多路复用COVID-19锁式测定的制作方法

背景技术：

1、covid-19疫情凸显了当前基于pcr的分子诊断测试能力的缺点。除了许多基于pcr的测试缺乏精确性和不可接受的假阳性率/假阴性率之外，现有测定的关键缺点是无法快速且成本有效地将测试规模化至传染病的群体水平监测。这些缺点主要是由于单个测定产生的信息量有限，单个测定通常限于仅测试几个样品复制品，因此不足以产生高精确性测试结果。另外，所用的(主要基于pcr的)分子诊断技术当前无法适用于大规模样品多路复用。因此，仍需要一种也与大规模多路复用策略兼容的成本有效的方法来增加每个测定的样品复制测试数。

2、本公开涉及用于解决当前分子诊断测试能力在涉及传染病的群体规模监测时的缺点的组合物、方法和系统。

技术实现思路

1、本文公开的方面提供了用于核酸检测的方法，所述方法包括：(a)使获自样品的核酸序列与包括远端和近端的核酸探针分子在足以使所述核酸探针分子的所述远端和所述核酸探针分子的所述近端与所述核酸序列偶联的条件下接触，从而形成环状核酸探针分子；以及(b)通过鉴定所述环状核酸探针分子的序列来检测所述核酸序列的存在，其中所述检测包括在聚合酶的存在下在(i)所述环状核酸探针分子或其衍生物与(ii)包括可检测标记的核苷酸部分之间进行核苷酸结合反应，其中所述核苷酸结合反应在所述核苷酸部分未掺入所述环状核酸探针分子或其衍生物中的情况下进行。在一些实施方案中，所述环状核酸探针分子在其序列中包括缺口(gap)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述核酸探针分子与聚合酶在足以进行延伸反应的条件下接触，从而用所述核酸序列的一部分的拷贝填补所述缺口。在一些实施方案中，(b)中鉴定的所述环状核酸探针分子的所述序列包括所述核酸序列的所述部分。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述延伸反应后，使所述核酸探针分子与连接酶在足以将所述核酸探针分子的所述远端连接至所述核酸探针分子的所述近端的条件下接触。在一些实施方案中，所述缺口的长度包括1至200个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述核酸探针分子与连接酶在足以将所述核酸探针分子的所述远端连接至所述核酸探针分子的所述近端的条件下接触，从而形成所述环状核酸探针分子。在一些实施方案中，所述核酸探针分子在未杂交时是线性的。在一些实施方案中，(b)中鉴定的所述环状核酸探针分子的所述核酸序列包括条形码序列，该条形码序列在被鉴定时独特地鉴定所述核酸序列的所述存在。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：(c)重复(a)至(b)，以鉴定样品中多个所述环状核酸探针分子的多个所述核酸序列；以及(d)对(c)中鉴定到所述多个所述核酸序列中的每个所述核酸序列的次数进行计数。在一些实施方案中，所述方法进一步包括确定所述样品中所述核酸序列的拷贝数，其中所述样品中所述核酸序列的所述拷贝数与(d)中计数到所述每个所述核酸序列的所述次数成比例。