N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐，其制备及其用途的制作方法

n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐，其制备及其用途
[0001]
本发明涉及新的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐及其药学上可接受的溶剂合物，其制备，含有其的药物组合物及其在治疗和/或预防神经退行性疾病中的用途。
[0002]
发明背景
[0003]
n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺，其具有式i的结构
[0004][0005]
是此前在wo 2006/051489中公开的，属于1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪衍生物家族，且可用于治疗和/或预防神经退行性疾病的药物活性分子(pam)。
[0006]
该化合物的游离碱形式由于氧化降解而存在长期稳定性问题。因此，申请人寻找克服这些稳定性问题的盐形式，并发现wo2014/102339中所述的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的硫酸盐。该硫酸盐没有氧化降解且作为稳定粉末获得，具有良好结晶度的结晶相；基于通常使用的标准(即在25℃/60％相对湿度(rh)下，吸水率小于2重量％)，它们不吸湿。特别地，申请人发现n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺二硫酸盐在常规储存条件下(15-25℃)至少温度储存5年，且具有大于100mg/ml的显著的水溶性。因此，n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的硫酸盐是合适的活性药物成分(api)。
[0007]
正在开发n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺二硫酸盐api，用于治疗神经退行性疾病，并成功完成健康志愿者的1期临床试验。将该二硫酸盐api以液体制剂：水溶液口服施用于健康志愿者。这些水溶液易于制备且非常稳定(在玻璃小瓶中，在5℃下高达18个月，在25℃/60％ rh下高达18个月，在40℃/75％rh下高达6个月)，无需任何防腐剂。在对患有进行性核上性麻痹(psp)的患者进行的2a期临床试验中使用相同的制剂。
[0008]
申请人希望开发n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺pam的盐形式的固体制剂(例如胶囊)，而游离碱由于其不稳定性问题和较低的溶解度而被排除。实际上，固体制剂相比液体制剂具有许多优点：稳定性、包装、供应、储
存、使用和物流更容易，且更具成本效益。与液体制剂不同，固体制剂的开发(注册合规)要求api是独特的明确定义的多晶型形式。分子的多晶型形式或多晶型物是指具有不同且独特的物理化学性质(如结晶度、熔点、溶解度和稳定性)的分子的不同固态。api及其固体制剂的性质取决于api的多晶型形式；多晶型物可表现出不同的稳定性、溶解度、溶出速率，这可显著影响药物的生物利用度。因此，药物批准和监管机构要求药物的固体制剂是api的独特稳定多晶型物；例如，参考当药物物质以多晶型形式存在时提交简化新药申请(abbreviated new drug applications)的美国食品和药品管理局关于化学、制造和控制(cmc)要求的行业指南(文档编号fda-2004-d-0182)。因此，选择正确的盐的正确多晶型物对于api开发是至关重要的，而采取高度可再现的化学过程用于其合成同样有害。在该情况中，api合成方法的最后一步是盐的形成，其需要优化以直接获得所选的多晶型形式。换言之，在选择与一锅法盐形成-直接结晶的最终步骤相容的盐/多晶型形式时，该方法将更有效和成本效益高。
[0009]
申请人首先研究了n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺二硫酸盐并进行了全面的多晶型筛选，从而鉴定了众多多晶型形式。名为“a型”的多晶型形式，其xrpd衍射图如图1所示，被鉴定为最适合的稳定形式，以用于制备固体制剂。然后，本技术人寻求开发a型的可重复的化学方法合成，即鉴定在该多晶型形式的从游离碱起始原料一锅法形成二硫酸盐/直接结晶的合适条件(溶剂、反溶剂、浓度、持续时间、温度、成核条件、过滤、干燥条件)。尽管进行了广泛的研究，但是申请人不能实现该结果，且只能从2个不同步骤由游离碱获得所需的a型多晶型物：1)从称为“b型”的多晶型物形成二硫酸盐，然后2)将b型转化为目标a型。申请人进一步鉴定了目标a型对干燥条件敏感，因为其在50℃干燥后转化回多晶型b型。这种敏感性将进一步限制工业规模的方法，且申请人换为研究b型，因为该晶型适合于更有效的一锅法盐形成/结晶的最终步骤。
[0010]
b型(其xrpd衍射图在图2中公开)是从多晶型筛选研究中鉴定的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺二硫酸盐中最突出的多晶型形式。然而，在几种不同的溶剂中或在高湿度条件下存在晶型转化的风险，且其可能易于在醇溶剂中盐歧化(形成三硫酸盐)。另外，b型在50℃下长时间干燥后部分丧失其结晶度。因此，申请人忽略了b型作为用于开发固体制剂的合适多晶型形式。
[0011]
n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺二硫酸盐尽管是稳定的结晶非吸湿性粉末api，但在结晶形式稳定性和合成工艺效率方面呈现复杂的多晶型现象。采用一锅法盐形成/直接结晶最后步骤的稳健、成本效益高的合成方法无法保证获得特定的稳定多晶型形式。通过多晶型筛选标准的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的多晶型物在50℃下常规干燥喜爱不稳定，申请人得出以下结论：二硫酸盐不适合于获得n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺pam的固体制剂。
[0012]
wo2014/102339讨论了n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的其他盐。由于草酸根离子可触发肾毒性，最初在wo2006/051489中报道的草酸盐不合适。直接发现盐酸盐非常吸湿，而乙酸盐未以固体形式获得。获得的酒石酸盐和富马酸盐为无定形固体。苹果酸盐被舍弃，因为由于其手性使得临床开发相当复杂，而每种立体异构体需要被等同地表征为活性立体异构体。
[0013]
因此，在本领域中仍然需要n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的新盐的稳定多晶型形式，其特别适用于固体制剂且可由稳定的化学方法获得。
[0014]
发明简述
[0015]
本发明基于出乎意料的发现，即n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐提供了稳定的粉末，该多晶型物具有高结晶度，非常稳定，不吸湿且可以以优秀的产率从游离碱在一锅法成盐/直接结晶获得。琥珀酸盐满足上述要求标准，且尤其适合于用作固体制剂中的api，如胶囊。
[0016]
因此，本发明涉及n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐及其药学上可接受的溶剂合物。
[0017]
n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐及其溶剂合物作为粉末获得，其具有高结晶度和限定形态的结晶相。此外，本发明的琥珀酸盐尤其适用于制备含有其的药物组合物。琥珀酸盐是药学上可接受的且据本技术人所知不与任何种类的任何固有毒性相关。
[0018]
此外，当与其他盐(诸如硫酸盐)相比时，琥珀酸盐具有更简单的多晶型形态，该多晶型形式具有更高的结晶度，在合成过程(特别是常规的50℃干燥)期间更稳定(即，没有改变晶体形式)，且在该方法中使用的溶剂中不会发生歧化(即，化学计量改变)。
[0019]
因此，琥珀酸盐的使用将增强以及便于含有n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺pam的药物组合物的生产，同时降低相关成本。
[0020]
发明详述
[0021]
本发明的化合物是n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐及其药学上可接受的溶剂合物。更特别地，本发明的琥珀酸盐及其溶剂合物是式ii的那些。
[0022][0023]
其中x为1-4，优选地x为1.4-3.1，更优选地x为1.4-1.6，且更优选地x为约1.5，甚至更优选地x为1.5。
[0024]
换言之，1分子的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺，n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐含有1-4当量，优选1.4-3.1当量，更优选1.4-1.6当量，还更优选约1.5当量，
且甚至更优选1.5当量的琥珀酸盐。
[0025]
在一个优选实施方案中，本发明的琥珀酸盐是n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的倍半琥珀酸盐。
[0026]
在一个实施方案中，本发明优选的琥珀酸盐是式ii的化合物，其中x为2.9-3.1，优选其中x为约3，更优选x为3。
[0027]
在另一个优选的实施方案中，本发明的琥珀酸盐是n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的三琥珀酸盐。
[0028]
在一个具体实施方案中，式ii的琥珀酸盐是药学上可接受的溶剂合物，优选水合物。对于1分子的式ii的琥珀酸盐，溶剂合物化学计量为0.4-2，优选0.4-1.2，更优选0.5-1.1，还更优选约0.5或约1.1，甚至更优选0.5或1.1分子的溶剂合物。
[0029]
在一个实施方案中，本发明的化合物是n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐半水合物。
[0030]
在另一个实施方案中，本发明的化合物是n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐一水合物。
[0031]
