通过去优化修饰的口蹄疫活减毒毒株及其用途的制作方法

发明领域本发明涉及减毒病毒和病毒性疾病的预防性和治疗性治疗。

背景技术：

1、口蹄疫(fmd)是偶蹄类动物中接触传染性最高的病毒性疾病之一，并且其由小核糖核酸病毒科(picornaviridae)的成员fmd病毒(fmdv)引起。该病毒可感染超过70种家畜和野生动物，包括牛、猪、绵羊、山羊和鹿。fmd被国际动物卫生组织(oie)列为须报告的疾病，并且在爆发通知后施加严格的贸易限制。先前没有fmd的国家中的疾病暴发最初通过扑杀受感染和接触的动物、限制易感动物活动、对受感染场所进行消毒以及偶尔用灭活的全病毒抗原制品接种疫苗来控制。在疾病地方性流行的国家中，对动物进行预防性接种疫苗。尽管对人类健康无害，但fmd爆发带来严重的经历损失。例如，最近2001年英国爆发造成经济损失超过120亿美元，严重影响了受影响地区的总体经济。

2、除了灭活的全抗原疫苗制剂外，近年来也已经成功测试了一种涉及复制缺陷型人腺病毒5(其递送空fmdv衣壳)(ad5-fmd)的重组疫苗，然而迄今为止，该疫苗仅在美国被授予有条件许可，并且其生产成本高。灭活疫苗和ad5-fmd疫苗两者均需要近似7天才能在猪和牛中诱导保护性免疫力，并且免疫力的持续时间比自然感染所赋予的持续时间更短。因此，如果在接种后7天前或接种后近似6个月后暴露于fmdv，则接种疫苗的动物易患疾病。

3、全球口蹄疫研究联盟(gfra)(一个成立于2003年的国际组织)，作为其五个主要目标的一部分，已经设定开发下一代控制措施和策略，包括改进的疫苗和生物疗法。

4、已经报道，通常通过用活减毒疫苗(lav)接种疫苗最好地实现针对病毒感染的快速和持久保护。事实上，使用减毒病毒疫苗，天花和牛瘟病毒已被根除，并且麻疹已从世界的一些部分消除。由于动物中的全部或部分毒力或对实验性改进的减毒fmdv候选物的毒力的逆转，尚未成功开发或实施lav来控制fmdv。先前描述的检查基因工程改造的无前导fmdv毒株(携带非结构病毒蛋白lpro编码区的缺失)的努力显示在猪和牛中的致病性降低。然而，用无前导病毒接种的动物在用某些野生型(wt)病毒攻击时并未被完全保护。更近来，开发了一种高度减毒的标记无前导fmdv(称为“fmdll3b3d”)(uddowla等人，j.virol.(2012)86：11675-11685)，其在活着施用时在自然宿主中没有显示疾病体征。事实上，包括fmdll3b3d骨架中引入的负抗原(3b和3d)标记的额外修饰以及病毒基因组中三个3b拷贝之一的缺失，使得这种突变病毒非常稳定，并进一步限制其在牛或猪中的复制(uddowla等人，同上；eschbaumer等人，pathogens，(2020)9：129)。这种新型疫苗候选物的减毒使得fmd-ll3b3da24 cruzeiro疫苗平台毒株和大量衣壳编码盒在2018年4月被排除出美国选择代理程序法规之外(select agent program.(2020).foot and mouthdisease.www.selectagents.gov/exclusions-usda.htm1#footmouth)并且目前，它已在美国被许可，用于作为化学灭活的安全fmdv标记疫苗(而非lav)进行制造。该疫苗平台编码两个独特的限制性位点，以侧接衣壳编码区，以容纳交换衣壳编码盒。还已经描述了携带在保守蛋白基序saf-a/b、acinus和pias(sap)结构域中引入的lpro突变的其他实验性lav疫苗(de los santos等人，j.virol.，(2009)83：1800-1810)。具体地，fmdva12中该结构域中两个保守氨基酸残基的取代在细胞培养物和猪中生成减毒突变病毒。有趣的是，当将修饰的减毒毒株作为疫苗候选物在猪中进行测试时，动物甚至当早在接种疫苗后两天就受到攻击时也被完全保护。然而，由于只有两个氨基酸残基被取代，对sap突变体的毒力的逆转带来相当大的风险。

5、密码子使用偏倚是所有生物系统特征性的，因为每个氨基酸的同义密码子使用的频率是不相等的。尽管rna病毒中的密码子使用偏倚低，但p1/衣壳区域的去优化已证明是一种有效的减毒脊髓灰质炎病毒的基因工程改造技术，所述脊髓灰质炎病毒与fmdv一样属于小核糖核酸病毒科。独立于“密码子偏倚”概念，一些同义密码子对的使用频率或多于或低于统计预测，导致每个检查物种中都存在特定的“密码子对偏倚”。

技术实现思路

1、以下实施方案及其方面结合组合物和方法进行描述和举例说明，所述组合物和方法意在为示例性和说明性的，而不是限制范围。

2、在一个实施方案中，本公开提供了去优化口蹄疫病毒(fmdv)，其含有取代的基因组区域，其中所述取代的基因组区域是与seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3、seq idno：4、seq id no：5、seq id no：6或seq id no：7具有至少95％同一性的核酸，且分别与seqid no：1、seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：6或seq idno：7编码相同的多肽，或分别与seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：6或seq id no：7编码相同且具有最多达10个氨基酸替换、缺失或添加的多肽。在一些实施方案中，去优化fmdv具有取代的基因组区域，其包含与seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：6或seq id no：7具有至少99％同一性或100％同一性的核酸。在一些实施方案中，去优化fmdv还含有diva标记，诸如3b和3d编码区中的突变。

3、在一个额外实施方案中，本公开进一步提供了去优化的修饰的口蹄疫病毒(fmdv)，其通过用编码相同蛋白序列或编码具有最多达10个氨基酸替换、缺失或添加的蛋白序列的密码子去优化区域或密码子对去优化区域取代p2结构域或p3结构域而构建，其中修饰序列的密码子对偏倚小于亲本fmdv的密码子对偏倚，并减少0.05、0.1或0.2。在具体实施方案中，去优化基因组区域是p2结构域、p3结构域或p2和p3结构域。在具体实施方案中，去优化fmdv是a24-p2-3b3d、a24-p3-3b3d或a24-p2/p3-3b3d。

4、本公开进一步提供了方法实施方案，包括通过向哺乳动物受试者施用本文所述的任何去优化的修饰的病毒来引发对口蹄疫的免疫应答的方法。在一些实施方案中，施用去优化的修饰的病毒通过施用102、103、104或105pfu/哺乳动物受试者的去优化的修饰的病毒来完成。在一些实施方案中，所述受试者是牛科动物或猪科动物。在额外实施方案中，施用去优化的修饰的病毒需要向哺乳动物受试者施用引发剂量和一个或多个加强剂量。在该方法的一些实施方案中，当哺乳动物受试者没有患有口蹄疫时施用引发剂量。在该方法的一些实施方案中，当哺乳动物受试者没有患有口蹄疫时施用一个或多个加强剂量。在该方法的一些实施方案中，当哺乳动物受试者已经暴露于口蹄疫时施用一个或多个加强剂量。在一些实施方案中，由该方法引发的免疫应答是保护性免疫应答。

5、结合附图，本发明的其他特征和优点将从以下详述变得显而易见，所述附图以实例的方式举例说明本发明的实施方案的各种特征。

6、通过引用并入

7、本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请都具体且单独地指明通过引用并入。