针对MUC1-C/胞外结构域（MUC1-C/ECD）的抗体的制作方法

1.本公开内容总体上涉及医学、肿瘤学和免疫治疗学领域。更特别地，其涉及用于检测和治疗muc1阳性癌症的免疫试剂的开发。

背景技术：

0、2.背景技术

1、黏蛋白普遍是主要由上皮细胞表达的o-糖基化的蛋白质。分泌的和膜结合的黏蛋白形成物理屏障，该物理屏障保护上皮细胞的顶端边缘免受由毒素、微生物和在与外部环境的接触面处发生的其他形式的应激所诱导的损伤。跨膜黏蛋白1(mucin 1，muc1)也可以通过其胞质结构域向细胞内部发出信号。除了存在海胆精子蛋白-肠激酶-聚集蛋白(enterokinase-agrin，sea)结构域之外，muc1与其他膜结合黏蛋白没有序列相似性(duraisamy et al.,2006)。在这方面，muc1被翻译为单一多肽，并随后在sea结构域处进行自切割(macao et al.,2006)。

2、本发明人和其他人已经广泛研究了muc1在癌症中的作用。如上所述，人muc1是翻译为单一多肽并在内质网中切割成n-和c-端亚基(muc1-n和muc1-c)的异二聚体糖蛋白(ligtenberg et al.,1992；macao et al.,2006；levitin et al.,2005)。如在大多数人癌中存在的muc1的异常过表达(kufe et al.,1984)赋予了锚定非依赖性生长和致瘤性(liet al.,2003a；huang et al.,2003；schroeder et al.,2004；huang et al.,2005)。其他研究已经证明，muc1的过表达赋予对氧化应激和基因毒性抗癌药剂诱导的凋亡的抗性(yinand kufe,2003；ren et al.,2004；raina et al.,2004；yin et al.,2004；raina et al.,2006；yin et al.,2007)。

3、系链和分泌黏蛋白家族在提供上皮细胞表面的保护屏障中发挥作用。随着上皮层的损伤，相邻细胞之间的紧密连接被破坏，并且当细胞启动调蛋白诱导的修复程序时极性丧失(vermeer et al.,2003)。muc1-n从细胞表面脱落(abe and kufe,1989)，留下muc1-c用作环境压力信号的传递者进入细胞内部。在该方面，muc1-c与erbb受体家族的成员形成细胞表面复合物，并且muc1-c在对调蛋白刺激的响应中靶向细胞核(li et al.,2001；liet al.,2003c)。muc1-c还通过muc1胞质结构域(cytoplasmic domain，cd)和连环蛋白家族成员之间的直接相互作用在整合erbb受体和wnt信号传导通路中发挥作用(huang et al.,2005；li et al.,2003c；yamamoto et al.,1997；li et al.,1998；li et al.,2001；liand kufe,2001)。其他研究已表明，muc1-cd被糖原合酶激酶3β、c-src、蛋白激酶cδ和c-abl磷酸化(raina et al.,2006；li et al.,1998；li et al.,2001；ren et al.,2002)。抑制任何前述相互作用代表了muc1相关癌症的潜在治疗性干预点。

技术实现思路

1、因此，根据本公开内容，提供了与由seq id no:1限定的muc1-c胞外结构域(muc1-c/ecd)选择性地结合的抗体或片段，其中所述抗体分别包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含seq id no:3、4和5或者6、7和8的cdr1、cdr2和cdr3区，并且所述可变轻链包含含有seq id no:9、10和11或者12、13和14的cdr1、cdr2和cdr3区。该抗体或其片段可分别包含与seq id no:15、17或19具有80％或更高同源性的可变重链，以及与seq id no:16、18或20/25/26具有80％或更高同源性的可变轻链，或者可分别包含由与seq id no:21、23或27具有70％或更高同源性的核酸编码的可变重链，以及由与seq id no:22、24或28/29/30具有70％或更高同源性的核酸编码的可变轻链。

2、抗体可以是单链抗体、单结构域抗体、双特异性抗体或嵌合抗体。抗体片段可以是fab片段。抗体或其片段可以是对muc1-c/ecd和独特的癌细胞表面抗原具有特异性的重组抗体或其片段。抗体可以是鼠抗体、igg、人源化抗体或人源化igg抗体。抗体或其片段还可包含标记。该标记可以是肽标签、酶、磁性颗粒、发色团、荧光分子、化学发光分子或染料。抗体或其片段还可包含与其连接的抗肿瘤药物，例如其中抗肿瘤药物通过光不稳定的接头与所述抗体或其片段连接，或者所述抗肿瘤药物通过酶促切割接头与所述抗体或其片段连接。抗肿瘤药物可以是毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。