申请人已鉴定了本发明化合物的几种多晶型形式，其对1)化学降解(诸如盐歧化)和2)多晶型变化，特别稳定。这些多晶型物具有高结晶度，在常规储存和应力条件下稳定，不吸湿。申请人已发现使用从游离碱的一锅法盐形成/结晶最终步骤生物这些多晶型形式的特定制备的实验条件。因此，本发明的化合物可用作用于固体制剂中的api。
[0032]
在一个实施方案中，本发明的一种特别优选的化合物为式ii的化合物，其中x为1.5，当用cukα光源照射时，其晶型的x射线粉末衍射(xrpd)图包含在2θ＝3.8
°±
0.2
°
、10.3
°±
0.2
°
、12.4
°±
0.2
°
、16.2
°±
0.2
°
、17.9
°±
0.2
°
、19.8
°±
0.2
°
、20.4
°±
0.2
°
、23.8
°±
0.2
°
和26.7
°±
0.2
°
的衍射角处的峰。该特定晶型在整个申请中称为“晶型1”，且其xrpd衍射图记录在具有pixcel检测器(128通道)的panalytical x'per tpro上，如图3所示。
[0033]
本发明的另一优选化合物为式ii的化合物，其中x为3，当用cukα光源照射时，其晶型的x射线粉末衍射(xrpd)图包含在2θ＝5.3
°±
0.2
°
、15.0
°±
0.2
°
、15.3
°±
0.2
°
、16.8
°±
0.2
°
、17.9
°±
0.2
°
、20.5
°±
0.2
°
、21.2
°±
0.2
°
、23.9
°±
0.2
°
、24.3
°±
0.2
°
和26.6
°±
0.2
°
的衍射角处的峰。该特定晶型在整个申请中称为“晶型2”，且其xrpd衍射图记录在具有pixcel检测器(128通道)的panalytical x'pert pro上，如图4所示。
[0034]
本发明的另一种优选化合物是式ii的化合物，其中x为1.5，y为0.5，且当用cukα光源照射时，其晶型具有x射线粉末衍射(xrpd)图包含在2θ＝3.8
°±
0.2
°
、4.4
°±
0.2
°
、9.2
°±
0.2
°
、10.6
°±
0.2
°
、13.8
°±
0.2
°
、17.7
°±
0.2
°
、19.9
°±
0.2
°
、21.6
°±
0.2
°
和23.6
°±
0.2
°
的衍射角处的峰。其xrpd衍射图记录在具有pixcel检测器(128通道)的panalytical x'pert pro上，如图5所示。
[0035]
本发明的另一种优选化合物是式ii的化合物，其中x为1.5，y为1.1，且当用cukα光源照射时，其晶型的x射线粉末衍射(xrpd)图包含在2θ＝4.2
±
0.2
°
、4.4
°±
0.2
°
、9.6
°±
0.2
°
、10.6
°±
0.2
°
、15.0
°±
0.2
°
、16.3
°±
0.2
°
、17.4
°±
0.2
°
、19.7
°±
0.2
°
、22.8
°±
0.2
°
、29.1和29.7
°±
0.2
°
的衍射角处的峰。其xrpd衍射图记录在具有pixcel探测器(128通道)的panalytical x'pert pro中，如图6所示。
[0036]
n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半
琥珀酸盐的晶型可以通过化学合成方法获得。该方法是本发明的另一目的。
[0037]
本发明还涉及制备n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐的晶型的方法，其包括以下步骤：
[0038]-步骤1：将n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺溶解在有机溶剂中；
[0039]-步骤2：将该反应介质加热至温度b，其中温度b定义为30℃-50℃的温度；
[0040]-步骤3：加入基本上等摩尔量的琥珀酸；
[0041]-步骤4：在温度b下搅拌反应介质0.25-4小时；
[0042]-步骤5：使反应介质在温度a-温度b之间以2-4小时的循环进行温度循环10-30小时，其中温度a定义为0-10℃的温度；
[0043]-步骤6：将反应介质冷却至温度a；
[0044]-步骤7：在温度a下过滤反应介质；
[0045]-步骤8：在温度a下用所述有机溶剂洗涤滤饼；
[0046]-步骤9：在30-50℃的温度下干燥滤饼。
[0047]
在第一步中，提供n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的溶液。可用于制备溶液的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺原料可以是游离碱的任何物理形式，包括溶剂化形式，纯度≥95％。在一个实施方案中，有机溶剂选自下组：丙酮、97.5％丙酮/2.5％水(％v/v)、甲基乙基酮、乙腈、叔丁基甲基醚。在一个特别优选的实施方案中，所用的有机溶剂是特别适用于制备晶型1的甲基乙基酮。所用有机溶剂的体积对于游离碱的溶解及其盐的成功形成和结晶是至关重要的。在一个优选实施方案中，加入的有机溶剂的量为20-40ml/g游离碱，优选25-35ml/g游离碱，更优选约30ml/g游离碱。
[0048]
在一个优选实施方案中，加热步骤2是在35℃-45℃，更优选地40℃-45℃，还更优选地约40℃的温度，甚至更优选地在40℃的温度b下进行。
[0049]
在温度b下的任选过滤步骤可以在步骤2和随后的加入琥珀酸的步骤3间进行。琥珀酸以相对于n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺游离碱基本上等摩尔的量加入。换言之，相对于游离碱，添加0.95当量(eq.)至1.05当量(eq.)的琥珀酸。在一个优选实施方案中，使用1.0当量的琥珀酸。
[0050]
在步骤3中，通过使用粉末形式的琥珀酸分批或通过缓慢加入浓琥珀酸在有机溶剂中的悬浮液或溶液来加入琥珀酸，所述有机溶剂用于溶解碱。在一个优选实施方案中，琥珀酸以粉末形式加入。在另一个优选实施方案中，琥珀酸作为在有机溶剂中的浓溶液加入。
[0051]
在步骤4中，开始形成盐，同时将反应介质在温度b下搅拌0.5-4小时。在一个优选实施方案中，将介质搅拌20-40分钟，优选约30分钟。在另一个优选实施方案中，将介质搅拌2-4小时，优选约3小时。
[0052]
随后的温度循环步骤5使倍半琥珀酸盐以特定的晶型结晶。温度循环在温度a和温度b之间以2-4小时的循环进行10-30小时，其中温度a定义为0-10℃的温度。在一个特别优选的实施方案中，温度循环在约5℃-约40℃进行约3小时循环，持续约20小时，由此使得倍半琥珀酸盐以晶型1结晶，尤其是当使用甲基乙基酮为有机溶剂时。
[0053]
此时，通常将结晶盐沉淀并将反应介质冷却至0-10℃，优选约5℃的温度(步骤6)，
然后在相同温度下通过过滤回收所需物质(步骤7)。滤饼用与反应(步骤8)所用的相同有机溶剂洗涤一次，在滤饼中回收所需的结晶盐。在一个优选实施方案中，在滤饼洗涤中，每g物质使用约5ml体积的有机溶剂。
[0054]
然后，将过滤和洗涤的材料，优选在减压下，在30-50℃，优选约40℃的温度下干燥(步骤9)。
[0055]
本发明的特别优选的方法能够获得n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐型1，如下：
[0056]-步骤1：将n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺溶解在甲基乙基酮中；
[0057]-步骤2：将反应介质加热至45℃；
[0058]-步骤3：加入等摩尔量的琥珀酸；
[0059]-步骤4：将反应介质在45℃下搅拌3-4小时；
[0060]-步骤5：使反应介质在5℃-40℃，以3小时循环，温度循环20小时；
[0061]-步骤6：将反应介质冷却至5℃；
[0062]-步骤7：在5℃下过滤反应介质；
[0063]-步骤8：在5℃下用所述有机溶剂洗涤滤饼；
[0064]-步骤9：在40℃下减压干燥滤饼。
[0065]
根据本发明的方法使得n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐直接一锅法盐形成/结晶。
[0066]
当通过1)使用乙醇作为有机溶剂和2)在步骤3中将琥珀酸的化学计量改变为约2当量时，根据本发明的方法使得n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺三琥珀酸盐直接一锅法盐形成/结晶。
[0067]
申请人已展示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐及其药学上可接受的溶剂合物可用于矫正tau蛋白的代谢，特别是通过抑制病理性tau蛋白磷酸化。tau蛋白(又称，微管相关蛋白tau-mapt)与微管蛋白相互作用以稳定微管并促进微管蛋白组装成微管，微管稳定性受同种型和磷酸化控制。tau病理包括导致微管相关tau蛋白异常修饰的机制，诸如其超磷酸化、进行性积聚和在退化神经元内积聚成原纤维物质以形成所谓的神经原纤维缠结(nft)。本发明的化合物在保护神经元的神经突触网络和促进神经突生长方面是有效的。神经突是神经元细胞体的突起，它们的存在和生长对神经元间的连接是有害的。此外，本发明的化合物能够降低神经炎症和小胶质细胞活化，同时增加颗粒蛋白前体(pgrn)神经营养因子的水平。神经炎症是慢性进行性神经退行性疾病(包括但不限于tau蛋白病和帕金森病)中的继发反应，其可由释放引起神经元损失的神经毒性促炎细胞因子的活化小神经胶质细胞触发。pgrn是主要在成熟神经元和小胶质细胞中表达的分泌型糖蛋白，其保持脑皮质的活力(brain j.neurol.140,3081-3104(2017))。脑中的pgrn表达在早期发育中较低且随年龄增加(trends neurosci.37,388-398(2014),j.reprod.dev.57,113
–
119(2011))。然而，应答损伤，活化的小胶质细胞上调pgrn表达(acta neuropathol.(berl.)119,123-133(2010),neuroscience 250,8-19(2013))。关于tau病理学，pgrn缺陷加速表达人tau的小鼠中的tau沉积和磷酸化(j.neuropathol.exp.neurol.74,158-165(2015))。pgrn可被几种蛋白酶加工成颗粒蛋白，
