CD20结合分子及其用途的制作方法

1.本公开涉及抗cd20单结构域抗体、嵌合抗原受体、工程化免疫效应细胞及其使用方法。本公开进一步涉及用于治疗用途的细胞的激活和扩增，特别涉及基于嵌合抗原受体的t细胞免疫疗法。

背景技术：

0、2.背景技术

1、cd20是在b细胞分化的某些阶段表达的表面抗原。用治疗性单克隆抗体(mab)靶向cd20阳性b细胞一直是治疗血液系统恶性肿瘤如非霍奇金淋巴瘤(nhl)和慢性淋巴细胞白血病(cll)的有效策略。采用利妥昔单抗(rtx)的初步成功促进了更有效的基于cd20的治疗剂的创造和开发。然而，使用常规mab的治疗不足以克服诸如难治性/复发性疾病的问题(shanehbandi等人，current cancer drug targets,17(5):423-444(2007))。

2、嵌合抗原受体t(car-t)细胞疗法是一种新兴且有效的癌症免疫疗法。特别是在血液恶性肿瘤中，car-t细胞已经取得了令人振奋的结果。已经进行了cd20 car-t细胞的早期临床研究，其表明cd20car-t细胞在b细胞nhl中具有令人鼓舞的治疗潜力(brudno和kochenderfer，nature reviews clinical oncology,15:31-46(2018))。然而，car-t细胞的应用明显受到诸如细胞因子释放综合征和结合非肿瘤组织里的靶标而产生的毒性(on-target off-tumor toxicity)的副作用的阻碍(yu等人，molecular cancer 18(1):125(2019))。

3、因此，需要改进的cd20结合分子和工程化的cd20靶向细胞。例如，需要开发稳定且小尺寸的cd20结合分子以用于更有效或高效的car-t疗法。

4、3.
技术实现要素：

5、一方面，本文提供了抗cd20单结构域抗体(sdab)，其包含(i)包含seq id no:1或195的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:2的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:3的氨基酸序列的cdr3；(ii)包含seq id no:4的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:5的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:6的氨基酸序列的cdr3；(iii)包含seq id no:1或195的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:7的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:8的氨基酸序列的cdr3；(iv)包含seq id no:4的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:9的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:10的氨基酸序列的cdr3；(v)包含seq id no:11或196的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:12的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:8的氨基酸序列的cdr3；(vi)包含seq id no:13的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:9的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:10的氨基酸序列的cdr3；(vii)包含seq id no:14或197的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:15的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:16的氨基酸序列的cdr3；(viii)包含seq id no:17的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:18的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:19的氨基酸序列的cdr3；(ix)包含seq id no:20或197的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:21的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:16的氨基酸序列的cdr3；(x)包含seq id no:22的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:23的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:19的氨基酸序列的cdr3；(xi)包含seq id no:24或198的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:25的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:26的氨基酸序列的cdr3；(xii)包含seq id no:27的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:28的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:29的氨基酸序列的cdr3；(xiii)包含seq id no:14或197的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:30的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:16的氨基酸序列的cdr3；(xiv)包含seq id no:17的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:31的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:19的氨基酸序列的cdr3；(xv)包含seq id no:1或195的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:32的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:3的氨基酸序列的cdr3；(xvi)包含seq id no:4的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:33的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:6的氨基酸序列的cdr3；(xvii)包含seq id no:20或197的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:34的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:16的氨基酸序列的cdr3；(xviii)包含seq id no:22的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:35的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:19的氨基酸序列的cdr3；(xix)包含seq id no:20或197的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:36的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:16的氨基酸序列的cdr3；(xx)包含seq id no:20或197的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:37的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:16的氨基酸序列的cdr3；(xxi)包含seq id no:20或197的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:38的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:16的氨基酸序列的cdr3；(xxii)包含seq id no:4的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:33的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:39的氨基酸序列的cdr3；(xxiii)包含seq id no:4的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:33的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:40的氨基酸序列的cdr3；(xxiv)包含seq id no:165或199的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:166的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:167的氨基酸序列的cdr3；(xxv)包含seq id no:168的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:169的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:170的氨基酸序列的cdr3；(xxvi)包含seq id no:171或200的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:172的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:173的氨基酸序列的cdr3；(xxvii)包含seq idno:174的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:175的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:176的氨基酸序列的cdr3；(xxviii)包含seq id no:177或197的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:178的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:179的氨基酸序列的cdr3；或(xxix)包含seq id no:180的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:181的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:182的氨基酸序列的cdr3。

