中，第二rna输出元件是前mrna加工增强子(ppe)。在一些优选的实施方式中，合适的第三启动子包括但不限于sv40、ef1α、大肠杆菌lac、大肠杆菌trp、噬菌体λpl、噬菌体λpr、t3、t7、巨细胞病毒(cmv)即刻早期、单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶、α-乳清蛋白和小鼠金属硫蛋白-i启动子序列。在一些优选的实施方式中，第二rna输出元件是转录后调节元件(pre)。在一些优选的实施方式中，pre rna输出元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre)。在一些优选的实施方式中，编码第二目的蛋白的第二核酸序列定位在3'至编码第一目的蛋白的核酸序列。在一些优选的实施方式中，编码第二目的蛋白的第二核酸序列与选自由口蹄疫病毒(fdv)、脑心肌炎病毒和脊髓灰质炎病毒ires序列组成的组的ires序列可操作地联接。

18、在一些优选的实施方式中，任何前述实施方式的核酸表达构建体进一步包括可操作地连接至第一目的蛋白的信号肽序列。在一些优选的实施方式中，信号肽序列选自由以下组成的组：组织纤溶酶原激活物、人生长激素、乳铁蛋白、α-酪蛋白和α-乳清蛋白信号肽序列。在一些优选的实施方式中，所述核酸表达构建体进一步包括蛋白质纯化标记序列。在一些优选的实施方式中，蛋白质纯化标记序列是六组氨酸标签或血凝素(ha)标签。

19、在一些优选的实施方式中，核酸构建体编码病毒载体(即，代替目的蛋白)。在一些优选的实施方式中，病毒载体选自由逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺病毒相关病毒载体组成的组。在一些优选的实施方式中，逆转录病毒载体是慢病毒载体。

20、在一些优选的实施方式中，宿主细胞选自由以下组成的组：中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hek 293细胞、cap细胞、牛乳腺上皮细胞、由sv40转化的猴肾cv1系、幼仓鼠肾细胞、小鼠支持细胞、猴肾细胞、非洲绿猴肾细胞、人宫颈癌细胞、犬肾细胞、布法罗大鼠(buffalorat)肝细胞、人肺细胞、人肝细胞、小鼠乳腺肿瘤、tri细胞、mrc 5细胞、fs4细胞、大鼠成纤维细胞、mdbk细胞和人肝癌细胞系细胞。在一些优选的实施方式中，宿主细胞选自由以下组成的组：中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hek 293细胞和cap细胞。在一些优选的实施方式中，宿主细胞系是gs敲除细胞系。在一些优选的实施方式中，宿主细胞系是dhfr敲除细胞系。

21、在一些优选的实施方式中，宿主细胞还包括至少第二核酸构建体，其编码并允许至少第二目的蛋白的表达，并且其中所述第二核酸构建体不包括选择标记。在一些优选的实施方式中，宿主细胞进一步包括至少第二核酸构建体，其编码并允许第二目的蛋白的表达，并且其中所述第二核酸构建体包括与第一核酸构建体中的选择标记不同的选择标记。在一些优选的实施方式中，在第一载体中的第一目的蛋白是免疫球蛋白重链或轻链之一，以及在第二载体中的第二蛋白是免疫球蛋白重链或轻链中的另一种。在一些优选的实施方式中，第一目的蛋白是免疫球蛋白重链，并且第二目的蛋白是免疫球蛋白轻链。在一些优选的实施方式中，在一个或多个dock位点处插入第二核酸构建体。

22、在一些优选的实施方式中，本发明提供了包括如上所述的宿主细胞的细胞培养物。在一些优选的实施方式中，所述细胞培养物是主细胞(master cell)培养物。

23、在一些优选的实施方式中，本发明提供了用于产生目的蛋白的方法，包括在使得目的蛋白被表达的条件下培养如上所述的宿主细胞并且从宿主细胞培养物中纯化目的蛋白。在一些优选的实施方式中，宿主细胞在包括选择标记的抑制剂的培养基中生长。在一些优选的实施方式中，选择标记是gs以及抑制剂是草丁膦或甲硫氨酸亚砜亚胺(msx)。在一些优选的实施方式中，选择标记是dhfr以及抑制剂是氨甲蝶呤。