包括从活化的小胶质细胞释放的弹性蛋白酶(neurology 90,118-125(2018))。人类和啮齿动物数据已经显示pgrn减少与增加的tau病理学有关。pgrn单倍不足会增加p301l-tau转基因小鼠的tau磷酸化，这有力支持了pgrn蛋白的减少可能导致tau超磷酸化和神经元内积聚的观点(j.neuropathol.exp.neurol.74,158-165(2015))。此外，还报道了脑中的炎性刺激与加剧tau磷酸化相关(j.neuroinflammation 7,56(2010))。由于pgrn可在神经炎症中充当抗炎因子(neuroscience 250,8-19(2013))，因此假设tau磷酸化将在由降低的pgrn水平引起的炎症状态中加速。pgrn是一种神经营养因子，其在帕金森病中的作用已充分研究。van kampen等已使用pd的1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(mptp)模型来研究pgrn基因递送作为用于预防或治疗pd疗法的可能用途(plos one 2014,9,5,e97032)。病毒载体递送pgrn基因是提高黑质纹状体神经元中pgrn表达的有效手段。当snc中的pgrn表达升高时，黑质纹状体神经元在小鼠中被保护免受mptp毒性，同时保护纹状体多巴胺含量和周转。此外，通过pgrn基因治疗保护黑质纹状体神经元伴随着mptp诱导的炎症和细胞凋亡的标志物的减少以及运动功能的完全保留。此外，人中颗粒蛋白前体的血液水平可以反映帕金森病的严重程度和进展(neuroscience letters volume 725,23april 2020,134873)。与对照相比，帕金森病患者的颗粒蛋白前体血浆水平显著较低，且还发现与运动症状、疾病严重性和持续时间负相关，因此表明pgrn在pd中的神经保护作用。所有这些发现支持增加pgrn水平可以是改善神经退行性疾病(如tau蛋白病和帕金森病)的有效疗法。特别地，发现本发明的琥珀酸盐具有神经保护作用且能够显著地减少由线粒体毒素mpp
+
或鱼藤酮损伤(两种著名的pd体外模型)的多巴胺能神经元中α-突触核蛋白的积聚。
[0068]
tau蛋白病包括但不限于阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化和帕金森-关岛痴呆综合征、嗜银颗粒病、慢性创伤性脑病、皮质基底节变性、搏击性痴呆、伴有钙化的弥漫性神经原纤维缠结、家族性英国型痴呆、家族性丹麦型痴呆、额颞叶痴呆(ftd)、伴17号染色体连锁帕金森的额颞叶痴呆(ftdp-17)、额颞叶变性(ftld)、额颞叶痴呆-颗粒蛋白亚型(ftd-grn)、gerstmann
‑‑
scheinker病、guadeloupean帕金森病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、多系统萎缩、steinert肌强直性营养不良、ii型肌强直性营养不良、伴有脑铁积聚的神经退行性变、c型尼曼-匹克病、伴有神经纤维缠结的non-guamanian运动神经元病、paget病、匹克病、脑炎后帕金森综合征、进行性皮质下胶质细胞增生、进行性核上性麻痹(psp)、slc9a6相关智力障碍、亚急性硬化性全脑炎、缠结性痴呆、多发梗塞性痴呆、缺血性中风、慢性创伤性脑病(cte)、创伤性脑损伤(tbi)、中风和具有球状胶质包涵体的白质tau蛋白病。
[0069]
此外，本发明的琥珀酸盐及其溶剂合物的物理化学性质(诸如结晶度、稳定性、溶解度)对于固体和液体药物制剂尤其有用。
[0070]
因此，如上所述，由于其纠正tau蛋白代谢，增加pgrn神经营养因子水平和减少神经炎症的能力，本发明的琥珀酸盐及其溶剂合物可用作药物，特别是用于治疗或预防神经退行性疾病，包括tau蛋白病和帕金森病。
[0071]
因此，本发明的琥珀酸盐可用作药物，特别是用于治疗或预防神经退行性疾病和其中观察到tau蛋白磷酸化功能障碍的所有疾病，包括但不限于tau蛋白病。
[0072]
在一个实施方案中，本发明涉及本发明的琥珀酸盐，其用于治疗或预防选自以下的疾病：神经退行性疾病和其中观察到tau蛋白磷酸化功能障碍的疾病，包括但不限于tau
蛋白病。
[0073]
因此，本发明还涉及如本文所定义的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物，其用于治疗和/或预防选自以下的疾病：阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化和帕金森-关岛痴呆综合征、嗜银颗粒病、慢性创伤性脑病、皮质基底节变性、搏击性痴呆、伴有钙化的弥漫性神经原纤维缠结、家族性英国型痴呆、家族性丹麦型痴呆、额颞叶痴呆(ftd)、伴17号染色体连锁帕金森的额颞叶痴呆(ftdp-17)、额颞叶变性(ftld)、额颞叶痴呆-颗粒蛋白亚型(ftd-grn)、gerstmann
‑‑
scheinker病、guadeloupean帕金森病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、多系统萎缩、steinert肌强直性营养不良、ii型肌强直性营养不良、伴有脑铁积聚的神经退行性变、c型尼曼-匹克病、伴有神经纤维缠结的non-guamanian运动神经元病、paget病、匹克病、脑炎后帕金森综合征、进行性皮质下胶质细胞增生、进行性核上性麻痹(psp)、slc9a6相关智力障碍、亚急性硬化性全脑炎、缠结性痴呆、多发梗塞性痴呆、缺血性中风、慢性创伤性脑病(cte)、创伤性脑损伤(tbi)、中风和具有球状胶质包涵体的白质tau蛋白病。优选地，所述疾病选自阿尔茨海默病、嗜银颗粒病、皮质基底节变性、伴有钙化的弥漫性神经原纤维缠结、额颞叶痴呆(ftd)、伴17号染色体连锁帕金森病的额颞叶痴呆(ftdp-17)、额颞叶变性(ftld)、额颞叶痴呆-颗粒蛋白亚型(ftd-grn)、匹克病、进行性皮质下神经胶质增生、进行性核上性麻痹(psp)、缠结性痴呆和具有球状胶质包涵体的白质tau蛋白病。更优选地，所述疾病选自阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(ftd)、伴17号染色体连锁帕金森病的额颞叶痴呆(ftdp-17)、额颞叶变性(ftld)、额颞叶痴呆-颗粒蛋白亚型(ftd-grn)、进行性核上性麻痹(psp)、缠结性痴呆和具有球状胶质包涵体的白质tau蛋白病。甚至更优选地，所述疾病选自阿尔茨海默病和进行性核上性麻痹(psp)。
[0074]
在其他方面，本发明还提供了用于治疗和/或预防选自tau蛋白病，特别是以上引用的那些tau蛋白病的疾病的方法，及其实施方案，所述方法包括向有需要的患者施用药学有效量的如本文所述的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物。在一个具体实施方案中，所述疾病选自阿尔茨海默病和进行性核上性麻痹(psp)。
[0075]
在其他方面，本发明还提供如本文所述的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物在制备用于治疗和/或预防选自tau蛋白病，特别是以上引用的那些疾病的药物中的用途及其实施方案。在一个具体实施方案中，所述疾病选自阿尔茨海默病和进行性核上性麻痹(psp)。
[0076]
在另一个实施方案中，本发明还涉及本发明的琥珀酸盐，其用于在患者中延迟选自以下的疾病的发作：神经退行性疾病和其中观察到tau蛋白磷酸化功能障碍的疾病，包括但不限于tau蛋白病。
[0077]
在一个具体实施方案中，本发明还涉及如本文所定义的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物，其用于在患者中延迟选自以下的疾病的发作：阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化和帕金森-关岛痴呆综合征、嗜银颗粒病、慢性创伤性脑病、皮质基底节变性、搏击性痴呆、伴有钙化的弥漫性神经原纤维缠结、家族性英国型痴呆、家族性丹麦型痴呆、额颞叶痴呆(ftd)、伴17号染色体连锁帕金森的额颞叶痴呆(ftdp-17)、额颞叶变性(ftld)、额颞叶痴呆-颗粒蛋
白亚型(ftd-grn)、gerstmann
‑‑
scheinker病、guadeloupean帕金森病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、多系统萎缩、steinert肌强直性营养不良、ii型肌强直性营养不良、伴有脑铁积聚的神经退行性变、c型尼曼-匹克病、伴有神经纤维缠结的non-guamanian运动神经元病、paget病、匹克病、脑炎后帕金森综合征、进行性皮质下胶质细胞增生、进行性核上性麻痹(psp)、slc9a6相关智力障碍、亚急性硬化性全脑炎、缠结性痴呆、多发梗塞性痴呆、缺血性中风、慢性创伤性脑病(cte)、创伤性脑损伤(tbi)、中风和具有球状胶质包涵体的白质tau蛋白病。优选地，所述疾病选自阿尔茨海默病、嗜银颗粒病、皮质基底节变性、伴有钙化的弥漫性神经原纤维缠结、额颞叶痴呆(ftd)、伴17号染色体连锁帕金森病的额颞叶痴呆(ftdp-17)、额颞叶变性(ftld)、额颞叶痴呆-颗粒蛋白亚型(ftd-grn)、匹克病、进行性皮质下神经胶质增生、进行性核上性麻痹(psp)、缠结性痴呆和具有球状胶质包涵体的白质tau蛋白病。更优选地，所述疾病选自阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(ftd)、伴17号染色体连锁帕金森病的额颞叶痴呆(ftdp-17)、额颞叶变性(ftld)、额颞叶痴呆-颗粒蛋白亚型(ftd-grn)、进行性核上性麻痹(psp)、缠结性痴呆和具有球状胶质包涵体的白质tau蛋白病。甚至更优选地，所述疾病选自阿尔茨海默病和进行性核上性麻痹(psp)。
[0078]
在其他方面，本发明提供了用于在患者中延迟选自tau蛋白病，特别是以上引用的tau蛋白病的疾病发作的方法及其实施方案，所述方法包括向有需要的患者施用药学有效量的本发明的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物。在一个具体实施方案中，所述疾病选自阿尔茨海默病和进行性核上性麻痹(psp)。
[0079]
在其他方面，本发明还提供如本文所述的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物在制备用于在患者中延迟选自tau蛋白病，特别是以上引用疾病的发作的药物中的用途及其实施方案。在一个具体实施方案中，所述疾病选自阿尔茨海默病和进行性核上性麻痹(psp)。
[0080]
本发明还涉及如本文所定义的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物，其用于治疗和/或预防帕金森病。
[0081]
在其他方面，本发明还提供了治疗和/或预防帕金森病的方法，其包括向有需要的患者施用药学有效量的如本文所述的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物。