在一些实施方案中，所述方法进一步包括多路复用所述方法，包括：(c)重复(a)至(b)，以鉴定所述样品中多个所述环状核酸探针分子的多个所述核酸序列，其中所述多个所述环状核酸探针分子的第一子集不同于所述多个所述环状核酸分子的第二子集；以及(d)对(c)中鉴定到所述第一子集的第一核酸序列和所述第二子集的第二核酸序列的次数进行计数。在一些实施方案中，所述多个所述环状核酸探针分子的所述第一子集与所述多个所述环状核酸分子的所述第二子集的不同之处在于：(i)所述第一子集包括与所述第二子集不同的条形码序列；(ii)所述第一子集包括与所述第二子集不同的远端或近端；或(iii)(i)和(ii)的组合。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测所述样品中第二核酸序列的存在，包括：(c)使所述样品中的所述第二核酸序列与第二核酸探针分子在足以使所述第二核酸序列与所述第二核酸探针分子偶联的条件下接触，从而形成第二环状核酸探针分子；以及(d)使所述第二环状核酸探针分子或其衍生物与(i)第二聚合酶和(ii)包括第二可检测标记的第二核苷酸部分在足以引起所述第二环状核酸探针分子或其衍生物与所述第二核苷酸部分之间发生第二核苷酸结合反应的条件下、在所述第二核苷酸部分未掺入所述第二环状核酸探针分子或其衍生物中的情况下接触，其中所述第二核酸序列不同于(b)中检测到的所述核酸序列。在一些实施方案中，所述方法进一步包括扩增所述环状核酸探针分子，以产生所述其衍生物。在一些实施方案中，所述扩增包括进行滚环扩增。在一些实施方案中，所述核苷酸部分与聚合物-核苷酸组合物中的聚合物核偶联，形成聚合物-核苷酸缀合物。在一些实施方案中，所述可检测标记与所述聚合物-核苷酸组合物的所述聚合物核偶联。在一些实施方案中，所述核苷酸结合反应包括所述核苷酸部分中的两个或更多个与所述核酸序列的两个或更多个拷贝之间的两个或更多个结合事件。在一些实施方案中，所述可检测标记包括荧光标记。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测来源于第二样品的第二核酸序列的存在，包括：(c)使所述第二样品中的所述第二核酸序列与第二核酸探针分子在足以使所述第二核酸序列与所述第二核酸探针分子偶联的条件下接触，从而形成第二环状核酸探针分子；以及(d)使所述第二环状核酸探针分子或其衍生物与(i)第二聚合酶和(ii)包括第二可检测标记的第二核苷酸部分在足以引起所述第二环状核酸探针分子或其衍生物与所述第二核苷酸部分之间发生第二核苷酸结合反应的条件下、在所述第二核苷酸部分未掺入所述第二环状核酸探针分子或其衍生物中的情况下接触，其中所述第二核酸序列不同于(b)中检测到的所述核酸序列，从而检测所述第二样品中所述第二核酸序列的存在。在一些实施方案中，所述第二样品获自与所述样品不同的来源。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过所述核酸序列和所述第二核酸序列的病原体来源追踪病原体感染，其中所述追踪包括将收集所述样品的第一位置或第一时间与收集所述第二样品的第二位置或第二时间进行比较。根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述样品获自包括以下项的来源：(i)土壤；(ii)污水；(iii)生物组织；(iv)食品；(v)与(i)至(iv)中的一个或多个接触的物体表面；或(vi)(i)至(v)的任何组合。

