核酸序列测定方法以及核酸序列测定用试剂盒与流程

本发明涉及一种通过杂交来对样本中包含的具有特定核酸序列的靶标进行测定的核酸序列测定方法以及核酸序列测定用试剂盒。

背景技术：

1、作为测定样本中包含的具有特定核酸序列的靶标的方法，使用dna微阵列(具有特定核酸序列的互补序列的检测探针设置在基板等固相面上)的方法广为人知。该方法是利用添加到dna微阵列中的样本所包含的靶标通过杂交反应被dna微阵列的检测探针捕获的性质来测定靶标的方法。在该方法中，除了靶标是否包含在样本中之外，还可以测定样本中包含的靶标的量。在以下的非专利文献1和专利文献1中，公开了使用dna微阵列来测定靶标的以往的测定方法。

2、现有技术文献

3、非专利文献

4、非专利文献1：平山幸一等，ugt1a1の遺伝子多型を判別するdnaチップキットの開発、東洋鋼鈑vol.38,51-56

5、专利文献

6、专利文献1：日本专利第4482557号公报

技术实现思路

1、发明所要解决的技术问题

2、然而，上述非专利文献1和专利文献1中公开的方法都需要在进行靶标的检测前对dna微阵列进行清洗的工序。如果进行这样的清洗，则存在测定结果的再现性降低的问题。

3、本发明是鉴于上述情况而完成的发明，提供通过简单的工序使得样本中包含的靶标的测定结果的再现性优异的核酸序列测定方法、以及核酸序列测定用试剂盒。

4、解决技术问题的技术手段

5、为了实现上述目的，本发明采用以下构成。

6、[1]一种核酸序列测定方法，其特征在于，所述核酸序列测定方法是通过杂交来对样本中包含的具有特定核酸序列的靶标的核酸序列测定方法，所述核酸序列测定方法包括：

7、(a)向包含所述靶标的样本溶液中添加标记分子a的步骤；

8、(b)在所述样本溶液中，使所述靶标与所述标记分子a进行杂交反应的步骤；

9、(c)向所述样本溶液中添加标记分子b的步骤；

10、(d)向固定有检测探针的基板的固相面供给所述样本溶液的步骤；

11、(e)使所述检测探针与所述靶标、所述标记分子a和所述标记分子b进行杂交反应的步骤；

12、(f)从所述固相面分离出如下物质的步骤：由未与所述检测探针结合的所述靶标与所述标记分子a和所述标记分子b构成的凝集体、以及由所述标记分子a和所述标记分子b构成的凝集体；以及

13、(g)向所述固相面照射激发光，测定来自所述固相面的荧光量的步骤，

14、所述检测探针具有检测部，所述检测部为与所述靶标的核酸序列互补的序列，

15、所述标记分子a具有核酸序列，所述核酸序列是与所述靶标的核酸序列互补的、且与所述检测部的核酸序列不同的核酸序列，

16、所述标记分子b具有与所述标记分子a互补的核酸序列，

17、所述标记分子a和所述标记分子b在至少两处以上结合，

18、所述荧光分子被附加在所述标记分子a和所述标记分子b中的至少一者的规定位置上。

19、[2]根据[1]所述的核酸序列测定方法，其特征在于，

20、所述标记分子a在3'末端附近具有x部，在5'末端附近具有y部，并且具有z部，所述z部是与靶标的核酸序列互补的、且与所述检测部的核酸序列不同的核酸序列，

21、所述标记分子b在3'末端附近具有x部，在5'末端附近具有y部，

22、所述x部的核酸序列与所述x部的核酸序列互补，所述y部的核酸序列与所述y部的核酸序列互补，

23、在所述标记分子a中以两个以上设有所述x部和所述y部中的任一者或两者，或在所述标记分子b中以两个以上设有所述x部和所述y部中的任一者或两者，或者，在所述标记分子a中以两个以上设有所述x部和所述y部中的任一者或两者，并在所述标记分子b中以两个以上设有所述x部和所述y部中的任一者或两者。

24、[3]根据[2]所述的核酸序列测定方法，其特征在于，在所述标记分子a中设有两个以上的所述y部。

25、[4]根据[2]或[3]所述的核酸序列测定方法，其特征在于，在所述标记分子b中设有两个以上的所述y部。

26、[5]根据[1]-[4]中任一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，附加有所述荧光分子的所述规定位置是所述标记分子a或所述标记分子b的中途。

27、[6]根据[1]-[5]中任一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，所述荧光分子被附加在所述标记分子a和所述标记分子b的两者上。

28、[7]根据[1]-[5]中任一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，金属微粒被附加在所述标记分子a和所述标记分子b中的任一者的规定位置上。

29、[8]根据[7]所述的核酸序列测定方法，其特征在于，附加有所述金属微粒的所述规定位置是所述标记分子a或所述标记分子b的中途。

30、[9]根据[1]-[8]中任一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，所述分离为离心分离。

31、[10]根据[1]-[9]中任一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，根据所述检测探针与所述靶标、所述标记分子a和所述标记分子b的杂交反应前后的荧光量的变化，计算出杂交后的所述靶标的分子数。

32、[11]一种核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，

33、所述试剂盒是通过杂交来对样本中包含的具有特定核酸序列的靶标进行测定的核酸序列测定用试剂盒，所述核酸序列测定用试剂盒中包含：

34、具有检测部的检测探针，所述检测部具有与所述靶标的核酸序列互补的核酸序列；

35、具有固定所述检测探针的固相面的基板；

36、标记分子a，所述标记分子a具有核酸序列，所述核酸序列是与所述靶标的核酸序列互补的、且与所述检测部的核酸序列不同的核酸序列；以及

37、标记分子b，所述标记分子b具有与所述标记分子a的核酸序列互补的核酸序列，

38、所述标记分子a和所述标记分子b在至少两处以上结合，

39、荧光分子被附加在所述标记分子a和所述标记分子b中的至少一者的规定位置上。

40、[12]根据[11]所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，

41、所述标记分子a在3'末端附近具有x部，在5'末端附近具有y部，并且具有z部，所述z部是与靶标的核酸序列互补的、且与所述检测部的核酸序列不同的核酸序列，

42、所述标记分子b在3'末端附近具有x部，在5'末端附近具有y部，

43、所述x部的核酸序列与所述x部的核酸序列互补，所述y部的核酸序列与所述y部的核酸序列互补，

44、在所述标记分子a中以两个以上设有所述x部和所述y部中的任一者或两者，或在所述标记分子b中以两个以上设有所述x部和所述y部中的任一者或两者，或者，在所述标记分子a中以两个以上设有所述x部和所述y部中的任一者或两者，并在所述标记分子b中以两个以上设有所述x部和所述y部中的任一者或两者。

45、[13]根据[12]所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，在所述标记分子a中设有两个以上的所述y部。

46、[14]根据[12]或[13]所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，在所述标记分子b中设有两个以上的所述y部。

47、[15]根据[11]-[14]中任一项所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，附加有所述荧光分子的所述规定位置是所述标记分子a或所述标记分子b的中途。

48、[16]根据[11]-[15]中任一项所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，所述荧光分子被附加在所述标记分子a和所述标记分子b的两者上。

49、[17]根据[11]-[15]中任一项所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，金属微粒被附加在所述标记分子a和所述标记分子b中的任一者的规定位置。

50、[18]根据[17]所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，附加有所述金属微粒的所述规定位置是所述标记分子a或所述标记分子b的中途。

51、发明效果

52、本发明具有如下效果：提供通过简单的工序使得包含在样本中的测定结果的再现性优异的核酸序列测定方法、以及核酸序列测定用试剂盒。