[0082]
在其他方面，本发明还提供如本文所述的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物在制备用于治疗和/或预防帕金森病的药物中的用途。
[0083]
在一个具体实施方案中，本发明还涉及如本文定义的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物，其用于在患者中延迟帕金森病的发作。
[0084]
在其他方面，本发明提供了用于延迟患者中帕金森病发作的方法，其包括向对其有需要的患者施用药学上有效量的本发明的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物。
[0085]
在其他方面，本发明还提供如本文所述的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物在制备用于在患者中延迟帕金森病发作的药物中的用途。
[0086]
根据本发明的另一个特征，提供了用于在需要此类治疗的患者，优选温血动物，且甚至更优选人中抑制病理性tau蛋白磷酸化的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的本发明的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物。
[0087]
根据本发明的另一个特征，提供了在需要这种治疗的患者，优选温血动物，甚至更优选人中抑制病理性tau蛋白磷酸化同时增加神经营养因子颗粒蛋白前体(pgrn)水平的方法，其包括向所述患者施用有效量的本发明的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物。
[0088]
本发明还提供了包含如本文所述的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂的药物组合物。在一个实施方案中，本发明还涵盖药物组合物，其除了含有n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物作为活性成分外，还含有其他的治疗剂和/或活性成分。
[0089]
根据一个实施方案，本发明的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐以及它们的药学上可接受的溶剂合物可以作为组合疗法的一部分施用。因此，包括组合物和药物的共同施用的实施方案包括在本发明的范围内，所述组合物和药物除了含有本发明的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物作为活性成分之外，还含有其他的治疗剂和/或活性成分。这种多种药物治疗方案，通常称为“组合治疗”，可用于治疗和/或预防任何神经退行性疾病，特别是tau蛋白病或帕金森病。这种治疗剂的组合的使用尤其适用于需要治疗或有可能成为上述神经退行性疾病的患者的治疗。
[0090]
除治疗功效的需求(其可能需要使用除n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物之外的活性剂)外，可能存在其他的理由，其迫使或强烈建议使用涉及代表辅助治疗的活性成分的药物组合；即，其补充和增加由本发明的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物的功能。用于辅助治疗目的的合适辅助治疗剂包括，代替直接治疗和/或预防由病理性蛋白tau磷酸化和/或神经炎症介导或与其相关的疾病或病症，治疗由基础或潜在病理性蛋白tau磷酸化和/或神经炎症调节的疾病或病症直接产生或间接伴随的疾病或病症的药物。
[0091]
根据本发明的另一个特征，n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐，其药学上可接受的溶剂合物可以与用于治疗神经退行性疾病(诸如阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹(psp)和帕金森病)的其他药物组合治疗。更特别地，式ii的化合物及其药学上可接受的溶剂合物可与乙酰胆碱酯酶抑制剂组合用作辅助疗法，包括但不限于多奈哌齐(cas n
°
120014-06-4)及其盐和溶剂合物，加兰他敏(cas n
°
357-70-0)及其盐和溶剂合物，利斯的明(cas n
°
123441-03-2)及其盐和溶剂合物，他克林(cas n
°
321-64-2)及其盐和溶剂合物，或与nmda谷氨酸酯拮抗剂组合，包括但不限于美金刚(cas n
°
19982-08-2)及其盐和溶剂合物，或与双重乙酰胆碱酯酶抑制剂和nmda谷氨酸酯拮抗剂组合，包括但不限于石杉碱甲(cas n
°
102518-79-6)及其盐和溶剂合物，或与胰高血糖素样肽1(glp-1)激动剂组合，包括但不限于利拉鲁肽(cas n
°
204656-20-2)及其盐和
溶剂合物，艾塞那肽(cas n
°
141732-76-5)及其盐和溶剂合物，或与类视黄醇组合，包括但不限于阿维a(cas n
°
55079-83-9)及其盐和溶剂合物，或与钙通道阻断剂(ccb)组合，包括但不限于尼伐地平(cas n
°
75530-68-6)及其盐和溶剂合物，尼群地平(cas n
°
39562-70-4)及其盐和溶剂合物，尼莫地平(cas n
°
66085-59-4)及其盐和溶剂合物，或与血管紧张素受体阻断剂组合，包括但不限于缬沙坦(cas n
°
137862-53-4)及其盐和溶剂合物，或与四环素类抗生素组合，包括但不限于米诺环素(cas n
°
10118-90-8)及其盐和溶剂合物，或与选自下组的单克隆抗体组合：阿杜那单抗(aducanumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、苏兰珠单抗(solanezumab)、gantenerumab、crenezumab、ban2401、gsk933776、aab-003、sar228810、biib037/bart、abbv-8e12、biib092和ucb0107，或与糖苷酶(o-glcnacase)抑制剂组合，或与多巴胺前药组合，包括但不限于左旋多巴，任选地与卡比多巴组合，或与多巴胺受体激动剂组合，包括但不限于普拉克索、罗替戈汀、罗匹尼罗、金刚烷胺，或与抗胆碱能药物组合，诸如苯扎托品、苯海索，或与mao-b抑制剂组合，包括但不限于沙芬酰胺、司来吉兰和雷沙吉兰，或与comt抑制剂组合，包括但不限于恩他卡朋、奥匹卡朋和托卡朋。
[0092]
因此，本发明的治疗方法和药物组合物可在单一疗法中使用n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物。然而，所述方法和组合物也可用于多种治疗，其中n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的一种或多种琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物与一种或多种其他治疗剂组合共同施用。
[0093]
在上述实施方案中，n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物与其他治疗活性剂的组合可以以分开或彼此组合的剂量形式施用，且以它们的施用时间，顺序或同时施用。因此，一种组分药剂的施用可以在其他组分剂施用之前、同时或之后。
[0094]
通常，对于药物用途，n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物可以被配制为药物组合物，其包含至少一种本发明的琥珀酸盐或其药学上可接受的溶剂合物和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂，以及任选的一种或多种其他的治疗剂和/或活性成分。
[0095]
通过非限制性实例的方式，药物组合物可以是适合于口服施用，肠胃外施用(诸如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)、局部施用，通过吸入，通过皮肤贴剂，通过植入物，通过栓剂等施用的剂型。此类适合的施用形式(其可以是固体、半固体或液体，取决于施用方式)以及用于其制备的方法和载体、稀释剂和赋形剂对于本领域技术人员是清楚的；参考最新版的remington’s pharmaceutical sciences。药物组合物可以配制成固体形式并在使用前再溶解或悬浮。本发明的琥珀酸盐或其溶剂合物的优选药物组合物呈适于口服施用的固体剂型。
[0096]
剂型的一些优选但非限制性实例包括片剂、丸剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂、软膏剂、霜剂、洗剂、软和硬明胶胶囊、栓剂、滴剂、灭菌可注射溶液剂和灭菌包装散剂(其通常在使用前重溶)，用于推注施用和/或连续施用，其可以用本身适于此类制剂的载体、赋形剂和稀释剂配制，诸如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、琼脂、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、纤维素、(灭菌)水、甲基纤维素、甲基和丙基羟苯甲酸酯、滑石、硬脂酸
镁、食用油、植物油和矿物油或其合适的混合物。本发明的琥珀酸盐及其溶剂合物的特别优选的剂型是软和硬胶囊，特别是软和硬明胶胶囊，优选硬明胶胶囊，其与至少一种微晶纤维素赋形剂配制，尤其是ph101。药物组合物可以任选地含有通常用于药物制剂的其他物质，诸如润滑剂、润湿剂、乳化剂和助悬剂、分散剂、崩解剂、稳定剂、等渗剂、膨胀剂、填充剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、着色剂、抗菌剂和/或抗真菌剂，诸如苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、分散剂、流动调节剂、释放剂等。还可以配制组合物以提供其中含有的活性化合物的快速、持续或延迟释放。
[0097]
本发明的药物组合物优选以单位剂量形式，并可适当地包装，例如在盒子、泡罩、小瓶、瓶子、小袋、安瓿，或任何其他合适的单剂量或多剂量保持器或容器(其可适当地标记)中；任选地，具有一份或多份包含产品信息和/或使用说明的单页。通常，此类单位剂量将含有0.05-1000mg，通常1-500mg的至少一种本发明化合物，例如每单位剂量约10、25、50、100、200、300或400mg。
[0098]
