酵母属酵母细胞及使用其的发酵方法与流程

本发明涉及一种具有产生所需发酵产物的能力的酵母细胞；以及一种用于产生发酵产物的方法，其中在所述方法中使用所述酵母细胞。

背景技术：

1、基于酵母的发酵方法应用于从传统且可再生的碳水化合物原料工业化生产范围广泛且迅速扩大的化合物。

2、特别是在厌氧发酵方法中，辅因子对nadh/nad+的氧化还原平衡可导致产物产率的重大挑战。例如，与基于酵母的乙醇生产的化学计量有关的主要挑战是，大量的甘油总是形成副产物。据估计，在典型的工业乙醇工艺中，高达约4重量％的糖原料转化为甘油(nissen等人yeast 16(2000)463-474)。

3、厌氧条件下的甘油生产主要与酵母细胞中的氧化还原平衡机制有关。在酿酒酵母(s.cerevisiae)的厌氧生长期间，糖异化经由所谓的乙醇发酵发生。经由nad+依赖性糖酵解甘油醛-3-磷酸脱氢酶反应形成的nadh通过经由nadh依赖性醇脱氢酶将通过丙酮酸脱羧形成的乙醛转换为乙醇而被再氧化的。当在代谢中的其他地方发生nad+至nadh的净还原时，该氧化还原-中性异化途径的固定化学计量引起问题。在厌氧条件下，在这种情况下，酿酒酵母中的nadh再氧化严格依赖于将糖还原为甘油。甘油形成是通过将糖酵解中间体磷酸二羟丙酮(dhap)还原成甘油3-磷酸(甘油-3p)而引发的，该还原是由nadh依赖性甘油3-磷酸脱氢酶催化的反应。随后，在这个反应中形成的甘油3-磷酸被甘油-3-磷酸酶水解，以产生甘油。因此，甘油是通过酿酒酵母厌氧生产乙醇期间的主要副产物。甘油的产生是非期望的，因为其降低了糖向所需发酵产物(例如乙醇)的总转换率。此外，发酵设施的流出物中存在甘油可增加废水处理的成本。

4、氮是酵母细胞的关键营养物。如由linder在他的关于芽殖酵母中氮同化途径的第7章中、在由sibirney编辑，由springer nature switzerland ag(2019)出版的手册“non-conventional yeasts:from basic research to application”，第197页及下文中所述，氨(nh3)是用作芽殖酵母氮源的最简单的氮底物之一。

5、根据linder的说法，酵母中用于含氮生物分子的绝大多数生物合成途径首先需要将氨转换为l-谷氨酸和l-谷氨酰胺，然后将所述l-谷氨酸和l-谷氨酰胺用作下游合成代谢转氨反应中的氨基供体。酶nadp+依赖性谷氨酸脱氢酶(ec 1.4.1.4；由gdh1基因编码)催化将α-酮戊二酸胺化以形成l-谷氨酸，而酶谷氨酰胺合酶(ec 6.3.1.2；由gln1基因编码)催化将l-谷氨酸胺化以形成l-谷氨酰胺。gdh1基因的第二拷贝(被称为gdh3)已在酿酒酵母中描述，并且似乎在氮代谢中发挥独特的生理作用。

6、根据linder的说法，同化除氨以外的无机氮源的能力被认为在芽殖酵母中很罕见。据说硝酸根(no3–)通过经由亚硝酸根(no2–)的两步还原被同化以产生氨。将硝酸根还原成亚硝酸根据说是通过酶硝酸还原酶(ec 1.7.1.2/ec 1.7.1.3)完成的，所述硝酸还原酶由ynr1基因编码。linder指出，除了存在黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)和血红素辅基外，硝酸还原酶也是芽殖酵母中目前已知的为数不多的需要钼辅因子(moco)才能发挥其活性的酶之一。linder解释说，酵母硝酸还原酶的氧化还原辅因子需求似乎因物种而异。食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(blastobotrys adennivorans)(毛红曲霉科(trichomonascaceae))中的硝酸还原酶被认为对nadph有特异性，而博伊丁假丝酵母(candida boidinii)(毕赤酵母科(pichiaceae))、杰丁塞伯林德纳氏酵母(cyberlindnera jadinii)(法夫酵母科(phaffomycetaceae))和多形汉逊酵母(ogataea polymorpha)(毕赤酵母科)的硝酸还原酶被认为能够使用nadh和nadph两者。据说亚硝酸盐被含有fad的酶，亚硝酸还原酶(ec1.7.1.4)进一步还原为氨，所述酶由yni1基因编码。芽殖酵母亚硝酸还原酶的氧化还原辅因子特异性由linder指出尚未以全面方式进行研究。