6、另一方面，本文提供了抗cd20单结构域抗体(sdab)，其包含：(i)分别具有如seqid no:41中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(ii)分别具有如seq id no:42中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(iii)分别具有如seq id no:43中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(iv)分别具有如seq id no:44中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(v)分别具有如seq id no:45中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(vi)分别具有如seq id no:46中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(vii)分别具有如seq id no:47中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(viii)分别具有如seq id no:48中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(ix)分别具有如seq id no:49中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(x)分别具有如seq id no:50中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(xi)分别具有如seq id no:51中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(xii)分别具有如seq id no:52中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(xiii)分别具有如seq id no:53中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(xiv)分别具有如seq id no:54中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(xv)分别具有如seq id no:55中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(xvi)分别具有如seq id no:56中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(xvii)分别具有如seq id no:57中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(xviii)分别具有如seq id no:58中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(xix)分别具有如seq id no:59中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(xx)分别具有如seq idno:60中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(xxi)分别具有如seqid no:61中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(xxii)分别具有如seq id no:62中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；或(xxiii)分别具有如seq id no:63中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(xxiv)分别具有如seq id no:183中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；(xxv)分别具有如seq id no:184中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3；或(xxvi)分别具有如seq id no:185中所示的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3。

7、在一些实施方案中，cdr1、cdr2或cdr3根据kabat编号方案、imgt编号方案、abm编号方案、chothia编号方案、contact编号方案或它们的组合来确定。

8、在一些实施方案中，本文提供的抗cd20 sdab进一步包含一个或多个如seq idno:41、seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44、seq id no:45、seq id no:46、seq idno:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:51、seq id no:52、seq idno:53、seq id no:54、seq id no:55、seq id no:56、seq id no:57、seq id no:58、seq idno:59、seq id no:60、seq id no:61、seq id no:62、seq id no:63、seq id no:183、seqid no:184和/或seq id no:185中所示的fr区。

9、在一些实施方案中，本文提供的抗cd20 sdab包含seq id no:41、seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44、seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:51、seq id no:52、seq id no:53、seq idno:54、seq id no:55、seq id no:56、seq id no:57、seq id no:58、seq id no:59、seq idno:60、seq id no:61、seq id no:62、seq id no:63、seq id no:183、seq id no:184或seqid no:185的氨基酸序列。

10、在其它实施方案中，本文提供的抗cd20 sdab包含与seq id no:41、seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44、seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq idno:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:51、seq id no:52、seq id no:53、seq idno:54、seq id no:55、seq id no:56、seq id no:57、seq id no:58、seq id no:59、seq idno:60、seq id no:61、seq id no:62、seq id no:63、seq id no:183、seq id no:184或seqid no:185的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。

11、在一些实施方案中，所述抗cd20 sdab是骆驼科sdab。在一些实施方案中，所述抗cd20 sdab是人源化sdab。在一些实施方案中，所述抗cd20 sdab是vhh结构域。在一些实施方案中，所述抗cd20sdab是人源化vhh结构域。

12、在一些实施方案中，所述抗cd20 sdab与剂基因融合或化学缀合。

13、另一方面，本文提供了嵌合抗原受体(car)，其包含(a)包含本文提供的抗cd20sdab的细胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域进一步包含一个或多个另外的抗原结合结构域。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构进一步包含一个另外的抗原结合结构域。在其它实施方案中，细胞外抗原结合结构域进一步包含两个另外的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的抗原结合结构域与选自由以下组成的组的一种或多种抗原结合：cd20、cd19、cd22、cd33、cd38、bcma、cs1、ror1、gpc3、cd123、il-13r、cd138、c-met、egfrviii、gd-2、ny-eso-1、mage a3和糖脂f77。在一些实施方案中，cd20 car是单特异性的。在一些实施方案中，cd20 car是单价的。在一些实施方案中，cd20 car是多价的。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含至少两种本文提供的抗cd20 sdab。