通常，取决于待预防或治疗的病症和施用途径，本发明的活性化合物通常将以0.01-100mg/kg，更通常0.1-50mg/kg，诸如1-25mg/kg，例如约0.5、1、2、5、10、15、20或25mg/kg患者体重每天施用，其可为单一日剂量施用，分成一个或多个日剂量，或基本上连续施用，例如使用滴注。
[0099]
所有提及的式ii化合物包括提及的溶剂合物，特别是水合物、多组分复合物及其液晶。
[0100]
本技术全文公开的化合物使用ultra 11.0版(cambridgesoft,cambridge,ma,usa)命名。
[0101]
n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺的游离碱可如wo2006/051489中公开的获得。琥珀酸盐及其溶剂合物可根据本领域已知的技术制备，诸如涉及沉淀、结晶、重结晶、冷冻干燥、相转移或离子交换树脂的技术。
[0102]
定义
[0103]
下面的定义和解释是针对全文申请，包括说明书、附图和权利要求中使用的术语。
[0104]
当描述本发明的化合物时，除非另外指明，否则所使用的术语应根据以下定义来解释。
[0105]
除非另有说明，否则本文中对本发明化合物的任何提及意指式ii化合物以及其药学上可接受的溶剂合物。所有提及的式ii化合物包括提及的其药学上可接受的溶剂合物及其所有结晶形式。
[0106]
术语“施用(administration)”或其变体(例如“施用(administering)”)是指将活性剂或活性成分(例如n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺)单独或作为药学上可接受的组合物的部分提供给待治疗或预防其病症、症状或疾病的患者。
[0107]
本文所用的术语“阿尔茨海默病”是指所有类型的阿尔茨海默病，包括但不限于散发性和家族性类型。
[0108]
本文所用的表述“抑制”是指部分抑制或减少，以及完全抑制。
[0109]
术语“人”是指两种性别，以及处于任何发育阶段(即新生儿、婴儿、少年、青少年、
成人)的受试者。
[0110]
术语“患者”是指正在等待接受或正在接受医疗护理或正在/将要成为医疗程序对象的温血动物，更优选人。
[0111]“药学上可接受的”是指药物组合物的成分彼此相容且对其患者无害。
[0112]
本文所用的术语“预防(prevent/preventing/prevention)”是指延迟或排除病症或疾病和/或其伴随症状的发作，阻止患者获得病症或疾病，或降低患者获得病症或疾病的风险的方法。
[0113]
本文所用的术语“倍半”是指1.5倍当量，化合物的倍半琥珀酸盐是指其琥珀酸加成盐，其中琥珀酸与其游离碱形式的化合物相比以3:2的比例存在。
[0114]
术语“溶剂合物”在本文中用于描述本发明中的化合物，其含有化学计量或亚化学计量的量的一种或多种药学上可接受的溶剂分子，诸如乙醇。当所述溶剂是水时，用术语“水合物”。药学上可接受的溶剂分子可以与本发明的化合物共结晶，和/或以其固体的结晶和/或无定形相存在，和/或吸附到其上。
[0115]
本发明的化合物包括如上文所定义的式ii的化合物，包括其所有多晶型物和晶体惯态、其前药和同位素标记的式ii的化合物。
[0116]
本文所用的术语“tau病”是指其特征在于，tau蛋白的异常代谢，特别是tau蛋白的异常磷酸化和/或超磷酸化和/或在细胞、组织或流体(优选脑组织和/或脑脊液)中存在tau或tau同种型或tau多肽和/或tau的病理形式的水平升高(高于正常对照水平，例如高于相同年龄组的个体或个体群体的正常对照水平)的病症。更特别地，tau病是指其中观察到异常修饰的tau蛋白的胞内积聚体的病症，诸如神经原纤维缠结(nft)、匹克体、星形细胞簇和/或肌肉包涵体，优选至少神经原纤维缠结(nft)。
[0117]
本文所用的术语“治疗有效量”(或更简单地，“有效量”)是指活性剂或活性成分(例如n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺)的量，其足以在其所施用的患者中实现所需的治疗或预防效果。
[0118]
本文所用的术语“治疗(treat/treating/treatment)”意在包括减轻、减弱或消除病症或疾病和/或其伴随症状。
[0119]
参考以下实施例将更好地理解本发明。这些实施例旨在代表本发明的具体实施方案，而不旨在限制本发明的范围。
[0120]
附图简要说明
[0121]
图1显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺二硫酸盐a型结晶形式的xrpd 2θ衍射图。
[0122]
图2显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺二硫酸盐b型结晶形式的xrpd 2θ衍射图。
[0123]
图3显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐的晶型1结晶形式的xrpd 2θ衍射图。
[0124]
图4显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺三琥珀酸盐的晶型2结晶形式的xrpd 2θ衍射图。
[0125]
图5显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺后倍半琥珀酸盐半水合物(0.5eq.水)结晶形式的xrpd 2θ衍射图。
[0126]
图6显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐一水合物(1.1eq.水)结晶形式的xrpd 2θ衍射图。
[0127]
图7显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐的晶型1结晶形式的hplc色谱图。
[0128]
图8显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐的晶型1结晶形式的tg/dt热分析图。
[0129]
图9显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐的晶型1结晶形式的dsc热分析图(第一加热循环)。
[0130]
图10显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐的晶型1结晶形式的gvs等温线图。
[0131]
图11显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐的晶型1结晶形式的gvs动力学图。
[0132]
图12显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐的晶型1结晶形式的gvs后xrpd 2θ衍射图。
[0133]
图13显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐的晶型1结晶形式的ft-ir光谱。
[0134]
图14显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐的晶型1结晶形式的1h-nmr谱(dmso-d6，500.12mhz)。
[0135]
图15显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐的晶型1结晶形式的
13
c定量-nmr光谱(dmso-d6，500.12mhz)。
[0136]
图16显示7天稳定性测试的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐的晶型1结晶形式的xrpd2θ衍射图。
[0137]
图17显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐的晶型1结晶形式的一批xrpd 2θ衍射图的重叠图。
[0138]
图18显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺三琥珀酸盐的晶型2结晶形式的tg/dt热分析图。
[0139]
图19显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺三琥珀酸盐的晶型2结晶形式的dsc热分析图。
[0140]
图20显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺三琥珀酸盐的晶型2结晶形式的1h-nmr谱(meoh-d4，500.12mhz)。
[0141]
图21显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺三琥珀酸盐的晶型2结晶形式的dvs等温线图。
[0142]
图22显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺三琥珀酸盐的晶型2结晶形式的dvs动力学图。
[0143]
图23显示了n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐晶型1与ph101配制于硬明胶胶囊中的共混物并室温下储存的xrpd(4-35
°
2θ)衍射图。
[0144]
图24显示n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐晶型1与ph101配制于硬明胶胶囊中的共混物并储存于40℃/
75％ rh下的xrpd(4-35
°
2θ)衍射图。
[0145]
图25显示aβ
1-42
损伤72h后，n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐晶型1与小胶质细胞一起培养对皮质神经元中存活(a)、神经突触网络(b)和tau磷酸化(at100)(c)的作用。结果以对照(ctr)条件的百分比表示,为平均值
±
sem(n＝4-6)。单因素方差分析后进行fisher检验。*；**或***表示p《0.05；p《0.01或p《0.001vs aβ
1-42
或###vs ctr，p《0.05被认为是显著的。
[0146]
图26显示aβ
1-42
损伤72小时后，n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐晶型1与小胶质细胞一起培养对皮质神经元中的小胶质细胞活化(a)和pgrn释放(b)的作用。结果以对照(ctr)条件的百分比表示，为平均值
±
sem(n＝4-6)。单因素方差分析后进行fisher检验。*；**或***表示p《0.05；p《0.01或p《0.001vs aβ
1-42
或###vs ctr，p《0.05被认为是显著的。
[0147]
图27显示在mpp
+