24、在一些优选的实施方式中，本发明提供了用于生产病毒载体的方法，其包括在病毒载体被表达(或合成)的条件下培养包括用于上述病毒载体的表达构建体的宿主细胞，以及从宿主细胞培养物中纯化病毒载体。

25、在一些实施方式中，本发明提供了一种系统，其包括如上所述的宿主细胞或宿主细胞群以及一个或多个核酸表达构建体，其中所述核酸表达构建体进一步包括以下的5'至3'顺序的可操作的联接的元件：选择标记序列；内部启动子序列；可操作地连接至内部启动子的编码第一目的蛋白的核酸序列；和多聚a信号序列，其中核酸构建体进一步包括至少一个插入元件，并且其中表达构建体插入元件与dock位点插入元件相容，以促进在dock位点插入所述核酸表达构建体。在一些优选的实施方式中，一个或多个核酸表达构建体还包括5'启动子序列5'至选择标记序列。在一些优选的实施方式中，5'启动子是弱启动子。在一些优选的实施方式中，合适的5'启动子包括但不限于sin-ltr、sv40、ef1α、大肠杆菌lac、大肠杆菌trp、噬菌体λpl、噬菌体λpr、t3、t7、巨细胞病毒(cmv)即刻早期、单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶、α-乳清蛋白和小鼠金属硫蛋白-i启动子序列。在一些优选的实施方式中，在载体中提供核酸表达构建体。在一些优选的实施方式中，载体是质粒载体。其他合适的载体包括黏粒、yac和小圆形构建体。

26、在一些优选的实施方式中，该系统还包括编码酶的核酸构建体，该酶促进在dock位点插入核酸表达构建体。在一些优选的实施方式中，所述酶选自由整合酶、重组酶、核酸酶和切口酶组成的组。在一些优选的实施方式中，核酸酶是cas核酸酶。在一些优选的实施方式中，切口酶是cas切口酶。在一些优选的实施方式中，系统进一步包括一个或多个rna指导序列。

27、在一些优选的实施方式中，在载体中提供编码促进在dock位点处插入核酸表达构建体的酶的核酸构建体。在一些优选的实施方式中，载体是与包括核酸表达构建体的载体不同的载体。在一些优选的实施方式中，所述载体与包括核酸表达构建体的载体相同的载体。

28、在一些优选的实施方式中，系统进一步包括编码不同目的蛋白的至少第二核酸表达构建体。在一些优选的实施方式中，第二核酸表达构建体进一步包括以下的5'至3'顺序的可操作的联接的元件：选择标记序列；内部启动子序列；可操作地连接至内部启动子的编码第一目的蛋白的核酸序列；以及多聚a信号序列，其中核酸构建体进一步包括至少一个插入元件，并且其中所述表达构建体插入元件与dock位点插入元件相容，以促进核酸表达构建体在dock位点的插入。在一些优选的实施方式中，在单独的载体上提供编码不同目的蛋白的至少第二核酸表达构建体。在一些优选的实施方式中，合适的内部启动子包括但不限于sv40、ef1α、大肠杆菌lac、大肠杆菌trp、噬菌体λpl、噬菌体λpr、t3、t7、巨细胞病毒(cmv)即刻早期、单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶、α-乳清蛋白和小鼠金属硫蛋白-i启动子序列。

29、在一些优选的实施方式中，包含在系统中的核酸表达构建体进一步包括编码至少第二目的蛋白(例如，包括第三、第四、第五等目的蛋白)的核酸序列。在一些优选的实施方式中，编码第二目的蛋白的核酸序列与选自由第三启动子、内含子、第二rna输出元件和ires序列及其组合组成的组的构建体元件可操作地联接。在一些优选的实施方式中，合适的第三启动子包括但不限于sv40、ef1α、大肠杆菌lac、大肠杆菌trp、噬菌体λpl、噬菌体λpr、t3、t7、巨细胞病毒(cmv)即刻早期、单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶、α-乳清蛋白和小鼠金属硫蛋白-i启动子序列。在一些优选的实施方式中，第二rna输出元件是前mrna加工增强子(ppe)。在一些优选的实施方式中，编码第二目的蛋白的第二核酸序列定位在3'至编码第一目的蛋白的核酸序列。在一些优选的实施方式中，ires序列选自由口蹄疫病毒(fdv)、脑心肌炎病毒和脊髓灰质炎病毒ires序列组成的组。

