胚胎孪生化方法与流程

本发明一般涉及通过连续增殖周期(例如，通过执行三轮或更多轮增殖)从一个或多个供体胚胎生产多个胚胎的方法，以及这种方法在动物育种中的应用。本发明还涉及从供体胚胎产生多个单合子胚胎的方法，所述供体胚胎包含在发育上等同于来自16细胞胚胎或预致密桑椹胚的胚胎细胞的胚胎细胞。

背景技术：

1、辅助生殖技术(art)已经取得了巨大的进步，特别是在过去的几十年中。人工授精(ai)仍然是在牛群中获得遗传增益的最(成本)有效的方法，并广泛应用于乳制品行业。在这方面，全球市场对于冷冻精液和胚胎仍然是强有力的，其中数百万的牛由ai繁殖，每年全世界转移超过一百万个胚胎。乳制品行业中为人工授精提供精液的大多数顶级父系都来自胚胎移植(et)，控制发情周期和排卵的方法的改进导致了人工授精、供体奶牛的超排卵和et受体的管理更加有效。尽管这些技术在art中有所进步，但由于生产每一个胚胎的相关费用，生产商对多次排卵和胚胎移植(moet)等生殖技术的吸收仍然有限。与常规ai不同，moet因此不可能被生产者用作常规繁殖方法。

2、最近，已经报道了通过胚胎分割以及从卵裂期胚胎分离出的卵裂球来生产遗传上相同的单卵双胞胎的方法。虽然art“工具箱”的这种新的增加是令人兴奋的，并且将使生产者能够更有效地捕获和选择雌性(母畜)遗传学(除了种系遗传学之外)，但是在商业水平上广泛采用胚胎孪生，如其他基于et和ivf的方法，可能受到生产者的高昂成本以及与技术规模相关的挑战的阻碍。

3、因此，需要改进的胚胎增殖方法来解决这些限制中的一个或多个并帮助工业摄取。

技术实现思路

1、本发明广泛地涉及从一个或多个供体胚胎产生多个胚胎的方法。在这点上，本发明人首次表明，包含至少2个胚胎细胞的牛供体胚胎可以在将所得胚胎扩增到囊胚阶段之前通过≥3个连续的增殖轮进行增殖。在这样做的过程中，本发明人已经表明，使用本文所述的连续增殖方法从初始供体胚胎中恢复囊胚的效率显著高于(例如，高达6倍)如果初始完整供体胚胎直接培养至囊胚。

2、本发明人还首次表明，包含一个或多个胚胎细胞的牛胚胎可用作供体胚胎以产生多个单合子胚胎，所述胚胎细胞在发育上等同于来自16细胞胚胎或预致密桑椹胚的胚胎细胞，包括当使用本文所述的连续增殖步骤以进一步增殖胚胎时。从这些更发育的供体胚胎开始，所述供体胚胎通常包含发育上等同于来自8-，16-，32-和64-细胞胚胎的细胞的卵裂球的异种混合物，本发明人已经表明，使用本文所述的增殖方法回收囊胚的效率显著高于(例如，当使用连续增殖时高达10倍)最初完整的供体胚胎被简单地直接培养到囊胚。

3、在一个示例中，本发明提供了一种增殖一个或多个供体胚胎的方法，所述方法包括：

4、(i)获得包含至少两个胚胎细胞的一个或多个供体胚胎；

5、(ii)从一个或多个供体胚胎中分离所述胚胎细胞的一个或多个；

6、(iii)在适于产生多个胚胎的条件下体外扩增所述胚胎细胞，每个包含至少两个胚胎细胞；

7、(iv)分离在(iii)中产生的所述多个胚胎中的一个或多个以在随后的增殖中用作供体胚胎；以及

8、(v)重复步骤(i)-(iv)‘n’次，其中‘n’为≥3。

9、在另一个实施例中，本发明提供了一种繁殖供体胚胎的方法，所述方法包括：

10、(i)获得包含一个或多个胚胎细胞的供体胚胎，所述胚胎细胞在发育上等同于来自16细胞胚胎或预致密桑椹胚的胚胎细胞；

11、(ii)从所述供体胚胎中分离一个或多个胚胎细胞；

12、(iii)在适于从所述供体胚胎产生多个单合子胚胎的条件下体外扩增所述胚胎细胞；以及

13、(iv)在适于产生多个单合子囊胚的条件下培养所述多个单合子胚胎。

14、在培养所述多个纯合胚胎以产生所述多个囊胚的步骤之前，所述方法还可包括以下步骤：

15、(i)分离产生的多个单合子胚胎中的一个或多个以在随后的增殖中用作供体胚胎，其中分离用于随后的增殖的每个供体胚胎包含至少两个胚胎细胞；

16、(ii)从一个或多个供体胚胎中分离所述胚胎细胞的一个或多个；

17、(iii)在适于产生多个胚胎的条件下体外扩增所述胚胎细胞，每个包含至少两个胚胎细胞；

18、(iv)分离在(iii)中产生的所述多个胚胎中的一个或多个以在随后的增殖中用作供体胚胎；以及

19、(v)在适于产生多个囊胚的条件下培养所述多个胚胎之前，重复步骤(i)-(iv)‘n’次。

20、在一个实施例中，从每个供体胚胎分离一个或多个胚胎细胞是通过将供体胚胎分成两个或更多个部分来实现的，每个部分(或半胚胎)包含一个或多个胚胎细胞。在一个实施例中，至少一个供体胚胎可以分成两个部分。在一个实施例中，至少一个供体胚胎可以分成三个部分。在一个实施例中，至少一个供体胚胎可以分成四个部分。在一个实施例中，至少一个供体胚胎可以分成五个或更多个部分。