损伤后n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐晶型1在原代中脑神经元th(+)中预孵育或共孵育48h对存活(a)、神经突触网络(b)和α-突触核蛋白积聚(c)的作用。结果以对照条件的百分比表示，为平均值
±
sem(n＝4-6)。单因素方差分析后进行fisher检验。####p《0.0001vs对照；*《0.05；**p《0.01；***p《0.001或****p《0.0001vs mpp
+
。
[0148]
图28显示鱼藤酮损伤24h后，n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐晶型1在原代中脑神经元th(+)中预孵育或共孵育对存活(a)、神经突触网络(b)和α-突触核蛋白积聚(c)的作用。结果以对照条件的百分比表示，为平均值
±
sem(n＝4-6)。单因素方差分析后进行fisher检验。####p《0.0001vs对照；*《0.05；**p《0.01；***p《0.001或****p《0.0001vs鱼藤酮。
[0149]
化学实施例
[0150]
本技术全文使用以下缩写：℃：摄氏度，aw：水活度，dmso：二甲亚砜，dsc：差示扫描量热法，gvs：重量蒸汽吸附，δ：nmr化学位移，以ppm表示，eq：当量，edta：乙二胺四乙酸，eq.：当量，g：克，h：小时，hdpe：高密度聚乙烯，hplc：高效液相色谱，hz：赫兹，ft-ir：傅立叶变换红外光谱，l：升，m：mol/l，mm：mmol/l，μm：μmol/l，me：甲基，mek：甲基乙基酮，mg：毫克，mhz：兆赫，min：分钟，ml：毫升，mm：毫米，mol：摩尔，mmol：毫摩尔，μmol：微摩尔，mpp
+
：1-甲基-4-苯基吡啶-1-鎓，nm：纳米，nmr：核磁共振，pbs：磷酸盐缓冲盐水，plm：偏振光显微术，pgrn：颗粒蛋白前体，ppm：百万分率，rh：相对湿度，rpm：每分钟转数，rt：保留时间，rt：室温(ca 15-25℃)，s：秒(s)，tfa：三氟乙酸，tg/dta：热重/差热分析，uv：紫外线，v：体积，vh-xrpd：可变湿度x射线粉末衍射，wb：western blot，xrpd：x-射线粉末衍射。
[0151]
所有列出的温度以摄氏度(℃)表示；除非另有说明，所有反应均在室温(rt)下进行。
[0152]
在本发明中使用的实验设置或纯化程序，当未以具体细节描述时，假定为本领域技术人员已知的且描述于此类标准参考手册中，诸如：i)gordon,a.j.；ford,r.a.“the chemist’s companion-a handbook of practical data,techniques,and references”,wiley:new york,1972；ii)vogel’s textbook of practical organic chemistry,pearson prentice hall:london,1989；iii)p.heinrich stahl and camille g.wernuth
‘
handbook of pharmaceutical salts’,wiley vch。
[0153]
hplc分析。
[0154]
方法a：
[0155]
仪器：dionex ultimate 3000
[0156]
柱：supelco ascentis express c1815 x 4.6mm 2.7μm
[0157]
柱温：50℃
[0158]
自动进样器温度：环境
[0159]
uv波长：275nm
[0160]
注射体积：20μl
[0161]
流速：1ml/min
[0162]
流动相a：0.1％ tfa的水
[0163]
流动相b：0.1％ tfa的乙腈
[0164]
梯度程序：
[0165][0166][0167]
方法b：
[0168]
在变体中，使用zorbax extend c18 150x4.6mm 3.5μm柱，以与上述相同的参数进行hplc分析。
[0169]
nmr分析
[0170]
nmr实验在配备有dch冷冻探针的bruker aviiihd光谱仪上进行，在500.12mhz下测试质谱和碳谱。在氘代dmso中进行实验，且将每个样品制备至约10mm浓度。任选地在d2o和/或甲醇-d4中进行进一步分析。化学位移以百万分率(ppm，δ单位)表示。偶合常数以hz表示。在nmr光谱中观察到的多重性的缩写如下：s(单峰)，d(双峰)，t(三重峰)，q(四重峰)，m(多重峰)，br(宽峰)。
[0171]
uv分析(仅用于胶囊共混物均一性)
[0172][0173]
使用具有10mm光程的石英比色杯测量样品。最初在190nm-400nm范围内对在水中制备的浓度为20μg/ml的盐溶液上进行uv扫描。使用相同的溶剂进行基线校正。固定的280nm波长主要用于证实盐制剂的共混均一性。
[0174]
x-射线粉末衍射(xrpd)
[0175]
在具有pixcel检测器(128通道)的panalytical x'pert pro上进行xrpd分析，在3-35
°
2θ之间扫描样品。将材料轻轻研磨以释放任何结块，并上样到具有mylar聚合物膜的
多孔板上以支持样品。然后，将多孔板置于衍射仪中并使用cu kα辐射进行分析(kα辐射进行分析(α1:α2比例＝0.5)，使用40kv/40ma发电机设置的传输模式(步长0.0130
°
2θ，步时18.87s)运行。使用highscore plus 4.7桌面应用程序(panalytical,2017)可视化数据并生成图像。热重/差热分析(tg/dta)
[0176]
将约5mg材料称入开口铝盘中，并装入同时热重/差热分析仪(tg/dta)中，并在室温下保持。然后，将样品以10℃/min的速率从20℃加热至300℃，期间记录样品重量随任何差热事件(dta)的变化。使用氮气作为吹扫气体，流速为300cm3/min。
[0177]
差示扫描量热法(dsc)
[0178]
将约5mg的材料称重到dsc铝盘中并用穿孔的铝盖非气密地密封。然后，将样品盘装入冷却并保持在20℃的seiko dsc6200(配备有冷却器)中。获得稳定的热流响应后，将样品和参比物以10℃/min的速率加热至180℃并监测所得热流响应。使用氮气作为吹扫气体，流速为50cm3/min。
[0179]
红外光谱法(ir)
[0180]
红外光谱在bruker alpha p光谱仪上进行。将足够的材料放置在光谱仪板的中心上且使用以下参数获得光谱：
[0181]
分辨率：4cm-1
[0182]
背景扫描时间：16次扫描
[0183]
样品扫描时间：16次扫描
[0184]
数据收集：4000-400cm-1
[0185]
结果谱：透光率
[0186]
软件：opus版本6
[0187]
重量蒸汽吸附(gvs)
[0188]
将约10-20mg的样品置于网状蒸汽吸附天平盘中并装载到hiden analytical的igasorp水分吸附分析仪天平中。样品从40-90％相对湿度(rh)以10％增量的斜坡曲线，在25℃下在每个步骤保持样品直至达到稳定重量(98％的步骤完成，最小步长30分钟，最大步长60分钟)。在完成吸附循环之后，使用相同程序将样品干燥到0％ rh，且最终回到40％ rh的起点。进行两个循环。绘制吸附/解吸循环期间的重量变化，从而测定样品的吸湿性质。
[0189]
动态蒸气吸附(dvs)
[0190]
将约10-20mg的样品置于网状蒸汽吸附天平盘中并上样至surface measurement systems的intrinsic动态蒸汽吸附天平中。
[0191]
样品从40-90％相对湿度(rh)以10％增量的斜坡曲线，在25℃在每个步骤保持样品直到达到稳定重量(dm/dt 0.004％，最小步长30分钟，最大步长500min)。在完成吸附循环之后，使用相同程序将样品干燥到0％ rh，且接着使第二吸附循环回到40％ rh。进行两个循环。绘制吸附/解吸循环期间的重量变化，从而测定样品的吸湿性质。然后，对留下的任何固体进行xrpd分析。
[0192]
可变湿度x射线粉末衍射(vh-xrpd)
[0193]
在装有湿度室的philips x'pert pro多用途衍射仪上进行vh-xrpd分析。使用用40kv/40ma发电机设置在bragg-brentano geometry(步长0.008
°
2θ)中运行的cu k辐射(
rh并逐渐降低至0％ rh(图10)。gvs动力学图可见于图11，其显示在70-90％ rh间重量的快速增加。gvs后xrpd分析发现该物质在暴露于gvs湿度条件(顶部：材料的xrpd；底部：gvs后材料的xrpd)后仍保持相同的结晶形式。
[0207]
ft-ir光谱示于图13中。
[0208]
dmso-d6中的1h和定量
13
c nmr光谱分别见图14和图15中。
[0209]1h nmr谱(500.12mhz-dmso-d6)：δ(ppm)：7.13(2h dd j1＝6hz,j2＝3hz)，6.87(2h dd j1＝6hz,j2＝3hz)，6.71(1h br s)，3.30(2ht j＝7hz)，2.42(6h m，2.33 4h dt j1＝16hz，j2＝7hz)，2.04(4h dj＝7hz)，1.74(2h quintet j＝7hz)，1.67(2h septet j＝7hz)，1.52(2hquintet j＝7hz)，0.85(12h d j＝7hz)ppm。
[0210]
定量
13
c nmr谱(121.16mhz-dmso-d6)：δ(ppm)：174.3、156.0、119.5、111.9、63.9 56.1、55.6、53.0(d)、29.8、26.8、26.6、24.2、21.3。定量
13
c nmr证实了倍半琥珀酸盐的化学计量和成功形成。
[0211]
直至90％ rh的vh-xrpd发现倍半琥珀酸盐晶型1在暴露于90％rh高达1小时30分钟后保持相同的结晶形式，结晶度或形式没有变化。
[0212]
7天稳定性试验
[0213]
7天稳定性测试按照如下进行：将15mg盐称重到x32ml小瓶中。然后，将小瓶置于40℃/75％ rh，80℃和环境光下；1周后，通过xrpd和hplc纯度(方法a)分析固体。
[0214]
7天稳定性测试(在40℃/75％ rh，80℃和环境光下)后回收的固体的xrpd分析显示，在暴露于这些条件后结晶度或形式没有变化(图16)。
[0215]
从7天稳定性测试回收的固体的hplc分析(方法a)显示在每种稳定性条件下纯度没有变化。这些值列于表2中。
[0216]
表2：倍半琥珀酸盐晶型1的hplc纯度值-7天稳定性测试
[0217]
条件纯度(％)40℃/75％rh98.580℃98.3环境光98.4
[0218]
溶解性实验
[0219]
在未缓冲的水中的溶解度评估显示材料高度可溶，其值》500mg/ml。进行ph测量得到5.28的值。