30、在一些优选的实施方式中，本发明提供的方法包括：在将核酸表达构建体在dock位点插入的条件下提供如上所述的一种或多种宿主细胞并将编码第一目的蛋白的一种或多种核酸表达构建体引入到一种或多种宿主细胞中，其中核酸表达构建体进一步包括至少以下的5'至3'顺序的可操作的联接的元件：选择标记序列；内部启动子序列；可操作地连接至内部启动子的编码第一个目的蛋白的核酸序列；以及多聚a信号序列，其中核酸构建体进一步包括至少一个插入元件，并且其中表达构建体插入元件与所述dock位点插入元件相容，以促进核酸表达构建体在dock位点的插入。在一些优选的实施方式中，合适的内部启动子包括但不限于sv40、ef1α、大肠杆菌lac、大肠杆菌trp、噬菌体λpl、噬菌体λpr、t3、t7、巨细胞病毒(cmv)即刻早期、单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶、α-乳清蛋白和小鼠金属硫蛋白-i启动子序列。

31、在一些优选的实施方式中，一个或多个核酸表达构建体还包括5'启动子序列5'至选择标记序列。在一些优选的实施方式中，在载体中提供核酸表达构建体。在一些优选的实施方式中，载体是质粒载体。其他合适的载体包括黏粒、yac和小圆形构建体。在一些优选的实施方式中，载体被瞬时地引入到宿主细胞中。在一些优选的实施方式中，5'启动子是弱启动子。在一些优选的实施方式中，合适的5'启动子包括但不限于sin-ltr、sv40、ef1α、大肠杆菌lac、大肠杆菌trp、噬菌体λpl、噬菌体λpr、t3、t7、巨细胞病毒(cmv)即刻早期、单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶、α-乳清蛋白和小鼠金属硫蛋白-i启动子序列。

32、在一些优选的实施方式中，该方法中使用的宿主细胞系包括编码酶的核酸构建体，该酶促进在dock位点处插入核酸表达构建体。在一些优选的实施方式中，所述方法还包括将编码酶的核酸构建体瞬时引入到宿主细胞中，该酶促进在dock位点处插入核酸表达构建体。在一些优选的实施方式中，在载体中提供编码促进在dock位点处插入核酸表达构建体的酶的核酸构建体。在一些优选的实施方式中，载体是质粒载体。在一些优选的实施方式中，编码促进在dock位点处插入核酸表达构建体的酶的核酸构建体与瞬时引入宿主细胞系的编码第一目的蛋白的核酸表达构建体的比率的比率为1:1000至1:10。在一些优选的实施方式中，编码促进在dock位点处插入核酸表达构建体的酶的核酸构建体与瞬时引入宿主细胞系的编码第一目的蛋白的核酸表达构建体的比率的比率为1:100至1:750。在一些优选的实施方式中，编码促进在dock位点处插入核酸表达构建体的酶的核酸构建体与瞬时引入宿主细胞系的编码第一目的蛋白的核酸表达构建体的比率的比率为1:400至1:600。

33、在一些优选的实施方式中，所述酶选自由整合酶、重组酶、核酸酶和切口酶组成的组。在一些优选的实施方式中，核酸酶是cas核酸酶。在一些优选的实施方式中，切口酶是cas切口酶。在一些优选的实施方式中，所述方法还包括向宿主细胞中引入一个或多个rna指导序列。

34、在一些优选的实施方式中，在载体中提供编码促进在dock位点处插入核酸表达构建体的酶的核酸构建体。在一些优选的实施方式中，载体是与包括核酸表达构建体的载体不同的载体。在一些优选的实施方式中，所述载体与包括核酸表达构建体的载体相同的载体。

