具有增强的L-瓜氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌变体，以及用于使用其产生L-瓜氨酸的方法与流程

本发明涉及具有提高的l-瓜氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌突变体菌株，以及使用所述突变体菌株产生l-瓜氨酸的方法。

背景技术：

1、l-瓜氨酸是一种非必需氨基酸，并且已知瓜氨酸具有有用的作用，例如促进氨代谢、通过血管舒张改善血流、降低血压、神经传递、增强免疫力以及清除活性氧物质。这样的瓜氨酸是在精氨酸生物合成期间作为中间产物合成的。微生物中精氨酸的生物合成由l-谷氨酸通过两种不同的途径(线性途径和环状途径)经过八个酶促步骤而进行。在线性途径中，l-精氨酸由l-谷氨酸经过n-乙酰谷氨酸、n-乙酰鸟氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸和精氨琥珀酸而合成。

2、l-瓜氨酸通常是使用微生物(例如细菌或酵母)通过发酵而产生的，并且l-瓜氨酸的产生可使用天然存在的野生型菌株或从野生型菌株修饰以具有提高的瓜氨酸生产力的突变体菌株来进行。最近，为了改善l-瓜氨酸的生产效率，已将遗传重组技术应用于已广泛用于l-氨基酸和其他有用物质的生产的微生物，例如大肠杆菌和棒状杆菌，并且已开发了具有优异l-瓜氨酸生产力的多种重组菌株或突变体菌株、以及使用其产生l-瓜氨酸的方法。根据韩国专利no.10-1102263和10-1053429，已确定了l-瓜氨酸的生产力通过增强或减弱参与l-瓜氨酸生物合成的蛋白质(例如酶和转录因子)的活性或表达而提高。因此，可预期，l-瓜氨酸的产生也可通过调节参与l-瓜氨酸生物合成途径的多种蛋白质的活性或表达来调节。

3、[现有技术文件]

4、[专利文件]

5、韩国专利no.10-1102263

6、韩国专利no.10-1053429

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明的一个目的是提供具有提高的l-瓜氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)突变体菌株。

3、本发明的另一个目的是提供使用所述突变体菌株产生l-瓜氨酸的方法。

4、技术方案

5、本发明人已进行了使用谷氨酸棒状杆菌菌株开发具有提高的l-瓜氨酸生产力的新的突变体菌株的研究，并且作为结果，发现当编码参与l-瓜氨酸生物合成途径的转运蛋白(transporter)或转运蛋白(transport protein)的ncgl2816基因被去除时，l-瓜氨酸的产生提高，从而完成了本发明。

6、本发明的一个方面提供了谷氨酸棒状杆菌突变体菌株，其中由ncgl2816基因表达的蛋白质的活性已减弱或失活，并且其具有提高的l-瓜氨酸生产力。

7、本文中使用的术语“ncgl2816基因”是指编码参与主动转运的多种次级转运蛋白中的推定整合膜转运蛋白的基因，所述转运蛋白克服了在物质移动通过细胞膜期间细胞外与细胞内之间的浓度梯度，并选择性地吸收或释放营养物。

8、根据本发明的一个实施方案，ncgl2816基因可来源于棒状杆菌(corynebacterium)属菌株。特别地，棒状杆菌属菌株可以是谷氨酸棒状杆菌、corynebacterium crudilactis、沙漠棒状杆菌(corynebacterium deserti)、帚石南棒状杆菌(corynebacterium callunae)、corynebacterium suranareeae、corynebacteriumlubricantis、corynebacterium doosanense、有效棒状杆菌(corynebacteriumefficiens)、corynebacterium uterequi、停滞棒状杆菌(corynebacterium stationis)、corynebacterium pacaense、单一棒状杆菌(corynebacterium singulare)、corynebacterium humireducens、海洋棒状杆菌(corynebacterium marinum)、耐盐棒状杆菌(corynebacterium halotolerans)、企鹅棒状杆菌(corynebacterium spheniscorum)、corynebacterium freiburgense、纹状棒状杆菌(corynebacterium striatum)、犬棒状杆菌(corynebacterium canis)、产氨棒状杆菌(corynebacterium ammoniagenes)、牛肾盂炎棒状杆菌(corynebacterium renale)、corynebacterium pollutisoli、汉氏棒状杆菌(corynebacterium imitans)、黑海棒状杆菌(corynebacterium caspium)、龟口腔棒状杆菌(corynebacterium testudinoris)、corynebacaterium pseudopelargi或微黄棒状杆菌(corynebacterium flavescens)，但不限于此。