[0220]
称取约20mg n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐晶型1至3
×
2ml小瓶中。加入100μl适当的缓冲液以形成浆液。结果列于表3中。
[0221]
表3：倍半琥珀酸盐晶型1溶解度值
[0222]
ph缓冲液溶解度(mg/ml)1.2hcl》2134.5柠檬酸》1766.8磷酸》182
[0223]
合成规模放大
[0224]
使用相同的实验条件从20g和79g游离碱开始合成另外两批这种倍半琥珀酸盐晶
型1。通过hplc(方法a)检查的所述批次的纯度为≥99％，产率分别为69％和73％。所有批次(514mg、20g和79g规模)的xrpd 2θ衍射图的重叠图如图17中所示。
[0225]
n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺，倍半琥珀酸盐晶型1可使用一锅法盐形成/结晶，重复地以多克的规模获得，收率良好。倍半琥珀酸盐晶型1非常稳定(纯度和多晶型形式)，高度结晶，高度可溶，在高达90％相对湿度下不吸湿，在应力条件下稳定。因此，该产品是合适的api且对于固体制剂尤其有益。
[0226]
实施例2：晶型2的合成和表征：n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺三琥珀酸盐的结晶形式
[0227]
将10mg n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺称量至1.5ml小瓶中并加入最小量的乙醇以实现游离碱的完全溶解。使用0.5m储备溶液(596.41mg琥珀酸溶解于10ml乙醇中)加入2当量琥珀酸。将小瓶在环境温度和40℃间进行温度循环(4小时循环)，同时搅拌6天。观察到沉淀，通过离心过滤分离固体，然后在40℃下真空干燥约24小时。通过hplc、xrpd、tg/dt、dsc、dvs、ft-ir、nmr和vh-xrpd分析固体。
[0228]
hplc(方法a)表明纯度为99.9％。
[0229]
xrpd 2θ衍射图显示该物质为晶体(参见图4)，且当用cukα光源照射时，其包含在2θ＝5.3
°±
0.2
°
(100％)、15.0
°±
0.2
°
(26.7％)、15.3
°±
0.2
°
(57.4％)、16.8
°±
0.2
°
(25.3％)、17.9
°±
0.2
°
(92.3％)、20.5
°±
0.2
°
(30.1％)、21.2
°±
0.2
°
(25.5％)、23.9
°±
0.2
°
(24.2％)、24.3
°±
0.2
°
(65.3％)和26.6
°±
0.2
°
(31.5％)的衍射角处的峰。
[0230]
tg/dt分析的tg曲线(参见图18)显示高达150℃没有质量损失，表明材料不含残留溶剂。在高于150℃的温度下观察到与盐解离有关的质量损失。dt曲线显示了与盐形式的偶联解离/熔融相关的吸热事件，起始为约155.1℃(峰159.1℃)。
[0231]
dsc热分析图(参见图19)显示三琥珀酸盐晶型2在约155.8℃开始熔化(峰157.7℃)。
[0232]
在meoh-d4中进行的1h nmr证实该盐含有3当量的琥珀酸(参见图20)。
[0233]1h nmr谱(500.12mhz-meoh-d4)：δ(ppm)：7.28(2h dd j1＝6hz，j2＝3hz)，7.10(2h dd j1＝6hz，j2＝3hz)，3.48(2h t j＝7hz)，2.78(6h br s)，2.67(7h m)，2.56(12h s)，2.41(4h d j＝7hz)，1.95(2h quintet j＝7hz)，1.87(2h septet j＝7hz)，1.79(2h sextet j＝7.4hz)，1.33(5h br m)，0.97(12h d j＝6.7hz)ppm。
[0234]
通过dvs分析，发现材料在70％ rh，约+0.1wt％吸收，随后是约+9.92wt％(约4.3当量水)的急剧增加，直至90％ rh。然后，轻易地下降至70％ rh并逐渐下降至0％ rh(图21)。dvs等温线图与i型等温线相关，表明在整个dvs循环中结构没有变化，如dvs动力学图(图22)所证实的，其中没有观察到质量的显著变化。dvs后xrpd分析显示该材料保持为三琥珀酸盐晶型2。
[0235]
7天稳定性显示晶型2在50℃、80℃和环境光条件下是稳定的。在不同缓冲液中的溶解度报告于表4中。
[0236]
表4：三琥珀酸盐晶型2溶解度值
[0237]
ph buffer溶解度(mg/ml)1.2hcl》123.24.5柠檬酸》92.4
6.8磷酸》95.7
[0238]
n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺三琥珀酸盐晶型2以一锅法成盐/结晶获得，收率良好。三琥珀酸盐晶型2非常稳定(纯度和多晶型形式)，高度结晶，高度可溶，在高达90％相对湿度下不吸湿，在应力条件下稳定。因此，该产品是合适的api且对于固体制剂尤其有益。
[0239]
实施例3：含有n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐晶型1的胶囊的制备和稳定性
[0240]
制剂共混物的制备
[0241]
将7.5g的ph101称量至体积为220ml的圆柱形鼓壳中，然后称量15g的n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐晶型1，最后称量7.5g的ph101。以这种方式加入晶型1和ph101赋型剂改善了两种化合物的混合。最终共混物为50:50w/w的晶型ph101。用torpac混配机粉末混合器/共混机，通过以55-65rpm的固定速度旋转滚筒5分钟时间，每60秒反向旋转，来混合制剂。5分钟后，取出子样品，制备相当于20μg/ml晶型1的水溶液。通过uv相对于相同盐和浓度的标准进行分析以确定共混物中的晶型1含量。进行混合直到获得均匀的共混物。由于赋形剂不溶于水，在分析之前将样品溶液通过0.45μm ptfe注射器式过滤器过滤。该标准用于证实所选择的膜对分析物的回收没有不利影响。获得均匀的共混物后，填充100粒硬明胶大小1的白色/白色胶囊。通过称量每批的10个填充胶囊来评估填充胶囊的均一性。空壳的变化视为不显著。
[0242]
制剂共混物的稳定性样品制备
[0243]
将填充的胶囊分配到hdpe螺旋盖瓶中，每瓶10个并放置储存。在每种条件下储存四个瓶：rt和40℃/75％ rh。10个胶囊用于初始时间点并用于测定重量均一性。在每个时间点，切开5个胶囊并将内容物分配到20ml闪烁瓶中。然后，将粉末用刮刀混合并根据需要取样用于hplc(方法b)和xrpd分析。
[0244]
共混物均一性
[0245]
当3个同时的子样品浓度一致在5％内时，建立共混均一性。倍半琥珀酸盐晶型1仅需要混合30分钟，以获得均匀粉末。
[0246]
表5：倍半琥珀酸盐晶型1共混物均一性值
[0247][0248][0249]
相比之下，发现因为在混合时形成小积聚体，二硫酸盐晶型b共混物需要长达60分钟。用二硫酸盐形式b施加过大的剪切力是必要的，以破坏积聚并加速(即降低至30mn)混合
过程，但也可能不利地影响结晶度。
[0250]
胶囊均一性：填充胶囊重量
[0251]
由于共混物的自由流动性质，粉末制剂很容易填充胶囊，且实现了合适的胶囊均一性。
[0252]
表6：填充倍半琥珀酸盐晶型1共混物的胶囊的重量
[0253]
重复倍半琥珀酸盐晶型1共混物(mg)1267.632269.953266.814273.645263.596271.267260.868271.639264.8810262.92平均值267.32标准差4.25％rsd1.59
[0254]
hplc稳定性测定
[0255]
在整个稳定性储存中没有发现纯度的变化，其中n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐晶型1在室温或40℃/75％ rh下在胶囊的整个4周储存中保留。
[0256]
表7：填充倍半琥珀酸盐晶型1共混物的胶囊的hplc纯度
[0257][0258]
xrpd稳定性分析
[0259]
在整个稳定性储存中没有发现结晶形式的变化，其中n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐晶型1在室温或40℃/75％ rh下在胶囊的整个4周储存中保留(参见图23和24)。
[0260]
将n-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1h-苯并[d]咪唑-2-胺倍半琥珀酸盐晶型1与微晶纤维素赋形剂有效共混，提供容易分散于胶囊中的自由流动粉末，由于api的纯度和结晶形式保持不变，因此实现在rt和40℃/75％ rh下的4周稳定性。
[0261]
生物学实施例
[0262]
aβ
1-42
对皮质神经元损伤的作用
[0263]
皮质神经元培养
[0264]
如callizot等在j neurosci res.2013,91:706-716中所述修改以包括小胶质细胞，培养用小胶质细胞培养的大鼠皮层神经元。在用co2深度麻醉后，通过颈脱位处死妊娠
15天的妊娠雌性大鼠(rats wistar；janvier labs france)。然后，收集胎儿并立即置于含有2％青霉素(10,000u/ml)和链霉素(10mg/ml)溶液(ps)和1％牛血清白蛋白(bsa)的冰冷l15 leibovitz培养基中。在37℃下用胰蛋白酶-edta溶液以0.05％胰蛋白酶和0.02％edta的最终浓度处理皮质20分钟。通过加入含有4.5g/l葡萄糖的dulbecco改良eagle培养基(dmem)终止解离，所述培养基含有ii级dnase i(终浓度0.5mg/ml)和10％胎牛血清(fcs)。细胞通过10ml移液管头的通道三次强制机械解离。然后，将细胞在4℃以515x g离心10min。弃去上清液，将沉淀重悬于确定的成分培养基中，该培养基由含有2％ b27补充溶液，2mmol/l的l-谷氨酰胺，2％ps溶液，10ng/ml脑源性神经营养因子(bdnf)，2％热灭活马血清，2％热灭活fcs，1g/l葡萄糖，1mm丙酮酸钠和100μm非必需氨基酸的neurobasal培养基组成。使用台盼蓝排除试验在neubauer细胞计数器中计数活细胞。将细胞以每孔45,000个的密度接种在用聚-l-赖氨酸预包被的96孔板(用于免疫染色)中，并在37℃下在空气(95％)-co2(5％)培养箱中培养。每2天更换培养基。
[0265]
测试化合物和人aβ
1-42
暴露
[0266]
培养11天后，皮质神经元用aβ溶液损伤(见下文)。aβ
1-42