14、在一些实施方案中，本文提供了包含多肽的多价(如二价和三价)car，所述多肽包含：(a)细胞外抗原结合结构域，其包含两种或更多种与cd20特异性结合的单结构域抗体(sdab)；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含两种与本文提供的cd20特异性结合的单结构域抗体(sdab)。在其它实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含三种与本文提供的cd20特异性结合的单结构域抗体(sdab)。

15、在根据任一种上述car的一些实施方案中，所述跨膜结构域来源于选自由以下组成的组的分子：cd8α、cd4、cd28、cd137、cd80、cd86、cd152和pd1。在一些实施方案中，所述跨膜结构域来源于cd8α。

16、在根据任一种上述car的一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述初级细胞内信号传导结构域来源于cd3ζ。

17、在根据任一种上述car的其它实施方案中，所述细胞内信号传导结构域进一步包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域来源于选自由cd27、cd28、cd137、ox40、cd30、cd40、cd3、lfa-1、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、cd83的配体以及它们的组合组成的组的共刺激分子。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域来源于cd137。

18、在一些实施方案中，本文提供的car进一步包含位于所述细胞外抗原结合结构域的c-末端与所述跨膜结构域的n-末端之间的铰链结构域。在一些实施方案中，所述铰链结构域来源于cd8α。

19、在一些实施方案中，本文提供的car进一步包含位于多肽的n-末端的信号肽。在一些实施方案中，所述信号肽来源于cd8α。

20、在某些实施方案中，本文提供了嵌合抗原受体(car)，其包含(i)选自seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85、seq id no:86、seq idno:87、seq id no:88、seq id no:89、seq id no:90、seq id no:91、seq id no:92、seq idno:93、seq id no:94、seq id no:95、seq id no:96、seq id no:97、seq id no:98、seq idno:99、seq id no:100、seq id no:101、seq id no:102、seq id no:103、seq id no:104、seq id no:105、seq id no:106、seq id no:189、seq id no:190和seq id no:191组成的组的氨基酸序列；或(ii)与seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85、seq id no:86、seq id no:87、seq id no:88、seq id no:89、seq id no:90、seq id no:91、seq id no:92、seq id no:93、seq id no:94、seq id no:95、seq idno:96、seq id no:97、seq id no:98、seq id no:99、seq id no:100、seq id no:101、seqid no:102、seq id no:103、seq id no:104、seq id no:105、seq id no:106、seq id no:189、seq id no:190或seq id no:191的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

21、另一方面，本文提供了包含编码本文提供的抗cd20 sdab的核酸序列的分离的核酸。另一方面，本文提供了包含编码本文提供的抗cd20 sdab的核酸的载体。

22、在又一方面，本文提供一种分离的核酸，其包含编码本文提供的car的核酸序列。另一方面，本文提供包含编码本文提供的car的核酸的载体。

23、在又一方面，本文提供一种工程化免疫效应细胞，其包含本文提供的car、分离的核酸或载体。在一些实施方案中，所述工程化免疫效应细胞是t细胞或b细胞。

24、另一方面，本文提供一种药物组合物，其包含本文提供的抗cd20sdab、工程化免疫效应细胞或载体，和药学上可接受的赋形剂。

25、在又一方面，本文提供治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括对所述受试者施用有效量的本文提供的抗cd20 sdab、工程化免疫效应细胞或药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病或病症是b细胞相关的疾病或病症和/或cd20相关的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在其它实施方案中，所述疾病或病症是b细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述b细胞恶性肿瘤是b细胞白血病或b细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，所述疾病或病症选自由以下组成的组：边缘区淋巴瘤(例如，脾边缘区淋巴瘤)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、套细胞淋巴瘤(mcl)、原发性中枢神经系统(cns)淋巴瘤、原发性纵隔b细胞淋巴瘤(pmbl)、小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、b细胞幼淋巴细胞性白血病(b-pll)、滤泡性淋巴瘤(fl)、伯基特淋巴瘤、原发性眼内淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、急性成淋巴细胞性白血病(all)、毛细胞白血病(hcl)、前体b成淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、高级b细胞淋巴瘤(hgbl)和多发性骨髓瘤(mm)。在其它实施方案中，所述疾病或病症是自身免疫和/或炎性疾病。在一些实施方案中，所述自身免疫和/或炎性疾病与不适当或增高的b细胞数目和/或激活相关。

技术实现思路