3、重链和轻链可分别与seq id no:15、17或19以及seq id no:16、18或20/25/26具有85％、90％、95％或99％的同源性，或者可分别由与seq id no:21、23或27以及seq idno:22、24或28/29/30具有85％、90％、95％或99％同源性的核酸编码。抗体或其片段可以与纳米粒或脂质体缀合。抗体或其片段可诱导细胞死亡，包含抗体依赖性细胞毒性或补体介导的细胞毒性。

4、还提供了治疗癌症的方法，其包括使对象中的muc1阳性癌细胞与这样的抗体或其片段接触：所述抗体或其片段与由seq id no:1限定的muc1-c胞外结构域(muc1-c/ecd)选择性地结合，其中所述抗体分别包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含seq id no:3、4和5或者6、7和8的cdr1、cdr2和cdr3区，并且所述可变轻链包含含有seq id no:9、10和11或者12、13和14的cdr1、cdr2和cdr3区。该抗体或其片段可分别包含与seq id no:15、17或19具有80％或更高同源性的可变重链，以及与seq id no:16、18或20/25/26具有80％或更高同源性的可变轻链，或者可分别包含由与seq id no:21、23或27具有70％或更高同源性的核酸编码的可变重链，以及由与seq id no:22、24或28/29/30具有70％或更高同源性的核酸编码的可变轻链。

5、该抗体可以是单链抗体、单结构域抗体、双特异性抗体或嵌合抗体。该抗体片段可以是fab片段。抗体或其片段可以是对muc1-c/ecd和独特的癌细胞表面抗原具有特异性的重组抗体或其片段。抗体可以是鼠抗体、igg、人源化抗体或人源化igg抗体。抗体或其片段还可包含标记。该标记可以是肽标签、酶、磁性颗粒、发色团、荧光分子、化学发光分子或染料。抗体或其片段还可包含与其连接的抗肿瘤药物，例如其中抗肿瘤药物通过光不稳定的接头与所述抗体或其片段连接，或者所述抗肿瘤药物通过酶促切割接头与所述抗体或其片段连接。抗肿瘤药物可以是毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。

6、重链和轻链可以分别与seq id no:15、17或19以及seq id no:16、18或20/25/26具有85％、90％、95％或99％的同源性，或者可以分别由与seq id no:21、23或27以及seqid no:22、24或28/29/30具有85％、90％、95％或99％同源性的核酸编码。抗体或其片段可以与纳米粒或脂质体缀合。抗体或其片段可诱导细胞死亡，包含抗体依赖性细胞毒性或补体介导的细胞毒性。

7、muc1阳性癌细胞可以是实体瘤细胞，例如肺癌细胞、脑癌细胞、头颈癌细胞、乳腺癌细胞、皮肤癌细胞、肝癌细胞(例如肝细胞癌)、胰腺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、子宫癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞或食管癌细胞。muc1阳性癌细胞可以是白血病或骨髓瘤，例如急性髓性白血病、慢性髓细胞性白血病或多发性骨髓瘤。muc1阳性癌细胞可以是转移性癌细胞、多重药物抗性癌细胞或复发性癌细胞。

8、该方法还可包括使所述muc1阳性癌细胞与第二抗癌药剂或治疗(例如化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗或毒素治疗)接触。第二抗癌药剂或治疗可抑制胞内muc1功能。第二抗癌药剂或治疗可以与所述第一药剂同时给予，或者在所述第一药剂之前和/或之后给予。

9、在另一个实施方案中，提供了治疗涉及人乳头瘤病毒的癌症(例如宫颈癌)或涉及幽门螺杆菌(h.pylori)的癌症(例如胃癌)的方法，该方法包括向对象施用如本文所限定的与由seq id no:1限定的muc1-c胞外结构域(muc1-c/ecd)选择性地结合的抗体或其片段。

10、在另一个实施方案中，提供了治疗炎性病症的方法，其包括向对象施用如本文所限定的与由seq id no:1限定的muc1-c胞外结构域(muc1-c/ecd)选择性地结合的抗体或其片段。这样的炎性病症包括急性和慢性炎性病症，例如结肠炎、ibd和ipf。炎性病症还包括细菌、病毒、真菌和寄生虫感染，例如sars-cov-2、人乳头瘤病毒和幽门螺杆菌。