21、在上述每个实施例中，可以用显微外科器械切开或切割供体胚胎。例如，可以使用刀片(例如，解剖刀片或其部分)、细玻璃针或激光(例如，激光辅助活检)，通过显微切割来切开或切割供体胚胎。在其他实施例中，可以通过纳米切割(例如，使用飞秒激光脉冲或具有纳米尺度的原子力显微镜(afm))来切开或切割供体胚胎。

22、在另一个实施例中，从每个供体胚胎中分离一个或多个胚胎细胞是通过破坏透明带(zp)，并从供体胚胎中分离一个或多个胚胎细胞来实现的。这在本文中称为“解拉锁”或“解拉锁方法”。根据该实施例，可以破坏zp并从一个或多个供体胚胎中分离一个或多个胚胎细胞。在一个实施例中，zp被酶或机械破坏。例如，可以用酶或机械方法破坏zp，用微量移液管从所述一个或多个供体胚胎中吸出所述一个或多个胚胎细胞，从而分离所述胚胎细胞。

23、除非另有说明，否则‘n’为≥1。例如，‘n’可以是≥2。例如，‘n’可以是≥3。根据其中‘n’是≥3的示例，‘n’可以是≥4。例如，‘n’可以是≥5。例如，‘n’可以等于6、或7或8或9或10或更大。

24、在一个实施例中，通过本发明的方法产生16个或更多个单合子胚胎。在一个实施例中，通过本发明的方法产生32个或更多个单合子胚胎。在一个实施例中，通过本发明的方法产生64个或更多个单合子胚胎。在一个实施例中，通过本发明的方法产生128个或更多个单合子胚胎。在一个实施例中，通过本发明的方法产生256个或更多个单合子胚胎。在一个实施例中，通过本发明的方法产生512个或更多个单合子胚胎。

25、在一个实施例中，胚胎细胞或包含它们的胚胎可以在一种或多种能够促进胚胎发生的因子存在下培养。例如，胚胎细胞可以在一种或多种能够促进胚胎发生的因子存在下培养，以形成和扩增单卵合胚胎，例如用于收获。

26、在另一个实施例中，胚胎细胞或包含它们的胚胎可以在一种或多种能够促进全能性和/或抑制或防止胚胎发生的因子存在下培养。例如，胚胎细胞或包含它们的胚胎可以在一种或多种能够促进母体mrna清除的因子存在下培养。

27、除非另有说明，该供体胚胎或每个供体胚胎包含约2至约300个胚胎细胞，例如约2至约256个胚胎细胞或约2至约64个胚胎细胞，条件是还没有发生致密。例如，该供体胚胎或每个供体胚胎可包含约100至约256个胚胎细胞，条件是尚未发生致密。例如，该供体胚胎或每个供体胚胎可包含约64至约128个胚胎细胞，条件是尚未发生致密。例如，该供体胚胎或每个供体胚胎可包含约32至约64个胚胎细胞，条件是尚未发生致密。例如，该供体胚胎或每个供体胚胎可包含约16至约32个胚胎细胞，条件是尚未发生致密。例如，该供体胚胎或每个供体胚胎可包含约2至约32个胚胎细胞，条件是尚未发生致密。例如，该供体胚胎或每个供体胚胎可包含约2至约16个胚胎细胞，条件是尚未发生致密。例如，该供体胚胎或每个供体胚胎可包含约2至约8个胚胎细胞。

28、根据供体胚胎包含一个或多个胚胎细胞的实施例，胚胎细胞在发育上等同于来自16细胞胚胎或预致密桑椹胚的胚胎细胞，供体胚胎可包含约12至约32个尚未致密的胚胎细胞。根据该实施例，供体胚胎可包含一个或多个发育上等同于来自8-细胞胚胎的胚胎细胞的胚胎细胞、一个或多个发育上等同于来自16-细胞胚胎的胚胎细胞的胚胎细胞、一个或多个发育上等同于来自32-细胞胚胎的胚胎细胞的胚胎细胞、和/或一个或多个发育上等同于来自64-细胞胚胎的胚胎细胞的胚胎细胞。

29、在上述每个实施例中，供体胚胎可以从脊椎动物获得。

30、在一个实施例中，脊椎动物可以是哺乳动物物种。

31、在一个实施例中，哺乳动物物种可以是家畜物种。例如，家畜物种可以是牛物种。例如，家畜物种可以是绵羊物种(即绵羊)。例如，家畜物种可以是猪物种(即猪)。例如，家畜物种可以是马物种(即，马)。例如，家畜物种可以是山羊物种(即山羊)。例如，牲畜物种可以是鹿物种(即鹿)。例如，家畜物种可以是骆驼物种(例如，骆驼或羊驼)。