9、根据本发明的一个实施方案，ncgl2816基因可由seq id no:1的核苷酸序列组成。根据本发明的另一个实施方案，ncgl2816基因可编码seq id no:2的氨基酸序列。

10、根据本发明的一个实施方案，由ncgl2816基因表达的蛋白质是参与l-瓜氨酸生物合成途径的转运蛋白，并且该转运蛋白对l-瓜氨酸的产生的作用尚未知或未研究。然而，本发明人已发现，当编码转运蛋白的ncgl2816基因缺失时，膜稳定性可改善、l-瓜氨酸的释放可提高、在l-瓜氨酸的过度产生中另外检测到的中间体6-乙酰鸟氨酸的释放可被抑制，并且因此l-瓜氨酸可以以高产率和高浓度产生。

11、本发明中使用的“减弱的活性”意指目的基因的表达水平与原始表达水平相比已降低。术语“减弱的活性”还包括：其中由于编码基因的核苷酸序列中的一个或更多个核苷酸的替换、插入、缺失或其组合，与亲本微生物中蛋白质的活性相比，蛋白质本身的活性降低的情况；其中由于编码酶的基因的表达或翻译降低，细胞中酶的总体活性低于天然菌株、野生型菌株或修饰之前的菌株中那些的情况；及其组合。

12、本发明中使用的“失活”意指编码蛋白质例如酶、转录因子或转运蛋白的基因与天然菌株、野生型菌株或修饰之前的菌株中的那些相比完全未表达，或者该基因即使表达也没有活性。

13、根据本发明的一个实施方案，通过从谷氨酸棒状杆菌菌株中缺失ncgl2816基因，获得了与野生型谷氨酸棒状杆菌菌株或先前开发以过度产生瓜氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变体菌株相比具有提高的l-瓜氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌突变体菌株。

14、本文中使用的术语“提高的生产力”意指l-瓜氨酸生产力与亲本菌株中的l-瓜氨酸生产力相比有所提高。本文中使用的术语“亲本菌株”是指野生型菌株或待突变的突变体菌株，并且包括待直接突变或待用重组载体等转化的菌株。在本发明中，亲本菌株可以是野生型谷氨酸棒状杆菌菌株或从野生型菌株突变而来的菌株。例如，亲本菌株可以是谷氨酸棒状杆菌突变体菌株，其具有增强的鸟氨酸氨甲酰基转移酶和氨甲酰基磷酸合酶活性以过度产生瓜氨酸(参见韩国专利申请no.10-2019-0151321)。

15、根据本发明的一个实施方案，与亲本菌株相比，具有提高的l-瓜氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌突变体菌株表现出提高的l-瓜氨酸生产力。特别地，由谷氨酸棒状杆菌突变体菌株产生的l-瓜氨酸的量可比由亲本菌株产生的l-瓜氨酸的量高至少0.5％，特别地高0.5％至5％，而作为副产物产生的6-乙酰鸟氨酸的量可比由亲本菌株产生的6-乙酰鸟氨酸的量低至少20％，特别地低20％至50％。

16、根据本发明一个实施方案的谷氨酸棒状杆菌突变体菌株可通过缺失亲本菌株中ncgl2816基因的重组载体获得。

17、本文中使用的术语“载体”是指用于将核酸克隆和/或转移到宿主细胞中的任何载剂。载体可以是可连接另外的dna片段以引起所连接片段复制的复制子。术语“复制子”是指作为体内dna复制的自主单元发挥作用，即能够在其自身控制下复制的任何遗传元件(例如，质粒、噬菌体、黏粒、染色体、病毒)。在本发明中，载体没有特别限制，只要其可在宿主中复制即可，并且可使用本领域已知的任何载体。用于构建重组载体的载体可以是天然状态或重组状态的质粒、黏粒、病毒或噬菌体。可使用的噬菌体载体或黏粒载体的一些实例包括但不限于pwe15、m13、λembl3、λembl4、λfixii、λdashii、λzapii、λgt10、λgt11、charon4a和charon21a，并且可使用的质粒载体的一些实例包括但不限于pdz载体，以及基于pbr、基于puc、基于pbluescriptii、基于pgem、基于ptz、基于pcl和基于pet的载体。

18、本文中使用的术语“转化”意指将基因引入到宿主细胞中，使得该基因可在宿主细胞中表达。转化的基因可包括任何基因，不管该基因是插入在宿主细胞的染色体中还是位于染色体之外，只要该基因可在宿主细胞中表达即可。