2、本文公开的方面提供了用于核酸检测的系统，所述系统包括：一个或多个计算机处理器，其单独地或共同地经编程以实施方法，包括：(a)使核酸序列与核酸探针分子在足以引起(i)所述核酸探针分子的近端与所述核酸序列的第一部分偶联和(ii)所述核酸探针分子的远端与所述核酸序列的第二部分偶联的条件下接触，从而形成环状核酸探针分子；以及(b)使所述环状核酸探针分子或其衍生物与(i)聚合酶和(ii)包括可检测标记的核苷酸部分在足以引起所述环状核酸探针分子或其衍生物与所述核苷酸部分之间发生核苷酸结合反应的条件下、在所述核苷酸部分未掺入所述环状核酸探针分子或其衍生物中的情况下接触。在一些实施方案中，所述系统进一步包括所述核酸探针分子，其中所述核酸探针分子包括(i)包括与所述核酸序列的所述第一部分互补的第一核酸序列的所述近端和(ii)包括与所述核酸序列的所述第二部分互补的第二核酸序列的所述远端。在一些实施方案中，所述系统进一步包括具有表面的基底，该表面包括与其偶联的聚合物层，其中所述环状核酸探针分子与所述聚合物层偶联。在一些实施方案中，所述聚合物层包括亲水性聚合物。在一些实施方案中，所述亲水性聚合物包括聚(乙二醇)(peg)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(pvp)、聚(丙烯酸)(paa)、聚丙烯酰胺、聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipam)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pma)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙基酯)(phema)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(poegma)、聚谷氨酸(pga)、聚赖氨酸、聚葡糖苷、链霉亲和素、葡聚糖或其任何组合。在一些实施方案中，所述表面包括流动池的两个或更多个内表面。在一些实施方案中，所述系统进一步包括连接酶或其催化活性片段，所述连接酶或其催化活性片段配置为连接所述核酸探针分子的所述近端和所述核酸探针分子的所述远端，以形成所述环状核酸探针分子。在一些实施方案中，所述环状核酸探针分子在其核酸序列中包括缺口。在一些实施方案中，所述系统进一步包括聚合酶，其配置为进行所述环状核酸探针分子的延伸反应，从而填补所述缺口。在一些实施方案中，所述缺口用所述核酸序列的第三部分的拷贝填补。在一些实施方案中，所述缺口的长度包括1至200个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸探针分子在未杂交时是线性的。在一些实施方案中，所述方法进一步包括重复(a)和(b)，以鉴定所述环状核酸探针分子或其衍生物的序列，其中所述序列包括独特地鉴定所述序列的条形码序列。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：(c)重复(a)至(b)，以鉴定所述样品中多个所述环状核酸探针分子的多个所述核酸序列；以及(d)对(c)中鉴定到所述多个所述环状核酸探针分子的所述多个所述序列中的每个序列的次数进行计数。在一些实施方案中，所述系统进一步包括多个所述环状核酸探针分子，其包括所述多个所述环状核酸探针分子的第一子集和所述多个所述环状核酸探针分子的第二子集，其中所述第一子集不同于所述第二子集。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：(c)重复(a)至(b)，以鉴定所述样品中多个所述环状核酸探针分子的多个所述核酸序列；以及(d)对(c)中鉴定到所述第一子集的第一序列和所述第二子集的第二序列的次数进行计数。根据权利要求39或权利要求40所述的系统，所述多个所述环状核酸探针分子的所述第一子集与所述多个所述环状核酸探针分子的所述第二子集的不同之处在于：(i)所述第一子集包括与所述第二子集不同的条形码序列；(ii)所述第一子集包括与所述第二子集不同的远端或近端；或(iii)(i)和(ii)的组合。在一些实施方案中，所述系统进一步包括第二核酸探针分子，其中所述第二核酸探针分子配置为与不同于所述核酸序列的第二核酸序列偶联。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测所述样品中所述第二核酸的存在，包括：(c)使所述样品中的所述第二核酸序列与所述第二核酸探针分子在足以使所述第二核酸序列与所述第二核酸探针分子偶联的条件下接触，从而形成第二环状核酸探针分子；以及(b)使所述第二环状核酸探针分子或其衍生物与(i)第二聚合酶和(ii)包括第二可检测标记的所述第二核苷酸部分在足以引起所述第二环状核酸探针分子或其衍生物和第二核苷酸部分之间发生第二核苷酸结合反应的条件下、在所述第二核苷酸部分未掺入所述第二环状核酸探针分子或其衍生物中的情况下接触。在一些实施方案中，所述核苷酸部分与聚合物-核苷酸组合物中的聚合物核偶联。在一些实施方案中，所述可检测标记与所述聚合物-核苷酸组合物中的所述聚合物核偶联，形成聚合物-核苷酸缀合物。在一些实施方案中，所述核苷酸结合反应包括所述核苷酸部分中的两个或更多个与所述核酸序列的两个或更多个拷贝之间的两个或更多个结合事件。在一些实施方案中，所述可检测标记包括荧光标记。在一些实施方案中，所述核酸序列获自包括以下项的样品：(i)土壤；(ii)污水；(iii)生物组织；(iv)食品；(v)与(i)至(iv)中的一个或多个接触的物体表面；或(vi)(i)至(v)的任何组合。

3、援引并入

4、在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用以其整体并入。在本文中的术语与并入的参考文献中的术语之间存在冲突的情况下，以本文中的术语为准。