32、在一些实施例中，在步骤(i)中获得的供体胚胎中的一个或多个是通过体内受精产生的。在其他实施例中，在步骤(i)中获得的供体胚胎中的一个或多个是通过体外受精(ivf)产生的。

33、在一些实施例中，在步骤(i)获得的一个或多个供体胚胎是新鲜的。在其他实施例中，在步骤(i)获得的一个或多个供体胚胎已经被冷冻保存。例如，供体胚胎可以解冻。

34、在每个前述实施例中，所述方法进一步可以包括基于一个或多个遗传筛选标准、遗传诊断和/或一个或多个形态学标准选择在步骤(i)获得的一个或多个供体胚胎。例如，选择步骤可以在步骤(i)之前执行。

35、在一个实施例中，遗传筛选标准可以通过筛选一个或多个供体胚胎与感兴趣性状相关的一个或多个遗传标记(例如snp等位基因或单倍型)的存在与否来确定。在一个实施例中，感兴趣的性状选自表型生产性状、药物抗性、对害虫和/或寄生虫的易感性、和性别(即，确定胚胎是雄性还是雌性)。

36、在一个实施例中，一个或多个供体胚胎可以基于多种病症、疾病或其素质的遗传诊断来选择。

37、在一个实施例中，可以基于指示胚胎健康的一个或多个形态特征来选择一个或多个供体胚胎。

38、在上述每个实施例中，一个或多个供体胚胎可以是遗传修饰的。例如，一个或多个供体胚胎可以通过将外源核酸导入其中包含的胚胎细胞的基因组而被遗传修饰。例如，一个或多个供体胚胎可以通过编辑其中包含的胚胎细胞的基因组进行遗传修饰。

39、在一个实施例中，一个或多个供体胚胎包含独特的遗传标记或核酸标识符，用于追踪由其产生的胚胎和/或由所述胚胎产生的动物。例如，可以使用遗传修饰引入独特的遗传标记或核酸标识符。

40、在前述实施例的每一个中，方法包括多个胚胎以形成囊胚。例如，方法可包括体外扩增胚胎以形成准备植入的成熟囊胚。

41、方法可以进一步包括收获通过该方法产生的多个胚胎。例如，方法可以包括一旦胚胎成熟到囊胚期就收获胚胎。

42、在一些实施例中，将一个或多个收获的胚胎保存在胚胎保存培养基中。例如，一个或多个收获的胚胎可以储存在约4℃。

43、在一些实施例中，冷冻保存一个或多个收获的胚胎。冷藏胚胎可在约-180℃至约-196℃下储存。例如，冷藏的胚胎可以在约-196℃储存在液氮中。

44、在一些实施例中，本发明的方法还包括将通过所述方法产生的一个或多个胚胎转移到一个或多个受体雌性动物的输卵管。

45、本发明还提供了通过本发明的方法产生的一个或多个胚胎。在一个实施例中，一个或多个胚胎可以在大约4℃的胚胎贮存或转移培养基中提供。在另一个实施例中，一个或多个胚胎可以是冷藏的。

46、在一个实施例中，胚胎来自哺乳动物物种(例如，非哺乳动物物种)。在一个实施例中，非人哺乳动物物种是家畜物种。例如，家畜物种可以是牛物种。例如，家畜物种可以是绵羊物种(即绵羊)。例如，家畜物种可以是猪物种(即猪)。例如，家畜物种可以是马物种(即，马)。例如，家畜物种可以是山羊物种(即山羊)。例如，牲畜物种可以是鹿科物种(即鹿)。例如，牲畜物种可以是骆驼科物种(例如骆驼或羊驼)。

47、本发明还提供了一种繁殖动物的方法，包括：

48、(i)将通过本发明的方法产生的一个或多个胚胎转移到一个或多个受体雌性动物的输卵管以建立妊娠；

49、(ii)通过分娩从所述怀孕受体雌性产生所述动物。

50、在一个实施例中，这种动物是脊椎动物。例如，脊椎动物可以是哺乳动物、两栖动物、爬行动物、鱼或鸟。

51、在一个具体实施例中，动物是哺乳动物，例如非人哺乳动物。可以使用该方法生产的示例性非人哺乳动物包括家畜物种(例如，牛、水牛、猪、绵羊、山羊、骆驼、鹿、马等)，伴侣动物(例如，狗、猫等)，实验室动物(例如，大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、兔等)，非人灵长类(猕猴和狨猴等)和野生物种(例如，有袋类动物、猫、犀牛、大熊猫等)。在一个具体实施例中，本发明的方法可以用于繁殖牛。在另一个实施例中，本发明的方法可用于繁殖绵羊。在另一个实施例中，本发明的方法可用于繁殖猪。在另一个实施例中，本发明的方法可用于繁殖山羊。在另一个实施例中，本发明的方法可用于繁殖马。