制备按照callizot等，2013描述的程序进行。简言之，将aβ
1-42
肽以40μm的初始浓度溶解于上述确定的培养基中。将该溶液在37℃下在黑暗中温和搅拌3天，并在对照培养基中适当稀释至所用浓度(通过wb测量的含有0.5μm aβ低聚物(aβo)的5μm aβ
1-42
制剂)后立即使用。对照培养基由确定的培养基组成(如上所述)。将测试化合物溶解在水中并在培养基中混合。将化合物与aβ
1-42
制剂共同施用于与小胶质细胞一起培养72小时的原代皮质神经元。
[0267]
免疫染色
[0268]
用0.1％皂苷透化后，用含有1％胎牛血清的pbs封闭细胞15分钟。
[0269]
然后，将细胞与以下物质一起孵育2小时：
[0270]
a)对于map-2神经元：鸡多克隆抗体(ab)抗微管相关蛋白2(map-2)，在pbs中1/1000稀释，含有1％胎牛血清和0.1％皂苷。该抗体特异性结合神经元和神经突触，以研究神经元细胞存活和神经突触网络。
[0271]
b)对于at100 tau磷酸化：小鼠抗tau单克隆抗体，在thr212和ser214位点磷酸化(at100)，在pbs中稀释1/400，含有1％胎牛血清和0.1％皂苷。
[0272]
c)对于ox-41小胶质细胞：兔抗sirpα/cd172a(ox-41)多克隆ab，在pbs中稀释1/400，含有1％胎牛血清和0.1％皂苷。该ab特异性结合小神经胶质细胞，其允许评估其活化。
[0273]
用alexa fluor 350驴抗鸡igg，alexa fluor 488山羊抗小鼠igg，alexa fluor 568山羊抗兔igg，在含有1％ fcs，0.1％皂苷的pbs中稀释1/400，在室温下暴露这些抗体1小时。
[0274]
对于每种条件，使用imagexpress(molecular devices)以20x放大倍数自动拍摄每孔30张照片。使用相同的采集参数生成所有图像。使用custom module editor(molecular devices)自动进行分析。
[0275]
研究了以下读数：
[0276]-神经元存活：神经元总数(map-2染色)
[0277]-神经突触网络(map-2染色，以μm计)
[0278]-神经元内部的磷酸化tau：at100和map-2的共定位面积(重叠的μm2)
[0279]-小胶质细胞活化：小胶质细胞总面积(ox41染色，以μm2计)
[0280]
胞外颗粒蛋白前体定量
[0281]
根据制造商的建议，通过elisa(颗粒体蛋白前体(大鼠)elisa lit,adipogen,coger)测定培养基中pgrn的水平。简言之，在37℃下将100μl上清液直接加入到孔条中1小时。然后，在37℃加入100μl检测抗体1小时，并在37℃加入100μl hrp标记的链霉抗生物素蛋白1小时。最后，在室温下加入100μl tmb底物溶液10分钟。用glomax仪器(promega)在450nm波长下通过分光光度法评估光密度(od)。过氧化物酶的活性与pgrn的浓度成比例。
[0282]
统计分析
[0283]
结果以对照的百分比表示。所有值显示每种条件4-6个孔的平均值+/-sem(平均值的标准误差)。使用graphpad prism软件版本7.04在不同条件下进行图形和统计分析(anova，随后是dunnett或fisher t检验)。*p《0.05被认为是显著的。
[0284]
结果
[0285]
神经元存活：与对照组相比，用aβ
1-42
损伤显著降低皮质神经元的存活(图25a)。倍半琥珀酸盐晶型1在最高剂量(10nm-100nm)下是神经保护性的。
[0286]
神经突触网络：aβ
1-42
损伤后神经突触网络的总长度显著减少(图25b)。在最高剂量的倍半琥珀酸盐晶型1(10nm-100nm)的存在下，神经突触网络更长。
[0287]
at100：在应用aβ
1-42
时，在map-2皮层神经元中观察到at100的显著增加(图25c)。倍半琥珀酸盐晶型1在高于1nm的剂量下显著降低tau的超磷酸化。
[0288]
小胶质细胞的活化：如预期的，与对照组相比，aβ
1-42
的损伤触发了小胶质细胞的活化(图26a)。在所研究的剂量下，倍半琥珀酸盐晶型1能够降低小胶质细胞的活化。
[0289]
胞外pgrn：在aβ
1-42
存在下，与对照组相比，上清液中pgrn的水平显著较低。倍半琥珀酸盐晶型1在10nm的浓度下显著增加胞外pgrn的水平(图26b)。
[0290]
与这些结果一致，可得出结论，倍半琥珀酸盐晶型1能够a)是神经保护性的，b)保护神经突触网络，b)减少tau的超磷酸化，d)减轻小胶质细胞活化并因此减轻神经炎症，以及e)促进培养细胞上清液中颗粒蛋白前体神经营养因子的释放。因此，本发明的琥珀酸盐可用于治疗神经退行性疾病，特别是tau蛋白病和帕金森病。
[0291]
对mpp
+
或鱼藤酮损伤的中脑神经元的作用
[0292]
中脑神经元培养
[0293]
如visanji et al.in faseb j.2008,22(7):2488-2497以及callizot etal.,in plosone 2019:https://doi.org/10.1371/journal.pone.0215277所述培养大鼠多巴胺能神经元。简言之，使用具有co2室的深度麻醉和颈脱位处死妊娠15天的妊娠雌性大鼠(wistar)。在显微镜下解剖从15天大的大鼠胚胎获得的中脑(janvier,france)。取出胚胎中脑并置于含有2％青霉素-链霉素(ps)和1％ bsa的leibovitz(l15)冰冷培养基中。将中脑弯曲的腹侧部分，即富含多巴胺能神经元的发育中脑的区域用于细胞制备。通过在37℃下胰蛋白酶消化20分钟(最终浓度为0.05％胰蛋白酶和0.02％ edta的溶液)来解离中脑。通过加入含有ii级dnase i(0.5mg/ml)和10％ fcs的dmem终止反应。然后，通过10ml移液管机械分离细胞3次。然后，将细胞在+4℃下在l15培养基中的bsa(3.5％)层上以180xg离心10min。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于由补充有b27(2％)，l-谷氨酰胺(2mm)和2％ ps溶液以及10ng/ml bdnf和1ng/ml神经胶质衍生的神经营养因子(gdnf)的neurobasal组成的确
定成分培养基中。在neubauer细胞计数器中使用台盼蓝排除试验计数活细胞。将细胞以40,000个细胞/孔的密度接种在96孔板(用聚-l-赖氨酸预包被)中，并在37℃，5％ co2/95％空气气氛中保持在加湿培养箱中。每2天用新鲜培养基更换一半培养基。
[0294]
对于96孔板，仅使用60个孔。不使用第一和最后一行和列的孔(以避免任何边缘效应)，并填入无菌水。
[0295]
测试化合物和线粒体应力
[0296]
介质：培养基(0.1％ pbs)。
[0297]
预处理：在第4天，将倍半琥珀酸盐晶型1溶解在培养基中并加入到培养物中48小时。
[0298]
mpp
+
损伤：在孵育倍半琥珀酸盐晶型1后的第6天和第48小时或孵育后立即，添加mpp+至终浓度为4μm，在仍存在化合物的对照培养基中稀释48小时。
[0299]
鱼藤酮损伤：在孵育倍半琥珀酸盐晶型1后的第6天和第48小时或孵育后立即，添加鱼藤酮至终浓度为4μm，在仍存在化合物的对照培养基中稀释24小时。
[0300]
免疫染色
[0301]
损伤后(24小时或48小时)，除去细胞培养上清液，并在室温下用4％多聚甲醛的pbs溶液(ph＝7.3)固定细胞20分钟。将细胞在pbs中洗涤两次。在室温下用含有0.1％皂苷和1％ fcs的pbs溶液进行细胞膜透化和非特异性结合位点的封闭15分钟。然后，将细胞与以下物质一起孵育：
[0302]
a)对于酪氨酸羟化酶(th)：小鼠中产生的单克隆抗-th抗体在含有1％ fcs，0.1％皂苷的pbs中稀释1/10000，室温下2小时。
[0303]
b)对于α突触核蛋白(α-syn)：兔中产生的多克隆抗-α-syn抗体在含有1％fcs，0.1％皂苷的pbs中稀释1/200，室温下2小时。
[0304]
用alexa fluor 488山羊抗小鼠igg和alexa fluor 568山羊抗兔igg，两者都在含有1％ fcs，0.1％皂苷的pbs中1/400稀释，在室温下暴露一抗1小时。用hoechst染料(1/1000)标记细胞核。
[0305]
对于每种条件，使用(molecular devices)以10x放大率使用相同的采集参数自动拍摄20张照片(代表整个孔面积)。根据图像，通过(molecular devices)自动进行分析。
[0306]
研究了以下读数：
[0307]-神经元存活：th神经元的总数(th染色)，
[0308]-神经突触网络：th阳性神经元的神经突触网络总长度(μm)-α-syn积聚(th和α-syn染色之间的重叠面积，μm2)
[0309]
统计分析
[0310]
结果以对照的百分比表示。所有值显示每种条件4-6个孔的平均值+/-sem(平均值的标准误差)。使用graphpad prism软件版本7.04对不同条件(anova，随后fisher lsd检验)和图进行统计分析。p《0.05被认为是显著的。
[0311]
结果
[0312]
倍半琥珀酸盐晶型1对mpp
+
损伤的th(+)神经元的作用
[0313]
神经元存活：与对照组相比，用mpp
+
损伤显著降低多巴胺能(th阳性)神经元的存活。倍半琥珀酸盐晶型1在50nm剂量下具有神经保护作用(图27a)。
[0314]
神经突触网络：mpp
+
损伤后神经突触网络总长度显著减少。使用50nm剂量的倍半琥珀酸盐晶型1显著改善了神经突触网络的完整性(图27b)。
[0315]
α-syn积聚：在应用mpp
+
时，在多巴胺能神经元中观察到α-syn积聚的显著增加。在所有测试浓度下，倍半琥珀酸盐晶型1预孵育后，这种积聚显著减少。与50或100nm倍半琥珀酸盐晶型1同时孵育显著减少α-syn积聚(图27c)。
[0316]
倍半琥珀酸盐晶型1对鱼藤酮损伤的th(+)神经元的作用
[0317]
神经元存活：与对照组相比，用鱼藤酮损伤诱导多巴胺能神经元的显著损失。当预孵育时，倍半琥珀酸盐晶型1在10和50nm的剂量下具有显著的神经保护作用。然而，当直接与鱼藤酮一起施用时，在所有浓度下都显著增加神经元存活(图28a)。
[0318]
神经突触网络：鱼藤酮损伤后神经突触网络的完整性显著降低。在10-100nm的所有剂量下，用倍半琥珀酸盐晶型1预处理和共处理均显著改善神经突触网络(图28b)。
[0319]
α-syn积聚：鱼藤酮显著增加多巴胺能神经元中α-syn的积聚。当将倍半琥珀酸盐晶型1与鱼藤酮(10-100nm)一起预孵育或直接施用时，病理性积聚显著减少。值得注意的是，当共同施用100nm倍半琥珀酸盐晶型1时，阻止了α-syn的积聚(图28c)。