7、同样在siverio的在fems microbiology reviews第26卷(2002)第277-284页上发表的标题为“assimilation of nitrate by yeasts”，文章中，提到酵母能够使用多种化合物作为氮源。然而，硝酸根和亚硝酸根的使用局限于不同属的相对少数物种。提到酵母(saccharomyces)属和裂殖酵母属(schizosaccharomyces)的酵母不能使用硝酸根或亚硝酸根作为唯一的氮源。siverio所研究的酵母多形汉逊酵母(现更名为安格斯毕赤酵母(pichia angusta))被发现确实包含硝酸还原酶活性。

8、正如上面由linder所指出的，氨是用于酵母培养的优选氮源。尿素可以是廉价的氨源。尿素可容易地分解成两分子的铵离子和一分子的二氧化碳。然而，如ingledew等人在其发表在american journal of enology and viticulture,(1987),第38卷，第332-335页的文章中所指示，许多国家现已禁止将尿素用作用于饮用酒精制造的酵母食物成分，因为尿素会导致产生少量氨基甲酸乙酯(urethane/ethyl carbamate)，氨基甲酸乙酯是食物中的疑似致癌物。yoa等人在其发表在j.agric.food chem.(2020),第68卷,10984-10991中的题为“quantitative analysis of ethyl carbamate in distillers grains coproductsand bovine plasma by gas chromatography-mass spectrometry”的文章中已经开发了气相色谱-质谱测定来量化从各种酒糟副产物中提取的氨基甲酸乙酯(缩写为ec，被称为第2a组可能的人类致癌物)，并且发现玉米浓缩蒸馏物的可溶物含有范围为1618ng/g至2956ng/g的最高浓度的氨基甲酸乙酯。其他类型的酒糟副产物中的氨基甲酸乙酯的浓度为17ng/g至917ng/g不等。发现饲喂占总饲料(在饲喂时)19-38％的酒糟副产物的家牛在血浆中含有2-3ng/ml的氨基甲酸乙酯。

9、wo2013/076144a2描述了一种为生产2,3-丁二醇(bdo)而工程化的重组微生物。该专利公布描述2,3-丁二醇是通过酵母进行的醇发酵的副产物，并且通常是葡萄酒中最丰富的次要成分之一。这表明，已经进行了许多尝试来通过以下方式工程化具有降低的乙偶姻产率的酿酒酵母菌株：将碳重新定向到甘油和2,3-bdo以获得具有期望感官特征的低酒精度酵母，从而允许降低葡萄酒中的乙醇含量。wo2013076144a2涉及一种重组微生物，所述重组微生物经工程化以产生2,3-丁二醇(bdo)，其中所述微生物选自细菌或酵母并过表达至少一种编码参与将丙酮酸酯转换为2,3-丁二醇的多肽的基因。应用nadh依赖性丁二醇脱氢酶和/或nadh依赖性乙偶姻脱氢酶举例说明了六种不同的代谢途径。

10、在wo2013/076144a2中描述了2,3-丁二醇生产的许多优化。顺便作为示例，提及nadh依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶可以通过nadph依赖性酶替代。值得注意的是，在这种特定情况下，产生bdo的生物体将产生过量的nadph。有人提到，这种nadph继而可以经由同化硝酸盐还原来使用，从而需要将硝酸还原酶引入某些缺乏这种酶的酵母菌株中。

11、本领域中的进步是提供一种新颖酵母细胞，所述新颖酵母细胞适用于用于生产发酵产物(例如乙醇)的厌氧发酵方法，所述新颖酵母细胞与其对应的野生型生物体相比具有降低的甘油产量或如果将所述细胞用于乙醇的发酵制备，则所述细胞缺乏甘油产量。

12、本领域中的进一步进步是提供一种新颖酵母细胞，所述新颖酵母细胞的使用将导致在厌氧发酵方法中较少受到乳酸菌的污染。不希望受任何类型的理论的束缚，认为在酵母属酵母细胞发酵基于淀粉的原料期间，乳酸菌的污染可降低乙醇产量。

13、本领域中的进一步进步是提供一种新颖酵母细胞，所述新颖酵母细胞—当在厌氧发酵方法中使用时—导致产生酒糟副产物的具有商业意义的产量，与用其野生型对应物获得的酒糟副产物相比，所述酒糟副产物含有减少量的氨基甲酸乙酯和/或在其他方面改善的品质。

技术实现思路

1、因此，本发明提供一种酵母属酵母细胞，优选地酿酒酵母酵母细胞，所述酵母细胞包含一个或多个编码具有nadh依赖性硝酸还原酶活性的酶的核酸序列和/或一个或多个编码具有nadh依赖性亚硝酸还原酶活性的酶的核酸序列。