19、根据本发明的一个实施方案，转化方法包括将核酸引入到细胞中的任何方法，并且可使用本领域已知的根据宿主细胞选择的合适的标准技术来进行。转化方法的一些实例包括但不限于电穿孔、磷酸钙(capo4)沉淀、氯化钙(cacl2)沉淀、显微注射、聚乙二醇(peg)法、deae-葡聚糖法、阳离子脂质体法和乙酸锂-dmso法。

20、根据本发明的一个实施方案，作为转化方法，可使用电穿孔法(van der rest etal.,appl.microbiol.biotechnol.,52,541-545,1999)。

21、宿主细胞包括在体内或体外用本发明的重组载体或多核苷酸转染、转化或感染的细胞。包含本发明的重组载体的宿主细胞是重组宿主细胞、重组细胞或重组微生物。

22、另外，根据本发明的重组载体可包含选择标志物。选择标志物用于选择用载体转化的转化体(宿主细胞)。由于只有表达选择标志物的细胞才可在用选择标志物处理的培养基中存活，所以可选择经转化的细胞。选择标志物的代表性实例包括但不限于卡那霉素、链霉素、氯霉素等。

23、插入到根据本发明的用于转化的重组载体中的基因可通过同源重组交叉整合至宿主细胞例如微生物(例如棒状杆菌属菌株或大肠杆菌)中。

24、本发明的另一方面提供了用于产生l-瓜氨酸的方法，其包括以下步骤：a)在培养基中培养谷氨酸棒状杆菌突变体菌株；以及b)从所培养的突变体菌株中或从培养所述突变体菌株的培养基中回收l-瓜氨酸。

25、可使用本领域已知的合适培养基和培养条件进行培养，并且本领域任何技术人员可容易地调整和使用培养基和培养条件。特别地，培养基可以是液体培养基，但不限于此。培养方法的一些实例包括但不限于分批培养、连续培养、补料分批培养、或其组合。

26、根据本发明的一个实施方案，培养基应当以适当的方式满足特定菌株的要求，并且可由本领域技术人员进行适当的修改。针对用于棒状杆菌属菌株的培养基，可参考已知文件(manual of methods for general bacteriology,american society forbacteriology,washington d.c.,usa,1981)，但不限于此。

27、根据本发明的一个实施方案，培养基可包含多种碳源、氮源和微量元素组分。可使用的碳源的一些实例包括：糖类和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，例如大豆油、葵花籽油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，例如甘油和乙醇；以及有机酸，例如乙酸。这些物质可单独使用或作为混合物使用，但不限于此。可使用的氮源的一些实例包括蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉、尿素，或者无机化合物例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源也可单独使用或作为混合物使用，但不限于此。可使用的磷源的一些实例包括但不限于磷酸二氢钾或磷酸氢二钾、或者相应的含钠盐。另外，培养基可包含但不限于生长所需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。另外，培养基可包含必需的生长物质，例如氨基酸和维生素。此外，可在培养基中使用合适的前体。可在培养期间将培养基或单独的组分通过合适的方法分批或以连续方式添加至培养基中，但不限于此。

28、根据本发明的一个实施方案，培养基的ph可通过在培养期间以适当方式向微生物培养基中添加化合物例如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸来调节。另外，在培养期间，可使用消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制发泡。另外，为了将培养基保持在有氧条件下，可将氧气或含氧气体(例如，空气)注入培养基中。培养基的温度通常可以是20℃至45℃，例如25℃至40℃。可继续培养直至产生所期望量的可用物质。例如，培养时间可以是10小时至160小时。

29、根据本发明的一个实施方案，在从所培养的突变体菌株中或从培养所述突变体菌株的培养基中回收l-瓜氨酸的步骤中，所产生的l-瓜氨酸可使用本领域中已知的合适方法根据培养方法从培养基中收集或回收。可使用的用于回收l-瓜氨酸的方法的一些实例包括但不限于离心、过滤、萃取、喷洒、干燥、蒸发、沉淀、结晶、电泳、分级溶解(例如，硫酸铵沉淀)、色谱(例如，离子交换、亲和力、疏水性和尺寸排阻)等。

30、根据本发明的一个实施方案，回收l-瓜氨酸的步骤可通过将培养基在低速下离心以去除生物质并通过离子交换色谱分离所获得的上清液来进行。

31、根据本发明的一个实施方案，回收l-瓜氨酸的步骤可包括纯化l-瓜氨酸的过程。

32、有益效果

33、根据本发明的谷氨酸棒状杆菌突变体菌株能够以高产率和高浓度产生l-瓜氨酸，因为其中由ncgl2816基因表达的转运蛋白的活性已减弱或失活。