35、在一些优选的实施方式中，所述方法还包括引入至宿主细胞中编码不同的目的蛋白的至少第二核酸表达构建体。在一些优选的实施方式中，在单独的载体上提供编码不同目的蛋白的至少第二核酸表达构建体。在一些优选的实施方式中，第二核酸表达构建体包括以下的5'至3'顺序的可操作的联接的元件：选择标记序列；内部启动子序列；可操作地连接至内部启动子的编码第一目的蛋白的核酸序列；以及多聚a信号序列，其中核酸构建体进一步包括至少一个插入元件，并且其中所述表达构建体插入元件与dock位点插入元件相容，以促进核酸表达构建体在dock位点的插入。在一些优选的实施方式中，核酸表达构建体进一步包括编码至少第二目的蛋白的核酸序列。在一些优选的实施方式中，合适的内部启动子包括但不限于sv40、ef1α、大肠杆菌lac、大肠杆菌trp、噬菌体λpl、噬菌体λpr、t3、t7、巨细胞病毒(cmv)即刻早期、单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶、α-乳清蛋白和小鼠金属硫蛋白-i启动子序列。

36、在一些优选的实施方式中，编码第二目的蛋白的核酸序列与选自由第三启动子、内含子、第二rna输出元件和ires序列及其组合组成的组的构建体元件可操作地联接。在一些优选的实施方式中，合适的第三启动子包括但不限于sv40、ef1α、大肠杆菌lac、大肠杆菌trp、噬菌体λpl、噬菌体λpr、t3、t7、巨细胞病毒(cmv)即刻早期、单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶、α-乳清蛋白和小鼠金属硫蛋白-i启动子序列。在一些优选的实施方式中，第二rna输出元件是前mrna加工增强子(ppe)。在一些优选的实施方式中，编码第二目的蛋白的第二核酸序列定位在3'至编码第一目的蛋白的核酸序列。在一些优选的实施方式中，ires序列选自由口蹄疫病毒(fdv)、脑心肌炎病毒和脊髓灰质炎病毒ires序列组成的组。

37、在一些优选的实施方式中，本发明提供制备宿主细胞系的方法，包括将多个对接位点插入到所述宿主细胞的基因组中，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，所述插入包括通过选自由病毒载体和转座子载体组成的组的载体的对接位点的插入。在一些优选的实施方式中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些优选的实施方式中，插入1至500个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，插入5至500个整合的对接位点，每个对接位点包括至少一个dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，整合的对接位点被独立地插入到整个基因组中。

38、在一些优选的实施方式中，dock位点插入元件被选自由整合酶、重组酶、核酸酶和切口酶组成的组的酶靶向。在一些优选的实施方式中，dock位点插入元件选自由重组酶dock位点插入元件和hdr dock位点插入元件组成的组。在一些优选的实施方式中，dock位点插入元件是重组酶dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，重组酶dock位点插入元件包括附着位点(att)。在一些优选的实施方式中，附着位点(att)选自由attb和attp组成的组。在一些优选的实施方式中，附着位点(att)选自由attr和attl组成的组。在一些优选的实施方式中，重组酶dock位点插入元件包括loxp序列。在一些优选的实施方式中，重组酶dock位点插入元件是flp重组靶点(frt)位点。在一些优选的实施方式中，dock位点插入元件是hdr dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，hdr dock位点插入元件包括一个或两个dock位点同源臂。在一些优选的实施方式中，hdr dock位点插入元件还包括一个或多个与指导rna序列同源的序列。在一些优选的实施方式中，dock位点同源臂的长度为约30至1000个碱基。在一些优选的实施方式中，整合酶dock位点插入元件包括aavs1安全港基因座序列。

39、在一些优选的实施方式中，在插入后每个对接位点侧翼为外源整合载体序列。在一些优选的实施方式中，外源整合载体序列选自由病毒载体序列和转座子载体序列组成的组。

40、在一些优选的实施方式中，每个对接位点还包括可操作地连接至启动子的编码选择标记的序列。

41、在一些优选的实施方式中，对接位点包括启动子。在一些优选的实施方式中，启动子是弱启动子。在一些优选的实施方式中，包括在对接位点中的合适启动子包括但不限于sin-ltr、sv40、ef1α、大肠杆菌lac、大肠杆菌trp、噬菌体λpl、噬菌体λpr、t3、t7、巨细胞病毒(cmv)即刻早期、单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶、α-乳清蛋白和小鼠金属硫蛋白-i启动子序列。

42、在一些优选的实施方式中，每个对接位点包括两个dock位点插入元件。在一些优选的实施方式中，将两个dock位点插入元件定位成促进盒式交换。在一些优选的实施方式中，两个dock位点插入元件位于编码选择标记、酶或其组合的序列的侧翼。