2、优选地，此类酵母属酵母细胞进一步包含一个或多个编码具有硝酸盐和/或亚硝酸盐转运体活性的酶的核酸序列。

3、进一步，此类酵母属酵母细胞可优选地包含黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)、一个或多个血红素辅基和/或钼辅因子(moco)、和/或一个或多个编码黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)的核酸序列、一个或多个血红素辅基、和/或钼辅因子(moco)。

4、优选地，所述酵母属酵母细胞是转基因的、重组的和/或经遗传修饰的酵母属酵母细胞。在这种情况下，上述核酸序列优选是与用于构建这种转基因、重组和/或经遗传修饰的酵母属酵母细胞的宿主细胞异源的核酸序列。

5、有利地，所述酵母属酵母细胞当在发酵方法中使用时，可产生与对应的野生型细胞相比更少的氨基甲酸乙酯。

6、有利地，所述酵母属酵母细胞当在发酵方法中使用时，可产生与对应的野生型细胞相比更少的甘油。优选地，与对应的野生型细胞相比，所述酵母属酵母细胞可不具有磷酸甘油磷酸酶活性或具有降低的磷酸甘油磷酸酶活性。更优选地，所述酵母属酵母细胞可包含在至少一个选自由gpd1、gpd2、gpp1和gpp2组成的组的基因中的基因组突变，优选地一个或多个选自由gpd1、gpd2、gpp1和gpp2组成的组的基因的缺失。

7、优选地，所述酵母属酵母细胞可以进一步包含：

8、-一个或多个编码甘油脱氢酶的核酸序列；和/或

9、-一个或多个编码二羟基丙酮激酶的核酸序列；和/或

10、-一个或多个编码甘油转运体的核酸序列。

11、此外，本发明提供了一种用于生产发酵产物的厌氧发酵方法，所述厌氧发酵方法包括使用如本文所述的酵母属酵母细胞发酵进料，所述进料包含氧化氮源和可发酵碳源。

12、优选地，可发酵碳源包含一种或多种单糖、二糖和/或多糖(例如淀粉)或由一种或多种单糖、二糖和/或多糖(例如淀粉)组成。

13、优选地，氧化氮源包含或由以下组成：

14、-硝酸、硝酸盐或硝酸根离子；和/或

15、-亚硝酸、亚硝酸盐或亚硝酸根离子。

16、方便地，所述氧化氮源可以是包含硝酸根和/或亚硝酸根与选自由铵、氨和尿素组成的组的一种或多种其他氮源的组合的组合物的一部分。

17、有利地，可以产生选自由以下组成的组的发酵产物：乙醇、正丁醇、异丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、衣康酸、马来酸、柠檬酸、己二酸。

18、此外，可以产生发酵副产物，所述发酵副产物优选地包含或由酒糟，例如具有或不具有可溶物的湿酒糟和/或干酒糟组成。此类发酵副产物，例如此类酒糟，可以有利地包含等于或小于17ng/g的氨基甲酸乙酯。

19、本发明进一步提供了一种包含酒糟的产物，所述产物是通过本文所述的发酵方法获得或可获得的。此外，本发明提供了一种包含酒糟的产物，所述产物包含等于或小于17ng/g的氨基甲酸乙酯。此类酒糟可包含或由具有或不具有可溶物的湿酒糟和/或干酒糟组成。

20、本发明进一步提供如本文所述的发酵副产物在动物饲料和/或肥料中的用途。

21、已经特别地发现了根据本发明的酵母属酵母细胞

22、有利的是可显著减少或基本上消除甘油产量和/或氨基甲酸乙酯产量，并且可增加所需产物(例如乙醇)的产量。本发明允许增加酵母属酵母细胞中的胞质nadh水平。例如，在乙醇发酵方法中，这可以有利地导致提高的乙醇产率和/或甘油形成减少。这些优点在下文中进一步详述。

23、此外，当用包含氧化氮源的进料或培养基进行发酵时，本发明允许酵母属酵母细胞相较于污染物(例如乳酸菌)具有优势。由于酵母属酵母细胞的转换氧化氮源的能力，而乳酸菌可能没有这种能力或可能具有较小程度的这种能力，因此降低了乳酸菌达到临界浓度的风险。

24、序列表的简要说明

25、本技术包含计算机可读形式的序列表，所述序列表以引用方式并入本文。下表1提供了概述：

26、表1：序列表的概述：

27、

28、

29、

30、在本专利申请的上下文中，上述蛋白质/氨基酸序列中的每一者优选地由为在酿酒酵母中表达而进行密码子对优化的dna/核酸序列编码。为了达到最佳表达，可以加入一个或多个启动子。启动子可以从强到弱调节，并且可包括tdh3、fba1、eno2、pgk1、tef1、hta1、hhf2、rpl8a、cho1、rps3、eft2、hta2、act1、pfy1、cup1、zuo1、vma6和/或anb1、hem13、yhk8、fet4、tir4、aac3中的一者或多者。