11、还提供了在对象中诊断muc1阳性癌症的方法，其包括使对象或来自对象的含有细胞的样品与抗体或其片段接触，所述抗体或其片段如本文所限定的与由seq id no:1限定的muc1-c胞外结构域(muc1-c/ecd)选择性地结合。muc1阳性癌症可以是实体瘤癌症，例如肺癌、脑癌、头颈癌、乳腺癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、睾丸癌、皮肤癌或食管癌。muc1阳性癌症可以是白血病或骨髓瘤，例如急性髓性白血病、慢性髓细胞性白血病或多发性骨髓瘤。muc-1阳性癌症可以是肝细胞癌或由人乳头瘤病毒引起的宫颈癌。

12、该方法还可包括向所述对象施用抗癌药剂或治疗，例如化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗或毒素治疗，包括如本文所限定的与由seq id no:1限定的muc1-c胞外结构域(muc1-c/ecd)选择性地结合的抗体或其片段。muc1阳性癌症可以是转移性癌症、多重药物抗性癌症或复发性癌症。含有细胞的样品可以是固体组织样品(例如活检物)或流体样品，例如尿、精液、痰、唾液、乳头抽吸物或血液。

13、另一些实施方案包括(a)药物制剂，其包含如本文所限定的与由seq id no:1限定的muc1-c胞外结构域(muc1-c/ecd)选择性地结合的抗体或其片段，以及可药用载体、缓冲剂或稀释剂。药物制剂可进一步限定为疫苗制剂，任选地还包含佐剂、或免疫组织化学试剂或放射成像剂。该制剂还可包含另外的治疗剂。

14、在另一个实施方案中，提供了融合蛋白，其包含(i)与由seq id no:1限定的muc1-c/胞外结构域(extracellular domain，ecd)选择性地结合的第一单链抗体，其中所述抗体分别包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含seq id no:3、4和5或者6、7和8的cdr1、cdr2和cdr3区，并且所述可变轻链包含含有seq id no:9、10和11或者12、13和14的cdr1、cdr2和cdr3区；以及(ii)与t或b细胞结合的第二单链抗体。第二单链抗体可与cd3、cd16、pd1、pd-l1、cd33、her-2、egfr、ctla-4、ox40、fcγri(cd64)、fcγriiia(cd16a)、fcαri(cd89)、cd163、cd68、cd89 mab结合。融合蛋白还可包含标记或治疗性部分。重链和轻链可分别与seq id no:15、17或19以及seq id no:16、18或20/25/26具有85％、90％、95％或99％的同源性，或者分别由与seq id no:21、23或27以及seq id no:22、24或28/29/30具有85％、90％、95％或99％同源性的核酸编码。

15、在又一个实施方案中，提供了嵌合抗原受体，其包含(i)胞外域，该胞外域包含与由seq id no:1限定的muc1-c/胞外结构域(muc1-c/ecd)选择性地结合的单链抗体可变区，其中所述抗体分别包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含seq id no:3、4和5或者6、7和8的cdr1、cdr2和cdr3区，并且所述可变轻链包含含有seq id no:9、10和11或者12、13和14的cdr1、cdr2和cdr3区，其中在所述单链抗体可变区的c端处附接有柔性铰链；(ii)跨膜结构域；以及(iii)内结构域，其中当所述单链抗体可变区与muc1接合时，所述内结构域包含信号转导功能。跨膜和内结构域可以来源于同一分子。内结构域可包含cd3-ζ结构域或高亲和力fcεri。柔性铰链可以来自cd8α或1g。重链和轻链可分别与seq id no:15、17或19以及seq id no:16、18或20/25/26具有85％、90％、95％或99％的同源性，或者可分别与seqid no:21、23或27以及seq id no:22、24或28/29/30具有85％、90％、95％或99％的同源性。

16、另外，提供了表达如上所述嵌合抗原受体的细胞。跨膜和内结构域可以来源于同一分子。内结构域可包含cd3-ζ结构域或高亲和力fcεri。柔性铰链可以来自cd8α或1g。

17、预期本文所述的任何方法或组合物可以相对于本文所述的任何其他方法或组合物来实施。

18、当在权利要求书和/或说明书中与术语“包含/包括”结合使用时，没有数量词修饰的名词的使用可意指“一个/种”，但是其也符合“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义。“约”一词意指所述数字的正负5％。

19、本公开内容的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。然而，应理解，详细描述和具体实例虽然指示了本公开内容的具体实施方案，但仅通过举例说明的方式给出，因为通过该详细描述，在本公开内容的精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。